Produção dos antígenos recombinantes

No estudo sorológico foram empregados antígenos recombinantes derivados de regiões polimórficas da PvMSP-1, expressos durante o desenvolvimento deste trabalho e um antígeno recombinante derivado da

região C-terminal de 19 kDa da molécula (PvMSP-119), cujo fragmento foi

gentilmente cedido pelo Dr. Gerhard Wunderlich (Dept. de Parasitologia ICB/USP), motivo pelo qual sua produção não será detalhada abaixo.

3.1- Expressão de regiões polimórficas da PvMSP-1

A expressão de proteínas recombinantes em fusão com glutationa-S- transferase (GST) de variantes da PvMSP-1 encontradas na Amazônia brasileira foi realizada a partir de DNA genômico extraído de seis isolados de

P. vivax colhidos em Rondônia em 1995 e 1997 (denominados: BR07, BP1,

BP13, BP29, BP30, BP39) e do isolado Belém (colhido em Belém, Pará, em 1980) conservados a -20ºC. Estes são os únicos isolados brasileiros que tiveram a PvMSP-1 completamente seqüenciada até o início deste trabalho (Putaporntip et al., 2002). Foram amplificados e utilizados para expressão dos antígenos recombinantes os segmentos do gene que codificam três regiões variáveis da PvMSP-1: bloco 2 (altamente polimórfico), bloco 6 (essencialmente dimórfico) e bloco 10 (altamente polimórfico) (Figura 3). As seguintes versões de cada bloco (representadas na figura 4) selecionadas para expressão estão listadas abaixo:

§ Bloco 2: isolados Belém, BR07, BP13, BP29, BP30 e BP39 § Bloco 6: isolados Belém, BR07, BP1 e BP39

Ao todo foram produzidos 16 antígenos recombinantes distintos e o controle GST. Esses antígenos representam todo o repertório de seqüências conhecidas encontrado em isolados brasileiros.

A Tabela 2 apresenta as seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados para a amplificação por PCR dos segmentos de cada bloco.

Tabela 2 - Primers empregados na amplificação das regiões polimórficas (blocos 2, 6 e 10) da proteína de superfície do merozoíto de P. vivax (PvMSP-1)

REGIÃO PRIMER SEQÜÊNCIA

Bloco 2 Forward: PvF1 5’- CTCTGACAAAGAGCTGGAA -3’ Reverse: PvR9 5’- GCTCCTTCAGCACTTTCACGCG -3’

Bloco 6 Forward: PvF4 5’- TACTACTTGATGGTCCTCAAAAG -3’ Reverse: PvR6 5’- GTGCTTGTGACATGCGTA -3’

Bloco 10 Forward: PvF7 5’- CCTTAAGAATACCGAGATTTTGCTGAAG -3’ Reverse: PvR3 5’- GCGATTACTTTGTCGTAG -3’

Esta amplificação foi realizada utilizando-se o seguinte protocolo (25µl):

Mix da reação (concentração final) Programa

94° C – 5 min – 1 x 94° C – 30 seg 55° C – 1 min 72° C – 1 min 35 x 72° C – 10 min – 1 x Primer forward (0,2 µM) Primer reverse (0,2 µM) dNTP (100 µM) Tampão 10X MgCl2 (1,5 mM) Taq polimerase (1,25unidades) Amostra de DNA: 0,5 µl 4º C 8

Os produtos de PCR amplificados com os pares de primers PvF1/PvR9, PvF4/PvR6 e PvF7/PvR3 foram purificados utilizando-se o kit comercial “GFX PCR DNA and gel band purification” (Amersham-Pharmacia, NJ, EUA) e ligados ao vetor TOPO (Invitrogen, CA, EUA), seguindo as instruções do fabricante.

Transformação de bactérias competentes – Os produtos resultantes das ligações (fragmento da PvMSP-1 + plasmídeo TOPO) foram utilizados para transformar bactérias competentes Escherichia coli da linhagem DH10B, em incubação em gelo por 30 min seguida de choque térmico de 45 seg em bloco térmico a 42° C, seguido por 30 min de recuperação das bactérias em meio SOC a 37° C.

