Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos

A análise por cromatografia em fase gasosa dos ácidos graxos, livres ou ligados aos diferentes componentes lipídicos dos alimentos, requer sua prévia transformação em derivados mais voláteis e, normalmente, são preparados ésteres metílicos de ácidos graxos. Dependendo da aplicação, outros ésteres menos voláteis podem ser preparados como o etílico, butírico e isopropílico. São descritos muitos procedimentos e cada método possui vantagens e limitações, dependendo das características da gordura a ser analisada (Adrian et al., 2000; Christie, 1993).

As reações de derivação são geralmente catalisadas por ácidos ou bases, e envolvem dois processos: hidrólise e esterificação (normalmente metilação) ou transesterificação. Os ésteres metílicos se formam a partir de:

1. Ácidos graxos livres em meio ácido ou com diazometano (esterificação).

2. Ácidos graxos ligados a lipídios por ligações ésteres, (triacilgliceróis, fosfolipídios) em meio ácido ou básico.

3. Ácidos graxos ligados a grupamento N-acila em lipídios complexos em meio ácido.

O Esquema 1 apresenta uma reação de esterificação em meio ácido. São empregados catalisadores, como trifluoreto de Boro (BF3), para que a esterificação ocorra rapidamente. Cada passo da reação é reversível, mas com excesso de álcool o equilíbrio é deslocado e a reação pode ser considerada completa. Entretanto, na presença de água, que é um doador de elétrons mais forte que o álcool, a formação do intermediário 2 não é favorecida e a esterificação não ocorre completamente.

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Com o intuito de abreviar o tempo de reação, pode ser feita uma transesterificação direta (alcoólise ou metanólise) dos lipídios com um único reagente. A reação ocorre, por exemplo, para ácidos graxos ligados aos lipídios por ligação éster, isto é, triacilgliceróis e fosfolipídios. Nesta reação, um dos álcoois da molécula, por exemplo o glicerol do triacilglicerol, é substituído por outro, normalmente metanol.

Esquema 2. Transesterificação dos lipídios com catálise ácida.

A transesterificação ocorre com refluxo e na presença de catalisadores ácidos (HCl, H2 SO4 , BF3) (Esquema 2) ou básicos (NaOH, KOH, metóxido de sódio) (Esquema 3). No esquema 2 todos os passos são reversíveis e novamente na presença de excesso de álcool o equilíbrio é deslocado para a formação do novo éster. A água provoca hidrólise e dissociação do intermediário 4 .

Esquema 3. Transesterificação dos lipídios em meio alcalino.

A transesterificação em meio básico (Esquema 3) ocorre em condições de temperatura mais amenas e tempo reduzido. Entretanto, os ácidos graxos livres não são suscetíveis ao ataque nucleofílico de álcoois ou bases e, portanto não

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ocorre a esterificação em condições de catálise básica. A reação de transesterificação ocorre satisfatoriamente com excesso de álcool e na ausência de água. O emprego de KOH metanólico não é recomendado devido a ocorrência de hidrólise e formação de ácido graxo livre. Este hidróxido é substituído, com vantagem, por alcoolatos formados pela reação de metal alcalino como sódio ou potássio e álcool (Ex: metóxido de sódio) (Bobbio e Bobbio, 2003; Christie, 1993). Os ácidos graxos ligados a grupamento N-acila em lipídios complexos também formam ésteres metílicos em meio ácido (Esquema 4).

_H+

R’-CO-NHR” + CH3 -OH R’ -CO-OCH3 + R” – NH2

Esquema 4. Esterificação de ácidos graxos ligados a grupamentos N-acila.

Os métodos mais eficientes empregam os dois tratamentos, ácido e básico. Em meio ácido pode ocorrer isomerização de ácidos graxos insaturados, principalmente os conjugados, quebra de grupamentos reativos como os grupos ciclopropenídicos, além dos processos em meio ácido necessitarem de aquecimento, o que pode comprometer os ácidos graxos de baixo peso molecular presentes em quantidades significativas, por exemplo, na gordura do leite. Por outro lado, a transesterificação em meio básico pode levar à saponificação de ácidos graxos de baixo peso molecular (Christie, 1993; Christopherson e Glass, 1969; Kramer et al., 1997). A transesterificação alcalina, entretanto, tem sido empregada para a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos em gordura de leite e margarina, produtos ricos em ácidos graxos saturados voláteis e de baixo peso molecular (Kramer et al., 1997), na preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos ciclopropenídicos que são grupamentos altamente lábeis (Aued-Pimentel et al., 2004), em óleos vegetais refinados (Ratnayake, 2004) e também na análise de produtos alimentícios diversos, mostrando resultados comparáveis a procedimentos com catálise mista (Aued-Pimentel et al., 2005).

