Segunda fase

4.2.1 Obtenção e isolamento das células da papila apical humana

Terceiros molares humanos que, ao exame radiográfico e clínico, apresentavam-se inclusos, livres de doenças periodontais e com rizogênese incompleta, foram coletados no curso de Especialização em Cirurgia da Fundação da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo (FFO-FOUSP). Três elementos dentais foram obtidos de três pacientes diferentes, dois do sexo masculino e um do sexo feminino, com idades entre 18-28 anos, saudáveis e sem condições sistêmicas relatadas. Todas as exodontias foram realizadas por indicação ortodôntica ou preventiva.

Culturas primárias de células da papila dentária foram obtidas de acordo com o protocolo de Sonoyama et al. (24) e Trevino et al. (94) modificados. Após exodontias os dentes foram transferidos do alvéolo diretamente para tubos de polipropileno (Corning Inc., NY, EUA) (Figura 4.1A) contendo α-MEM, suplementado com 15% de soro fetal bovino para células-tronco mesenquimais [MSC FBS; do inglês, Mesenchymal StemCell-qualified Fetal Bovine Serum; (GIBCO, NY, EUA)], 100 μM de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, MO, EUA), 2 mM de L-glutamina e 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina (todos GIBCO) e mantidos a 4°C, por período máximo de 4 h. Essa composição de meio de cultura foi nomeada Meio Clonogênico. Os dentes foram então transportados para o Laboratório de Pesquisa Básica Prof. Edmir Matson onde, em câmara de fluxo laminar, foram desinfetados com solução de iodopovidona a 10% (Icaraí, SP, Brasil) e lavados com tampão fosfato-salina (PBS; do inglês,Phosphate Buffered Saline). Após desinfecção e lavagem, a papila apical foi gentilmente destacada da raiz dentária, com auxilio de lâmina de bisturi, pinça delicada e tesoura afiada (Figura 4.1C), para ser fragmentada em porções menores que 0,5mm, e então dispostas em placas do tipo Petri (Corning Inc., NY, EUA) contendo Meio Clonogênico. Os fragmentos oriundos das papilas apicais (Figura 4.1D) de todos os pacientes foram dispostos em conjunto, de maneira a gerar linhagem do tipo pool de células.

Figura 4.1 – Fotografias do procedimentos para coleta das células da papila apical de dente com rizogênese incompleta. Transporte do dente recém extraído em meio de cultura a 4 °C (A). Dente com rizogênese incompleta e papilas apicais presentes (B). Uso de bisturi para destacar a papila apical (C). Papila apical separada do dente e posicionada sobre placa tipo Petri para ser fragmentada (D)

Os fragmentos, ou explantes, foram então mantidos em cultivo, incubados em estufas de CO2 a 37°C, durante o tempo necessário (variando de 24 a 96 h) para que células

começassem a migrar dos explantes para o fundo das placas de Petri (Figuras 4.2A-B).

Figura 4.2 - Fotomicrografias de fase de cultivo dos explantes (*) extraídos da papila apical de dentes permanentes. (A) Após 48 h de cultivo. (B) Após 72 h de cultivo. Notar células migrando dos explantes e organizando-se em monocamada contendo células em divisão (setas)

A medida que as células migravam dos fragmentos de tecido, e no momento em que já não se identificavam mitoses ocorrendo nas proximidades destes, foram realizados subcultivos no intuito de aumentar o número de células obtidas do explante. Para tal, utilizou-se solução de tripsina a 0,25% e EDTA a 0,1% (Sigma-Aldrich), por 2-5 min, a 37 °C. A primeira passagem celular foi denominada P0. Os subcultivos seguintes foram feitos até P3, sendo que a cada passagem foram congeladas alíquotas de 1-2 x 106 células cada. Essas alíquotas foram estocadas em freezer de nitrogênio líquido a 196 °C negativos, compondo assim o banco de células do estudo, para utilização nas posteriores fases.

Todos os procedimentos de cultivo celular foram realizados em capela de fluxo laminar seguindo os protocolos de manutenção de esterilidade de materiais e de soluções utilizadas.