Crescimento e seleção das colônias – As bactérias transformadas foram semeadas em placas de Petri com meio LB-ágar contendo 100µg/mL de ampicilina e 20µL de IPTG-Xgal (IPTG: isopropil-1-tio-ß-D-galactopiranosida; Xgal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactosídeo). As placas foram incubadas a 37° C por um período de 8-12 horas. Colônias resistentes à ampicilina possuem o plasmídeo, mas somente as colônias brancas apresentam plasmídeos com inserto, capaz de interromper o gene de ß- galactosidase do plasmídeo. As colônias azuis indicam que o plasmídeo não incorporou o inserto de DNA. A seguir, os plasmídeos com inserto foram obtidos de acordo com o protocolo de triagem em pequena escala descrito por Sambrook et al (1989).

Ligação ao vetor de expressão – Plasmídeos PCR-TOPO contendo os insertos correspondentes aos blocos 2, 6 e 10 foram primeiramente

digeridos com a enzima de restrição EcoRI (Fermentas, ON, Canadá) em incubação à 37° C por 2 horas. O produto da digestão foi submetido à eletroforese de gel TAE-agarose 1,5%e os fragmentos correspondentes aos blocos variáveis foram excisados e purificados utilizando-se o kit comercial “GFX PCR DNA and gel band purification” (Amersham-Pharmacia, NJ, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos dos blocos 2 e 10 foram ligados ao vetor de expressão pGEX3X (Amersham-Pharmacia, NJ, EUA), enquanto os fragmentos correspondentes ao bloco 6 foram ligados ao vetor de expressão pGEX3Y (pGEX3X modificado). A ligação foi efetuada com a enzima T4-Ligase (Amersham-Pharmacia, NJ, EUA) em incubação de 30 min a 20° C. Após a incubação, 1 µl do ensaio de ligação (vetor pGEX3X/3Y + fragmento dos blocos repetitivos 2, 6 e 10) foi utilizado para transformar 25 µL de bactérias competentes E. coli da linhagem DH10B como descrito anteriormente. A orientação do inserto foi verificada por PCR utilizando-se um primer forward (pGEX seq) da região codificadora para GST (a extremidade 5’ do inserto) com o primer reverse correspondente a cada bloco (Tabela 1) com o seguinte protocolo (volume final de 15 µL):

Mix da reação (concentração final) Programa

94° C – 40 seg 55° C – 40 seg 72° C – 40 seg

25 x

72° C – 10 min – 1 x

Primer pGEX seq (0,3 µM) Primer reverse (0,3 µM)

dNTP (250 µM) Tampão 10X MgCl2 (1,5 mM)

Taq polimerase (0,4 unidades)

Amostra: 1 µL

Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de TAE- agarose 1,5% para verificar a presença de banda no gel (correspondente ao inserto na orientação correta). As colônias com inserto em orientação correta foram selecionadas para expressar as proteínas recombinantes, seguindo o protocolo de produção de proteínas recombinantes com fusão GST (glutationa-S-transferase).

A expressão das proteínas recombinantes foi iniciada cultivando-se uma colônia transformante em 5 mL de meio LB com ampicilina (100µg/mL) a 37o C sob agitação por 8-12 horas. Posteriormente, 3 mL desse pré- inóculo foram adicionados em 100 mL de meio 2YT com ampicilina (100µg/mL) e mantidos a 37° C sob agitação até obter-se uma absorbância de A600 = 0,6 (aproximadamente 2 horas). À essa cultura adicionou-se 0,3

mMde IPTG e manteve-se a 37° C sob agitação por três horas.

3.2- Purificação das proteínas recombinantes

Para purificar as proteínas recombinantes, a cultura foi centrifugada a 25 x g por 10 min a 4° C. O sedimento foi dissolvido em 2 mL de Triton X100 a 0,5% em solução salina tamponada (PBS) 0,01M, pH7,2. Acrescentou-se 200µg/mL de lisozima e 0,1M de PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) e manteve-se sob leve agitação por 5 min em temperatura ambiente. Foram realizados cinco ciclos de congelamento e descongelamento utilizando N2

realizada passando-se a suspensão 10 vezes por seringa com agulha de calibre 25 G. O sobrenadante foi separado por centrifugação a 25 x g por 15 min a 4° C.