A Tabela 8 apresenta os principais reagentes utilizados para preparação dos ésteres metílicos de ácidos graxos, suas vantagens e limitações.

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Tabela 8. Principais reagentes para preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos, vantagens e limitações.

Reagente ^{Tipo de} catalisador Grupos de moléculas esterificadas Vantagens Limitações 5% HCl anidro (gasoso) em metanol (formação de cloreto de hidrogênio) Ácido

Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou

colesterol

Reagente eficiente na esterificação.

Não derivam todos os componentes da gordura ligados aos ácidos graxos como as amidas

Tempo longo de reação e aquecimento

Destrói grupos funcionais ligados aos ácidos graxos tais como: epóxi, ciclopropano e ciclopropeno

NaOH 0,5N/ NH4Cl/ metanol/H2SO4 (formação de

cloreto de hidrogênio)

Ácido/Básico

Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou

colesterol

Procedimento rápido e simples Tempo e temperatura reduzidos

Não derivam todos os componentes da gordura ligados aos ácidos graxos

Destrói grupos funcionais ligados aos ácidos graxos tais como: epóxi, ciclopropano e ciclopropeno

Metanol + H2SO4 (1-2%) Ácido ^{Ácidos graxos livres ou} ligados ao glicerol ou

colesterol

Reagente barato e eficiente na esterificação

Tempo longo de reação e aquecimento. Pode alterar os ácidos graxos polinsaturados

Destrói grupos funcionais ligados aos ácidos graxos tais como: epóxi, ciclopropano e ciclopropeno

Trifluoreto de boro BF3 em metanol (7% -14%) + NaOH metanólico 0,5N Ácido/Básico

Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou

colesterol

Método Oficial AOAC AOCS

Reagente instável.

Não promove a derivação de todos os componentes da gordura ligados aos ácidos graxos

Formação de produtos secundários Tempo longo de reação e aquecimento

KOH metanólico 2M ^Básica

Transesterificação

Ácidos graxos ligados ao glicerol

Reação rápida e a frio Preserva AG de baixo peso molecular,

polinsaturados, cíclicos e conjugados

Saponificação de ácidos graxos de baixo peso molecular Não se aplica a ácidos graxos livres

Não recomendado na preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir de óleos com acidez acima de 2,0%

Metóxido de sódio (NaOCH3)

Básica Transesterificação

Ácidos graxos ligados ao glicerol, esteróis

Preserva AG de baixo peso molecular, Polinsaturados, cíclicos e

conjugados

Não se aplica a ácidos graxos livres e ligados a amidas (esfingolipídios). Não recomendado na preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir de gorduras com acidez acima de 2,0%

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Na literatura, são descritos procedimentos de transesterificação direta (“in situ”) sem extração prévia de gordura, empregados para pequenas quantidades de amostras de óleos vegetais, tecidos ou fluidos biológicos. Estes métodos, primeiramente, foram desenvolvidos para análise de lipídios em microorganismos (Abel, Deschmertzing, Peterson, 1963) e posteriormente foram modificados e aplicados para uma grande gama de produtos alimentícios (Carrapiso e Garcia, 2000; Golay et al., 2006; Méier ect al., 2006; Ulberth e Henninger, 1992). Os procedimentos consistem da mistura da amostra com os reagentes de esterificação, aqueles já utilizados para a reação nos lipídios previamente extraídos, tais como: cloreto metanólico de hidrogênio; 5% (v/v) cloreto metanólico de acetila; metóxido de sódio metanólico para produtos lácteos (Golay et al., 2006); hidróxido de sódio metanólico (90°C por 10 min ) e solução de BF3

(Carrapiso e Garcia, 2000; Ulberth e Henninger, 1992). Nestes procedimentos há economia de tempo de análise e solventes, pois ocorre a síntese de ésteres de ácidos graxos por extração e derivação simultâneas. A diminuição na manipulação da amostra contribui para diminuir o erro experimental. Por outro lado, o teor de água dos alimentos, a tomada de amostra, a escolha dos reagentes (catalisador) e as condições da análise, por exemplo a temperatura, são fatores decisivos na eficiência das reações diretas (Carrapiso e Garcia, 2000). Mazalli e Bragagnolo (2007), em trabalho recente, comparando metodologias de metilação “in situ” e na gordura extraída de amostras de ovos, verificaram desempenho inadequado no processo de metilação direta, para a determinação de AGP.