POTENCIAL ZETA

A figura 22 indica o potencial zeta dos cristais formados na presença dos polissacarídeos. Pode-se observar que na presença de qualquer quitosana o potencial zeta das moléculas aumentou quanto comparado com a condição controle. Significativamente não houve diferença entre o potencial zeta encontrado na

58 presença da quitosana e na presença de Chit-Gal2 e Chit-Gal3, apesar de os valores observados em Chit-Gal2 e Chit-Gal3 serem menores do que os observados com a quitosana. Já em Chit-Gal1 e Chit-Gal4 os valores do potencial zeta são os que menos interferiram no potencial zeta dos cristais quando comparados com o controle, as análises estatísticas demonstram que não há diferença estatística entre eles e o controle. Contr ol Chito san Chit- Gal1 Chit- Gal2 Chit- Gal3 Chit- Gal4 0 10 20 30

a

b

a

a

a,b

a,b

Figura 22 – Potencial zeta dos cristais formados na presença dos diferentes quitosans. Letras diferentes indicam diferença significativa (p <0,05).

4 DISCUSSÃO

A quitosana utilizada neste trabalho foi adquirida comercialmente, e como os resultados obtidos com relação aos testes de formação de cristais seriam inéditos, era crucial que se tivesse certeza que o efeito observado não era decorrente da presença de contaminantes encontrados neste produto comercial. Os dados obtidos tanto na FTIR, quanto na H1RMN, confirmaram que o produto adquirido comercialmente era constituído essencialmente de quitosana, já que os sinais encontrados nos espectros dessas análises são aqueles esperados para moléculas de quitosana (VINO, et. al., 2012; SONG, et. al., 2013; CZECHOWSKA-BISKUP, et. al., 2012; LAVERTU, et. al., 2003). Além disso, não foram encontrados sinais que indicassem a contaminação por proteínas (BARTH, 2007; KAINOSHO, et. al., 2006), outros polissacarídeos (COSTA, et. al., 2012) e polifenóis (LIU, et. al., 2013).

Diante da comprovação da identidade da quitosana, ela foi então utilizada nos testes seguintes. Para se avaliar a atividade antioxidante da quitosana realizaram-se cinco testes que possibilitam verificar ação do composto nos três diferentes estágios da cadeia de formação de espécies reativas: iniciação (CAT e poder redutor); propagação (quelação de ferro e de cobre); terminação (sequestro de hidroxila).

No teste do poder redutor a quitosana apresentou uma atividade máxima na concentração de 1 mg/mL que correspondeu a 34% da atividade de 0,1 mg/mL de vitamina C. Este valor apesar de ser baixo se assemelhou ao encontrado por vários autores quando trabalharam com outras moléculas de quitosana (VINO, et. al., 2012; PRABU e NATARAJAN, 2012; KUPPUSAMY e KARUPPAIAH, 2013), o que indica que a capacidade de doar elétrons da quitosana nas condições físico-químicas do teste utilizado são baixas. Contudo, vale salientar que outros polissacarídeos também têm esta baixa capacidade, como fucanas sulfatadas da alga Spatoglossum schröederi e galactanas sulfatadas das algas Caulerpa cupressoides, Caulerpa prolifera e Gracilaria caudata (COSTA, et. al., 2010) que apresentaram atividade semelhante à observada pela quitosana aqui avaliada.

A capacidade de doar elétrons da quitosana também foi investigada pelo teste do CAT. Neste teste 1 g de quitosana apresentou uma atividade equivalente a 30 µg de Vit C, ou seja, 30 EAA/grama de polissacarídeo. Não foram encontrados artigos que avaliaram a atividade doadora de elétrons da quitosana por esse teste, entretanto CAT é um teste comum para avaliar a atividade antioxidante de diversas

60 moléculas, inclusive polissacarídeos, como os polissacarídeos sulfatados estudados por COSTA e colaboradores (2012), que trabalhando com polissacarídeos sulfatados da alga Caulerpa cupressoides encontraram resultados que variaram entre 10 _{– 20 mg de EAA/grama de polissacarídeo. Já no trabalho de MELO-} SILVEIRA e colaboradores (2012), foi demonstrados que polissacarídeos neutros ricos em xilose (xilanas) apresentaram atividade, em torno de 48 mg de EAA/g de amostra. Nesses dois trabalhos a CAT apresentado por esses polissacarídeos foi considerada baixa, o que leva a conclusão que a atividade observada com a quitosana também é baixa.

