Primeira fase

4.1.1 Preparo do hidrogel de quitosana

O hidrogel de quitosana foi gentilmente cedido a este estudo pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP), com a colaboração da Professora Dra. Flávia Gonçalves. O biomaterial foi purificado e enviado ao Laboratório de Pesquisa Básica Prof. Edmir Matson do departamento de Dentística da FOUSP (LPBD), ainda na fase sólida (apresentação em pó), onde foi esterilizado em autoclave. Em seguida, o pó estéril (50 mg) foi dissolvido em solução de ácido clorídrico 0.1M (44,3 µL) (Synth, SP, Brasil) em água destilada estéril (4,5 mL). A dissolução se deu com auxilio de agitadores magnéticos à temperatura controlada de 4 °C. Ao fim deste processo, obteve-se um hidrogel de quitosana que era sempre armazenado a 4 °C em recipientes estéreis de vidro. Imediatamente antes de cada ensaio, a composição do hidrogel foi finalizada pela adição de reticulante

glicerofosfato, responsável por fazer as ligações cruzadas entre as cadeias poliméricas através de ligações covalentes, acrescido na proporção 4:1 (volume:volume).

Para melhor avaliar o desempenho do hidrogel de quitosana como scaffold, este foi comparado a um material já estabelecido como scaffold na literatura, o PuraMatrix®(BD Biosciences, MA, EUA) (63, 91).

4.1.2 Preparo do PuraMatrix®

PuraMatrix® é uma solução de aminoácidos (1% volume/peso) em 99% de água. Para uso em todos os ensaios deste estudo, o material foi diluído em água destilada estéril à concentração de 0,15%. Primeiramente, utilizou-se sonicação por 30 min a fim de reduzir a viscosidade inicial do PuraMatrix®. Em seguida, 150 µL do material foram adicionados a 850 µL de água destilada estéril, resultando em solução de trabalho de 0,15%. A cada ensaio com o PuraMatrix®, soluções frescas foram preparadas.

4.1.3 Preparo dos scaffolds híbridos

O coágulo sanguíneo foi obtido a partir do sangue de doador universal, do tipo O- para padronizar os coágulos, e somente após o consentimento livre e esclarecido do doador. O sangue recém coletado era imediatamente incorporado ao hidrogel de quitosana (em sua composição final) ou ao PuraMatrix® (0,15%), por meio de agitação vigorosa, na proporção 3:1 (sangue:biomaterial), seguindo o protocolo de Iliescu et al.(61) modificado. Todos os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente.

4.1.4 Ensaio de incorporação sanguínea (Blood-Clotting Index - BCI)

Para avaliar a compatibilidade dos biomateriais com a coagulação sanguíneo, foram obtidos os BCIs de ambos scaffolds a partir do protocolo de Fan et al. (92) modificado. Para isso, os scaffolds híbridos foram preparados como descrito previamente e 500µL de cada scaffold híbrido foi gentilmente depositado no fundo de placa de cultivo celular de 6 poços, em triplicata, e mantidos em estufa a 37 °C por 10 min para permitir a coagulação do sangue. Após esse período, 2 mL de água destilada foram gentilmente adicionados a cada amostra, pelas paredes dos poços, visando não romper mecanicamente o coágulo. Logo em seguida, 1 mL da água destilada foi coletado de volta e transferido para tubo tipo Eppendorf para então ser centrifugado à 100 x g por 30 s. O sobrenadante foi coletado e incubado em estufa a 37 °C por 1 hora. Após esse período, 100 µL do sobrenadante de cada réplica foram distribuídos em placas de 96 poços e levados ao espectrofotômetro (Biotek II Biochrom Ltd., Eugendorf, Austria) para leitura de absorbância com filtro de 542nm. Como controle negativo, foram utilizados 500µL de sangue puro diluído diretamente em 2 mL de água destilada, sem que sua coagulação fosse permitida. Logo em seguida, 1 mL foi coletado, centrifugado e incubado como descrito previamente, para que então 100 µL do sobrenadante também fossem distribuídos em placas de 96 poços e levados ao espectrofotômetro.

Ao adicionar água aos scaffolds híbridos no fundo dos poços, e também ao sangue puro não coagulado, as hemácias não incorporadas ao material sofrem hemólise e a leitura em espectrofotômetro detecta a hemoglobina contida na solução (92).

O BCI foi calculado seguindo a equação:

(1)

Quanto maior o índice, menor a incorporação do sangue. 100 x (absorbância da amostra) BCI =

4.1.5 Ensaio de dissolução

Para o ensaio de dissolução, 500µL de cada scaffold foram incubados em duplicata em tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL em banho termostático overnight. Em seguida, os tubos foram preenchidos com 1 mL de meio mínimo essencial α [α-MEM; do inglês, α-Minimum Essential Medium; (GIBCO, NY, EUA)] e a perda de peso após centrifugação das amostras (3.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) foi medida em diferentes intervalos de tempo. A cada tempo experimental, após centrifugação, as amostras foram secas com papel filtro e pesadas. Em seguida, 1 mL de α-MEM era novamente adicionado ao tubo, o qual foi incubado a 37 °C. O perfil de dissolução foi medido pela porcentagem de perda de peso a cada intervalo de tempo utilizando-se a seguinte equação:

(2)

Onde, D é a porcentagem de dissolução do scaffold, P0 o peso da amostra no tempo

zero, Pr o peso do recipiente, e Px o peso da amostra no tempo avaliado.

4.1.6 Ensaio de embebição (Swelling)

Para o ensaio de embebição, 500µL de cada scaffold foram incubados em duplicata em tubo tipo Eppendorf de 1,5mL em banho termostático overnight. Em seguida, os tubos foram preenchidos com 1 mL de α-MEM e incubados a 37 °C. A cinética de embebição dos scaffolds foi analisada por até 10 h. A cada intervalo de tempo, o peso dos espécimes embebidos foi medido após remoção do excesso de água da superfície dos materiais com papel filtro. A taxa de embebição foi calculada de acordo com a equação:

(3)

Onde, TE é a taxa de embebição, e Pt e P0 são os pesos da amostra embebida num dado momento e no tempo inicial, respectivamente.

(P0 − Pr) – (Px – Pr) x 100 D = (P0 – Pr) Pt– P0 TE = P0

4.1.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Com o intuito de visualizar a arquitetura do hidrogel de quitosana e do scaffold híbrido, amostras foram preparadas para microscopia eletrônica de varredura (MEV). Quinhentos microlitros (500 µL) de cada scaffold foram transferidos para tubo tipo Eppendorf de 1,5 mL e deixados em banho termostático a 37 °C por 1 hora, a fim de que completassem sua gelificação ou coagulação. Em seguida, as amostras foram processadas pelo método de congelamento lento (93). Brevemente, os scaffolds foram incubados a 20 °C negativos por 3 h, em seguida a 80 °C negativos por 24 h. As amostras foram então imersas em nitrogênio líquido e liofilizadas por 48h. Após liofilização, foram montadas em bases metálicas sobre fitas adesivas condutoras, metalizadas com platina (25 nm de recobrimento) (SCD 050, BAL-TEC, Liechtenstein) e visualizadas em microscópio eletrônico de varredura (JEOL 5300, MA, EUA) no Laboratório de Biologia Oral da Faculdade de Odontologia da USP ou no microscópio eletrônico de varredura (QUANTA 600 FEG, FEI Company, OR, EUA) do Laboratório de Caracterização Tecnológica (LCT - Escola Politécnica da USP).