Ao sobrenadante foram adicionados 200 µL de glutationa-sepharose (Amersham-Pharmacia, NJ, EUA) previamente lavada em PBS. Realizou-se incubação em temperatura ambiente por 1 hora sob leve agitação. A suspensão foi lavada com 2 mL de PBS por três vezes. Ao precipitado foram adicionados 750 µL de solução de eluição (TrisHCl 0,1 M, pH 8,0, NaCl 0,12M, glutationa 10 mM) e manteve-se sob leve agitação por 45 min em temperatura ambiente. O novo sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 80 x g de 1 min.

Para completar o processo de purificação, as proteínas recombinantes foram dialisadas contra um grande volume de PBS (2000mL), a 4ºC por 18 horas. As proteínas foram quantificadas utilizando-se o método de Bradford (1976).

3.3- SDS-PAGE

SDS-PAGE – A pureza das proteínas recombinantes foi testada realizando- se eletroforese de 15 µL de cada proteína em gel de poliacrilamida 4,5% (stacking gel) e 12% (running gel) na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,1% em condições desnaturantes (Laemli, 1970). As proteínas foram aplicadas no gel com tampão de amostra (TrisHCl 0,01 M, pH 6,8; SDS 1%,

glicerol 10%, azul de bromofenol 0,06%) após desnaturação por aquecimento em bloco térmico à 95º C por 5 min. A eletroforese foi realizada sob corrente constante de 120 V até que a coloração do azul de bromofenol atingisse a extremidade inferior do gel.

Após a eletroforese, o gel foi corado por solução de azul de Comassie (Comassie blue 0,3%, ácido acético glacial 7%, metanol 40%, água destilada) sob agitação por 10 minutos. O excesso de corante foi retirado por solução descorante (ácido acético glacial 7,5%, metanol 5%, água destilada) sob agitação.

3.4- Immunoblotting

Immunoblotting – O reconhecimento desses antígenos recombinantes por

anticorpos de indivíduos naturalmente expostos a P. vivax foi testado por “Immunoblotting". (Towbin et al., 1979). Com esta finalidade, as proteínas separadas por eletroforese foram transferidas eletroforeticamente para membranas de nitrocelulose (Hybond C, Pharmacia, NJ, EUA), por 90 min sob corrente constante de 250 mA. Após a transferência, a membrana foi corada por 5 min com Ponceau 0,2% em ácido acético 1%.

Bloqueio – Posteriormente à coloração, a membrana foi cortada verticalmente em fitas (duas fitas para cada antígeno) e cada fita foi incubada sob leve agitação por 1 h em temperatura ambiente em leite

desnatado a 5% em PBS contendo Tween 20 a 0,1%. Realizou-se então duas lavagens com PBS-Tween-0,1%.

Reação – A primeira fita de cada antígeno foi incubada em temperatura ambiente com pool de soros positivos de pacientes com malária vivax, diluído a 1/100 em leite desnatado a 1% em PBS-Tween-0,1% sob leve agitação por 1 h. A segunda fita de cada antígeno foi incubada com soro negativo sob as mesmas condições. Seguiu-se nova etapa de lavagem. Conjugado – A fitas foram incubadas, sob leve agitação, por 1 h em temperatura ambiente, com anticorpo de carneiro anti-IgG humano marcado com peroxidase (Amersham-Pharmacia, NJ, EUA) diluída a 1/1500 em leite desnatado a 1% em PBS-Tween-0,1%. Seguiu-se nova etapa de lavagem. Revelação – As fitas foram reveladas com ECL – Western blotting detection reagents (Amersham, Pharmacia, NJ, EUA) e expostas ao filme Hyperfilm (Pharmacia, Pharmacia, NJ, EUA), seguindo as instruções do fabricante.

4- Análise do reconhecimento de regiões variáveis da PvMSP-1 por