O teste de CAT foi realizado em condições físico-químicas diferentes daquelas observadas no teste do poder redutor e mesmo assim este polissacarídeo apresentou baixa atividade. Os dados obtidos com os dois testes levam a proposição de que a propriedade de doar elétrons não é o principal mecanismo de ação antioxidante da molécula de quitosan aqui avaliada.

A capacidade de quelar íons metálicos foi medida na presença de Ferro e de Cobre. Com a quitosana comercial não foi observado atividade deste composto para o teste de quelação de ferro. Este fato foi curioso, pois trabalhos mostram que quitosanas possuem potencial para quelar ferro. Porém a atividade das moléculas de quitosana nunca ultrapassa 35%, isso quando foi avaliada pelo mesmo teste que foi utilizado nesta dissertação (PRABU e NATARAJAN, 2012; CHIEN, et. al., 2007; XING, et. al., 2005). Portanto, decidiu-se avaliar a atividade quelante de ferro da quitosana empregando-se outro teste, que segundo análise da literatura, é um método muito utilizado para se verificar a atividade quelante de moléculas de quitosana. Porém, mesmo assim, a quitosana comercial utilizada nesta dissertação não apresentou atividade quelante de ferro.

A atividade quelante de ferro da quitosana é muito bem relatada pela literatura, e como descrito na introdução deste trabalho, sofre forte influência tanto do tamanho da molécula quanto do seu grau de desacetilação (CHIEN, et. al., 2007; XING, et. al., 2005; PARK, et. al., 2004). A quitosana utilizada nesta dissertação tem uma massa molecular de 58 kDa, portanto, é considerada uma quitosana de baixo massa molecular, o que segundo a literatura seria o fator importante para que ela apresentasse atividade quelante de ferro. Porém, para que uma quitosana apresente boa atividade quelante de ferro seria necessário que ela também tivesse um elevado grau de desacetilação, algo maior que 90%, o que não acontece com a molécula

usada nesta dissertação. Seu grau de desacetilação é de 76%. Portanto, acredita-se que esse foi o fator primordial que fez com que a amostra de quitosana aqui avaliada não apresentasse atividade quelante de ferro. Pretende-se posteriormente desacetilar a amostra e confirmar esta hipótese.

Por outro lado, a atividade quelante de cobre da quitosana foi expressiva, pois com apenas 0,5 mg/mL já se obteve uma atividade na casa dos 90% de quelação, e com 1 mg/mL atingiu-se 100% de quelação desse metal. Só foi possível identificar um único artigo que utilizou o teste de quelação de cobre para avaliar a atividade antioxidante de moléculas de quitosana (LIN e CHOU, 2004). Nesse trabalho Lin e Chou (2004) analisaram atividades antioxidantes de quitosanas com 99% de desacetilação, que foram conjugadas a dissacarídeos. Nenhuma das quitosanas testadas apresentou, mesmo em altas concentrações (4 mg/mL), atividade superior a 60% de quelação de cobre. No entanto, a capacidade da quitosana em interagir com íons de cobre é muito bem relatada pela literatura. Porém, nos trabalhos que a relatam não há a denominação “quelação de cobre” e sim outros termos. É possível identificar artigos que usam moléculas de quitosana para aprisionar íons de cobre e assim predizer se estas moléculas poderiam fazer parte da constituição de filtros, que por sua vez, poderiam ser utilizados como removedores desse metal em soluções aquosas (MONTEIRO JR. e AIRODE, 1999). Foram encontrados também trabalhos que mostram aplicações mais complexas para compostos formados de quitosana e cobre, como por exemplo, foi demonstrado que ao se misturar a quitosana com íons de cobre havia a formação espontânea de uma malha, que depois de ser liofilizada e reidratada assumia a consistência de um gel. Este material ao ser utilizado em animais como um arcabouço para regeneração óssea era capaz de melhorar essa regeneração (_{D’MELLO, et. al., 2014). Em todos os casos a} interação cobre-quitosana se dá pela presença dos grupamentos amina livres na estrutura desse polissacarídeo. Além disso, Monteiro Jr. e Airolde (2004) mostram que o grau de desacetilação das quitosanas na casa de 75% já é suficiente para que haja uma boa interação do polissacarídeo com o cobre, o que justifica a atividade quelante de cobre da quitosana testada aqui neste trabalho.