4.2.2 Caracterização imunofenotípica das células isoladas da papila apical humana

Para identificar e caracterizar imunofenotipicamente a população celular cultivada foram utilizados anticorpos monoclonais contra as moléculas de superfície celular, segundo a Tabela 4.1. Alíquotas de células oriundas da papila dentária humana foram cultivadas até a obtenção de no mínimo 105 células para cada marcador de superfície a ser investigado. Todo protocolo de marcação foi realizado a 4 °C e as centrifugações a 550 x g por 5 min. Células em P3 foram lavadas duas vezes em PBS e colhidas com solução de enzima marinha com atividade colagenolítica e proteolítica (StemPro Accutase, GIBCO) por 10 min, sob agitação, para minimizar a degradação de antígenos de superfície. As células foram então coletadas, centrifugadas e ressuspensas em PBS contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) a fim de proceder à contagem em câmara de Neubauer e distribuição do adequado número de células (105) por marcador. A incubação dos anticorpos primários (200:1) foi de 30 min a 4°C protegido da luz. Após esse período, as células foram lavadas com PBS contendo 5% SFB e os anticorpos secundários foram adicionados na mesma proporção (200:1) por mais 30 min. Finalmente, as células foram lavadas e ressuspensas em 200 µL de PBS contendo 5% SFB, filtradas para serem desaglomeradas por filtro com poros de 70 µm e levadas para análise.

Tabela 4.1 - Marcadores imunofenotípicos testados nas células oriundas da papila apical

A população celular foi contada e classificada por citômetro de fluxo FACSCanto (BD Biosciences, CA, EUA) no Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas

Marcadores Positivos Marcadores Negativos

Células indiferenciadas nicho perivascular

Células mesenquimais

Células endoteliais Células hematopoiéticas CD146 STRO-1 CD105 CD90 CD14 CD45

da USP. Os dados foram analisados pelo programa 9.6.2 FlowJo Software Version (Tree Star, OR, EUA).

4.2.3 Tempo de dobra populacional

O tempo de dobra da população das células isoladas da papila apical foi determinado através da análise da curva de crescimento, obtida por contagem eletrônica do número de células. Células foram plaqueadas em placas de 6 poços (5 x 104 células por poço), em duplicatas, e cultivadas em Meio Clonogênico por 9 dias. Os tempos avaliados foram 1, 2, 3, 4, 7 e 9 dias. As células de cada poço foram coletadas com solução de tripsina a 0,25% e de EDTA a 0,1% (Sigma-Aldrich), imediatamente fixadas com solução de paraformaldeído (PFA) a 4% e armazenadas a 4°C em tubos de ensaio para posterior contagem eletrônica no citômetro de fluxo (BD Accuri C6 FlowCytometer; BD Bioscience, MA, EUA). Os dados de contagem celular foram utilizados para obter a curva de crescimento e para o cálculo do tempo de dobra populacional aplicando-se a seguinte equação: logarítmo natural (Ln) de (número de células em 9 dias menos o número de células em 1 dia) dividido pelo Ln de 2.

Dobra Populacional= (4)

4.2.4 Contagem de Unidades Formadoras de Colônias – Fibroblásticas (CFU-F; do inglês, Coloning Formation Units - Fibroblastic)

Para a contagem do número de CFU-F, células em P2 foram plaqueadas em placas de 6 poços (200 células por poço), em quadruplicata, e cultivadas em Meio Clonogênico por 9 dias. Ao fim desse período, as células foram fixadas em solução de PFA a 4% e coradas com solução de azul de toluidina a 0,1% (Sigma-Aldrich) em 1% de PFA em PBS e, a seguir,

fotografadas. O número de CFU-F nas fotografias foi determinado utilizando o programa Image-J (NIH, National Institutes of Health, MD, EUA). Contagem maior que 50 células por colônia foi considerada como positiva (1 unidade). Para servir também como indicador da viabilidade celular, foi aplicado o cálculo da Eficiênica de Plaqueamento (EP) pela seguinte equação:

Eficiência de Plaqueamento (%) = (5)