Produção de lipases por fungos filamentosos

No caso de fungos produtores de lipases, esses podem ser isolados de resíduos industriais gordurosos, de fábricas de processamento de óleos vegetais e laticínios, de solos contaminados com óleo e sementes oleaginosas. O sucesso, ou não, da seleção de microorganismos produtores depende da seleção primária, em que as culturas são

submetidas às condições altamente seletivas e que se inicia, de modo geral, em meio de cultura sólido em placa de Petri. A seleção primária, segundo STEELE & STOWERS (1991, citado por COLEN, 2006) é um processo qualitativo, no qual uma grande população de organismos é selecionada para um tipo específico de atividade. Nessa etapa, torna-se possível identificar os microorganismos capazes de produzir lipase. No caso de lipase fúngica, o crescimento abundante, a baixa atividade lipolítica e a interferência de metabólitos advindos de células mortas, em placas contendo meio de cultura com ágar grau bacteriológico, são as principais dificuldades encontradas no processo de seleção primária.

A fermentação submersa é, em geral, o passo que se segue à seleção primária para avaliar a capacidade de produção da enzima pelo microorganismo selecionado. Nessa etapa, obtem-se diversos tipos de caldos fermentados pelo mesmo microorganismo selecionado anteriormente, e pode-se comparar a quantidade de metabólito de interesse produzido. Tem-se, portanto, a noção do rendimento de produção em diferentes situações e, com isso, pode-se pode-selecionar as cepas mais promissoras (COLEN, 2006; COLEN et al., 2006).

3.4.2.2 Natureza do meio de fermentação

A evolução dos fungos superiores se deu com seu desenvolvimento em substratos sólidos, sendo terrestres durante a maior parte da história evolucionária, com apenas algumas espécies se adaptando ao meio aquoso (HOLKER et al., 2004; HASAN et al., 2006).

O cultivo do fungo em meio de cultura líquido (fermentação submersa ou fermentação em substrato líquido - FSL) torna-se menos compatível com as condições de seu habitat natural, além de o processo envolver elevados custos com aeração e poder formar espuma. Entretanto, é predominante a utilização da fermentação submersa para a produção de enzimas fúngicas em escala industrial, por ser de controle mais fácil para obtenção de rendimento satisfatório. Nos bioprocessos submersos, a célula produtora se desenvolve, sob agitação, no meio do cultivo. Encontram-se na literatura inúmeros estudos a respeito da produção de lipase extracelular por FSL (ELIBOL & OZER, 2002; TAN et al., 2003; BURKET et al., 2004; CIHANGIR & SARIKAYA, 2004; AZEREDO et al., 2007; RAJENDRAN & THANGAVELU, 2007).

De modo geral, em pesquisa de bancada, a FSL ocorre em frasco Erlenmeyer contendo o meio de cultura de composição pré-estabelecida onde é adicionada a suspensão de esporos ou suspensão de células vegetativas. Em geral, as reações ocorrem em biorreatores aerados e agitados, por tempo e temperatura determinados (BON et al., 2008b).

Passado o tempo de incubação, o conteúdo do frasco é filtrado ou centrifugado para a separação da biomassa. O conteúdo obtido como filtrado contém a enzima produzida.

Espécies fúngicas têm sido adaptadas à fermentação submersa para a produção de enzimas em escala industrial (IWASHITA, 2002; HOLKER et al., 2004; HASAN et al., 2006; AZEREDO et al. 2007; TREICHEL et al., 2010).

Embora a fermentação submersa seja, até hoje, o processo mais empregado para a produção de enzimas, a fermentação em substrato sólido (FSS) tem ganhado bastante interesse, especialmente devido à possibilidade de uso de sub-produtos agro-industriais de baixo custo como fontes de matéria-prima (AZEREDO et al., 2007; RIGO et al., 2010). A produção de lipase através de FSS também tem sido investigada por diversos pesquisadores (HOLKER et al., 2004; VARGAS et al., 2008; CONTESINI et al., 2009; RIGO et al., 2010).

A FSS ocorre em ambiente de baixa concentração de água livre, mas aproxima-se das condições ambientais às quais os fungos estão adaptados (CONTESINI et al., 2009). É uma técnica alternativa para a produção de enzimas microbianas, devido à possibilidade de uso de subprodutos agroindustriais como suporte para o crescimento do microorganismo ou como fonte de nutriente. Os substratos tradicionalmente utilizados são arroz, trigo, painço, cevada, milho e soja, e como suporte têm sido empregados a casca de arroz e o bagaço de cana.

Geralmente, o meio de cultura é adicionado ao substrato sólido contido em frasco para fermentação, assim como o inóculo. Este tipo de fermentação pode ser realizado sem agitação, com agitação ocasional ou contínua (BON et al., 2008^b). Após o período de incubação, por tempo e temperatura determinados, segue-se a extração e filtração para separação do filtrado contendo a enzima e do suporte contendo a biomassa.

Há muitas desvantagens que desencorajam o uso desse tipo de fermentação em escala industrial. Os principais entraves devem-se aos gradientes de temperatura, pH, concentração do substrato e pressão de O2, durante o cultivo, que são de difícil controle quando em condições de baixa disponibilidade de água.

Por outro lado, o processo de fermentação em substrato sólido possui vantagens biotecnológicas significativas frente à fermentação submersa: alta produtividade, baixa repressão catabólica, baixa demanda de energia, baixo custo, baixa demanda de água, necessidade de suporte sólido para cultivo do microorganismo (melhor “performance” ao crescimento), e menor preocupação com esterilidade devido à baixa atividade água do meio (HOLKER et al., 2004; VARGAS et al., 2008; CONTESINI et al., 2009). A vantagem única e exclusiva da FSS é a possibilidade do uso de culturas mistasde microorganismos, devido à capacidade de sinergismo entre várias espécies de fungos (HOLKER et al., 2004).

Contudo, tanto na fermentação em substrato sólido, quanto na fermentação submersa, outras enzimas hidrolíticas, como proteases, celulases, hemicelulases, podem ser também produzidas (PANDA & GOWRISHANKAR, 2005; VOLPATO et al., 2010).

O destino de algumas enzimas é afetado pela natureza do meio de cultivo. Na fermentação em substrato sólido, essas enzimas estão presentes no meio ou, em pequena quantidade, na parede celular, após o cultivo. Enquanto que, na fermentação submersa, uma quantidade maior da enzima pode estar na parede celular (IWASHITA, 2002).

Fungos filamentosos são os microorganismos que mais se adaptam à fermentação em estado sólido, devido à sua boa tolerância à baixa atividade de água e elevada pressão osmótica, e seu crescimento em forma de hifas (BON et al., 2008b).