Quando se avaliou o sequestro de radical hidroxila na presença da quitosana, nenhuma atividade foi observada. Ao se verificar a literatura, vê-se diversos relatos de quitosana com atividades nesse teste (VINO, et. al., 2012; XING, et. al., 2004; LIN e CHOU, 2004; RAJALAKSHMI, KRITHIGA e JAYACHITRA, 2013). Porém, o

62 método comumente utilizado é o da desoxirribose, que difere do método utilizado neste trabalho. Para explicar a atividade de sequestro de radical hidroxila tem sido proposto que, como em outros testes antioxidantes, a combinação do grau de desacetilação e da massa molecular da quitosana é um fator importante para que se identifique a atividade sequestradora de radical hidroxila em moléculas desse polissacarídeo. Por exemplo, Xing e colaboradores (2004) mostraram que quitosanas com grau de desacetilação em torno de 87% possuem baixa atividade de sequestro de radical hidroxila e que a massa molecular dessas quitosanas desempenha um papel importante nessa atividade. Quitosanas com alta massa molecular (760 kDa) não apresentaram atividade significativa no teste, enquanto quitosanas com massa molecular média (120 e 60 kDa) apresentam atividade baixa (0% e 30% a 1,5 mg/mL respectivamente), já aquelas de massa molecular muito mais baixa do que as anteriores (20 e 9 kDa) apresentaram atividade sequestradora superior (50% de quelação a 1,5 mg/mL para ambas). Nesse caso foi observado que, quanto menor foi a quitosana utilizada maior foi a atividade observada, demonstrando o papel importante que essa propriedade desempenha nesse teste. A quitosana utilizada aqui nesse trabalho com 58 kDa e 75 % de DD, possui uma combinação de fatores que justificam não ter sido observada atividade sequestradora de radicais hidroxila para essa molécula.

Dentre as atividades antioxidantes avaliadas da quitosana a mais pronunciada foi a quelação de cobre. Esta atividade é importante, pois indiretamente leva a uma menor formação de radicais hidroxilas. Estes radicais são um dos principais agentes responsáveis pela peroxidação lipídica, evento que está envolvido com o surgimento/manutenção/propagação de diversos danos nos mais variados órgãos (NEGRE-SALVAYRE, et. al., 2010). No caso dos rins, a peroxidação lipídica na membrana plasmática das células endoteliais desse órgão leva ao surgimento de regiões, no lado extracelular da membrana, com composição diferente, estas regiões permitem a adesão de cristais de oxalato de cálcio nascentes, que, por conseguinte, são efetores importantes para a formação de cálculos renais (SELVAM, 2002). Além disso, os radicais livres ao provocarem dano celular, induzem a formação de novos cristais OxCa, que por sua vez induzem a formação de mais radicais livres, o que promove a formação de mais cristais e consequentemente aumenta o dano tecidual (THAMILSELVAN, et. al., 1997). Portanto, uma molécula com capacidades antioxidantes pode prevenir a formação de cristais e consequente dano renal

(HOLOCH E TRACY, 2011; DAVALOS, et. al., 2010). Além disso, moléculas, além de serem antioxidantes, podem atuar também inibindo diretamente a formação de cristais OxCa. Tendo isso em mente, avaliou-se também o efeito da quitosana na formação de cristais de OxCa in vitro, a fim de se verificar se essa molécula poderia ser apontada como um possível inibidor direto da formação de cálculos renais.

No ensaio de formação de cristais in vitro pôde-se observar que em todas as condições utilizadas houve um aumento da turbidez da solução, comprovado pelo aumento da absorbância da solução em torno de 12 vezes (Fig. 10). Outra propriedade observada foi o desaparecimento, no tempo avaliado, da fase de precipitação em comparação com a condição controle. A análise da morfologia dos cristais ajudou a entender o que ocorreu nesse teste: O aumento de 12 vezes na absorbância medida é compatível com o aumento de 18 vezes na quantidade de cristais observada por campo em comparação com o grupo controle (Fig. 11), indicando que a alteração da turbidez se deu pela formação de novos cristais. Já o fato de não se ter observado a fase de precipitação pode ser explicado pelo tamanho dos cristais formados na presença da quitosana, que foram cerca de 40% menores que aqueles observados no grupo controle (Fig 11C). Ou seja, cristais menores demoram mais a se precipitar.

Uma análise do potencial zeta dos cristais trouxe mais informações referentes a influência da quitosana na formação desses cristais. Quando este parâmetro foi analisado observou-se que na presença do polissacarídeo, o potencial zeta dos cristais formados era muito mais positivo do que aquele observado no grupo controle (Fig. 12). O aumento expressivo no potencial zeta dos cristais é um indicativo que a quitosana está interagindo com os cristais, já que esse polímero é carregado positivamente nas condições do teste.

