População

Realizou-se um censo domiciliar em que todas as edificações (habitadas ou não) situadas na área de estudo foram localizadas (com auxílio de plantas fornecidas pelas equipes locais da Coordenação de Controle de Endemias da SESACRE) e visitadas pela equipe de campo (dois médicos, um biólogo e um auxiliar de pesquisa). Os objetivos do projeto de pesquisa foram expostos a cada família, para obtenção de consentimento informado por escrito. Realizou-se também: (a) aplicação de um amplo questionário para obtenção de dados demográficos, sócio-econômicos e de morbidade pregressa, bem como uma descrição detalhada dos domicílios, (b) exame clínico de todos os habitantes do domicílio por um médico da equipe de campo, (c) colheita de amostra sangüínea venosa de todos os habitantes do domicílio com idade igual ou superior a cinco anos e (d) determinação da localização exata do domicílio com um equipamento portátil

de navegação eTrex (Garmin International, Olathe, EUA), com precisão de 15 metros.

O censo domiciliar identificou 509 habitantes (264 do sexo masculino e 245 do sexo feminino), com idade variando entre um dia e 90 anos, distribuídos em 123 domicílios. Do total de habitantes, 399 tinham mais de cinco anos de idade e não apresentavam indícios de infecção por P. vivax (condições para que fossem considerados elegíveis para participação no estudo sorológico), destes, 376 formaram o baseline para o estudo sorológico.

Indivíduos que apresentaram malária incidente durante o estudo longitudinal desenvolvido na área, entre março de 2004 e maio de 2005, tiveram sangue venoso colhido, sempre que o paciente concordou.

Quatro grupos de amostras biológicas foram empregados para o presente estudo:

GRUPO 1: 27 amostras de sangue positivas para P. vivax, colhidas em 1999,

de indivíduos residentes nos municípios de Plácido de Castro (n=19) e Acrelândia (n=08), com idades de 3 a 51 anos.

GRUPO 2: 376 amostras de soro de indivíduos com idades variando de cinco

a 90 anos, residentes em Acrelândia, colhidas em Março/Abril de 2004 (baseline).

GRUPO 3: 70 amostras de sangue colhidas de pacientes com malária por P.

vivax incidente durante o estudo longitudinal desenvolvido na área rural de

Grupo 4: 54 amostras de soro de indivíduos com malária vivax incidente durante o estudo longitudinal.

"Pool" de 90 soros positivos para malária (de indivíduos residentes em Rondônia) da soroteca do ICB-USP e 21 soros de doadores de sangue do HEMOCENTRO de São Paulo, SP, área não endêmica de malária, foram usados como controles positivo e negativo nos ensaios de ELISA, respectivamente. Todas as amostras foram conservadas a -20º C.

Na tabela 1 apresentamos os dados demográficos (idade, sexo) e dados de exposição à malária: idade no início de exposição, tempo de residência na área endêmica, relato de malária recente, considerando como recente, episódios de malária vivax confirmados por lâminas positivas nos três postos locais de diagnóstico durante o período de janeiro de 2001 e março de 2004 e número de malárias anteriores da população estudada (n= 376).

Tabela 1 - Características demográficas e de exposição à malária dos 376 indivíduos incluídos no estudo da resposta de anticorpos residentes em Acrelândia, AC, área endêmica de malária

VARIÁVEL N

Idade (mediana) 24 anos

Sexo Homens 197

mulheres 179

Idade de início de exposição à malária (mediana) 4 anos Tempo de residência na Amazônia (mediana) 14 anos

Malária recente Sim 133 (35,4%)

2.1- Aspectos éticos da pesquisa

As amostras de sangue do grupo 1 tratam-se de amostras estocadas no Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB/USP). Foram mantidos todos os cuidados necessários em relação aos aspectos éticos da conservação e utilização de material biológico estocado, ou seja, foi garantida a preservação rigorosa do anonimato dos indivíduos originariamente envolvidos.

As amostras de sangue e soro dos grupos 2, 3 e 4 foram colhidas pela Dra. Mônica da Silva Nunes, aluna de doutorado do Prof. Dr. Marcelo Urbano Ferreira, para realização do projeto “Plasmodium vivax: estrutura populacional, dinâmica de transmissão e aquisição de imunidade em uma comunidade rural da Amazônia brasileira” (Anexo I), aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisas com Seres Humanos – ICB/USP (Anexo II). Este trabalho também recebeu aprovação das seguintes comissões: Comissão de ética em Pesquisa do IMT-SP (Anexo III), CAPPesq- HCFMUSP (Anexo IV), CIBio (anexo V). Todos os indivíduos incluídos no estudo foram informados sobre os aspectos científicos da pesquisa de forma clara e em termos simples e da necessidade de se colher sangue por punção venosa. Também foi assegurado que se algum indivíduo se recusasse a participar do estudo, não seria discriminado ou punido por parte da Instituição de Saúde. As amostras de sangue foram colhidas somente após o consentimento livre e esclarecido por escrito (Anexo VI).

2.2- Processamento das amostras sangüíneas

As amostras de soro e sangue total foram colhidas em tubos estéreis do tipo Vaccutainer seco e com EDTA respectivamente, e processadas em Acrelândia.

As lâminas com gota espessa foram preparadas segundo procedimento padrão (Trape, 1985) e examinadas pelos microscopistas do Ramal do Granada. Posteriormente as lâminas foram enviadas para revisão pelo Sr. Francisco das Chagas, consultor da OMS em Brasília.

As alíquotas de papa de hemácia foram submetidas à extração de DNA utilizando-se kit comercial (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega, IL, USA) ou método do fenol-clorofórmio.

As amostras de DNA foram testadas para a presença de DNA de plasmódios humanos e determinação da espécie através de reação em cadeia da polimerase (PCR) aninhada, desenvolvida por Kimura et al (1997) e modificada por Win et al (2002).