A formação dos cristais é espontânea, e ocorre a partir da aproximação de íons compatíveis, esses íons vão se agregando, formando estruturas cristalinas organizadas (QIU et. al., 2003), essas nanoestruturas nascentes, tendem a se atrair, fazendo com o que crescimento desses cristais ocorra não apenas através do recrutamento de íons da solução, mas também da agregação e organização desses nanocristais em formação. As forças de interação que regem esses eventos estão principalmente relacionadas com as interações entre as cargas dos íons que estruturam as faces do cristal (BANFIELD, et. al., 2000; PRIVMAN, et. al., 1998).

64 A literatura mostra que macromoléculas negativamente carregadas tendem a se associar por atração eletrostática as porções carregadas dos cristais de OxCa em formação, alterando seu padrão de crescimento (GROHE, et. al., 2009). Contudo, não há uma explicação plausível de como ocorre o processo de modificação estrutural dos cristais na presença dessas macromoléculas (GUL e REZ, 2007). Por outro lado, nenhum estudo com moléculas positivamente carregadas e interação dessas moléculas com cristais de OxCa foi encontrado. Porém, Gul e Rez (2007) citam que é esperado que esse tipo de molécula seja eletrostaticamente atraído pela porção mais negativa do cristal (carboxilas do oxalato) e isso provavelmente também interferiria na formação dele. A quitosana possui grupamentos amina, que no pH do teste realizado nessa dissertação (semelhante ao pH urinário) estão protonados e por isso carregados positivamente. Portanto, diante dos dados obtidos, propõe-se que a quitosana interage com a porção negativa do cristal durante seu crescimento, dessa forma criando uma região positivamente carregada, alterando assim o equilíbrio eletrostático de cargas do cristal e consequentemente, alterando o seu crescimento, fazendo com que os cristais formados sejam menores do que aqueles obtidos nas condições controle.

Os cristais observados na análise morfológica foram menores que os observados no controle, além disso, o número de cristais observados por campo também aumentou significativamente. O tamanho menor que os cristais adquirem na presença da quitosana indica que houve um menor consumo de íons utilizados na formação de cada cristal. Assim, haveria uma maior disponibilidade dos íons para formação de novos cristais. O que explicaria esse maior número de cristais formados.

Além da alteração na quantidade de cristais, a presença de quitosana também alterou a proporção existente entre os cristais COM e COD. Vários trabalhos na literatura mostram que macromoléculas negativamente carregadas ao se associar com os cristais tendem a estabilizar os cristais tipo COD, impedindo que estes se convertam em COM (WESSON, SORCESTER e KLEINMAN 2000; GROHE, et. al., 2009). Porém, não há dados na literatura referentes à interação entre moléculas positivamente carregadas e cristais de OxCa em formação, o que dificulta a proposição de um mecanismo pelo qual a quitosana estaria agindo para que se tivesse uma aumento no número de cristais tipo COM. Espera-se que no

futuro novos dados surjam para que se tenha embasamento que leve a proposição de uma hipótese que justifique o evento aqui observado.

A morfologia dos COM formados na presença da quitosana difere daquela do controle. Diversas teorias tentam explicar a disposição dos íons de oxalato e de cálcio que leva a formação da estrutura geométrica monoclínica do cristal tipo COM (GUL e REZ, 2007; QUI, et. al., 2003). Dentre elas, uma proposta que combinou análises laboratoriais e análises in silico trouxe a luz novos fatores que explicariam a interferência de moléculas simples como citrato e complexas como polímeros na morfologia de cristais de OxCa (QUI, et. al., 2003). É importante lembrar que um cristal COM é formado por três faces e que a disposição das cargas negativas e positivas diferem em cada uma dessas faces, o que permite uma maior ou menor interação de moléculas carregadas como a quitosana com essas faces. Na face (101) os íons de cálcio estão mais expostos que em outras faces, que deixa essa face com caráter positivo, o que dificulta a interação da quitosana com essa face. Por outro lado a face (010) expõe uma maior quantidade de cargas negativas do oxalato, dessa forma facilitando a interação da quitosana com essa face. E a face 120 possui uma característica mista e é a fase de crescimento mais rápido (TALLER, et. al., 2007). Todavia, a interação de macromoléculas, como a quitosana, com um cristal não é só resultado de uma interação de cargas, há também o elemento topográfico. Segundo Qui e colaboradores (2003) o crescimento da face (101), devido a disposição dos íons de oxalato e cálcio, ocorre na forma de degraus simples, com uma altura média de 6 Å, disposição essa que dificulta a interação de moléculas grandes, como a quitosana, com a face 101. Por outro lado, na face (010) os degraus tendem a ser estreitos e se sobrepõe, formando um complexo quádruplo, com aproximadamente 16 Å, criando um sítio que permite uma melhor interação de moléculas grandes, como a quitosana, com essa face (DE YOREO, QIU e HOYER, 2006).

Portanto propõe-se que ao se associar com a face (010) a quitosana diminuiu a cinética de crescimento dessa face, o que consequentemente, modifica a cinética de crescimento de outra face do cristal (face 101). Estes eventos levam então a um menor crescimento do cristal. Contudo, a quitosana não interagiria tão bem com a face 120, e o crescimento dessa não seria tão influenciado pela cinética de crescimento da face 010. Portanto, esta continuaria crescendo numa velocidade maior que as demais faces, deixando assim os cristais formados mais “pontudos”, ou

66 seja, com as extremidades mais proeminentes (pontiagudas) (Fig. 11B), o que justificaria a forma da maioria dos cristais COM formados na presença da quitosana e observadas por microscopia: cristais mais esferoidais ou ovais. Resultados semelhantes foram descritos por MILLAN (2000). Neste trabalho foi mostrado que cristais COM quando formados na presença de mucoproteínas assumiam um formato oval, devido a interação dessas mucoproteínas com as faces do cristal.

A molécula de quitosana aqui avaliada apresentou atividade antioxidante, característica que se procura em agentes que possam ser usados no combate a urolitíase. Por outro lado, identificou-se que ela, pelo menos in vitro, favorece a formação de cristais tipo COM, um dos principais causadores da formação de cálculos renais. Assim, buscou-se modificar quimicamente a molécula de quitosana utilizada nesta dissertação com intuito, pelo menos, de diminuir o seu efeito sobre a formação de cristais de OxCa e manter sua atividade antioxidante.

Uma metodologia bastante aceita (por ser de fácil execução e por não gerar uma grande quantidade de resíduos tóxicos) tem sido a conjugação de quitosanas com ácido gálico em um meio rico em radicais livres (CURCIO, et. al., 2009). Essa metodologia utiliza radicais livres para criar pontos de inserção para a molécula do AG na estrutura da quitosana como ilustra a figura 7.

Com intuito de se determinar a melhor condição de conjugação da quitosana com ácido gálico utilizou-se quatro proporções de AG/Quitosana diferentes durante o processo de conjugação. Porém, uma análise dos dados quantitativos leva a observação de que a conjugação ocorreu, mas esta não foi dose dependente. Na verdade não houve uma diferença na quantidade de AG incorporada à molécula de quitosana. Independente da massa de AG utilizada na conjugação obteve-se cerca de 10 mg de AG/g de quitosana, que foi um valor maior que o obtido por Curcio e colaboradores (2009), que só conseguiu 7 mg AG/g de quitosana.

Considerando a estrutura da quitosana e a literatura, pode-se inferir que cada resíduo de glucosamina tem três sítios de ligação disponíveis para o AG, sendo os 2 principais a hidroxila do carbono 6 e o NH2 do C2, e o sítio com menor disponibilidade seria a OH do carbono 3 (figura 7). A presença do grupo acetil nos resíduos de N-acetil-glucasamina cria um impedimento estérico no NH e impede a entrada do AG, ou seja, o grau de desacetilação interfere na quantidade de AG incorporado (CHO, et. al., 2011; LIU, et. al., 2013). Portanto, o grau de desacetilação

possui um papel fundamental na conjugação, já que os resíduos desacetilados possuem um maior número de sítios para ligação do AG.

Outro fator que pode ser relevante é que o processo de conjugação pode sofrer interferência de fatores estéricos. A entrada das primeiras moléculas de ácido gálico deve dificultar a conjugação de novas moléculas de AG na mesma cadeia de quitosan, e que, portanto, mesmo utilizando quantidade maiores de AG o percentual de conjugação não aumenta, o que explicaria o fato de mesmo utilizando 10X mais moléculas de AG não se conseguiu um percentual maior de conjugação na molécula de quitosan. Os resultados demonstrados por Cho e colaboradores (2011), também corroboram com esse fato. Já que, utilizando metodologia semelhante à utilizada aqui nesta dissertação, esses autores observaram que a quantidade de AG