Produção do fermento de algaroba destinado à produção da aguardente

No Laboratório de Tecnologia de Alimentos – Centro de Tecnologia da Universidade Federal da Paraíba foi desenvolvido o processo de seleção e isolamento do fermento de algaroba a partir das leveduras selvagens presentes no caldo e em seguida sua produção em processos fermentativos.

4.1.1 Caracterização físico-química da vagem da algarobeira

Os frutos da algarobeira, Prosopis juliflora (S.W.) D.C, foram coletados nas cidades de Serra Branca, Afogados da Ingazeira e Campina Grande. A colheita foi realizada nos meses de novembro e março de 2011 e as análises de caracterização das vagens quanto ao teor de água, foram determinadas pelo processo gravimétrico usando- se uma estufa a 105 °C com circulação forçada de ar, até peso constante, enquanto a proteína bruta foi calculada com base no nitrogênio total dosado por volumetria de acordo com o método Micro Kjeldhal descrito na metodologia oficial da AOAC (2008).

A fibra bruta foi determinada por processo gravimétrico após hidrólise ácida e alcalina da amostra de algaroba.

Os lipídios foram determinados por meio da extração com éter de petróleo em aparelho extrator tipo “Soxhlet” conforme metodologia descrita pela AOAC (2008).

Para o resíduo mineral fixo (cinzas), açúcares redutores e açúcares totais, foram usados os procedimentos analíticos conforme metodologia do INSTITUTO ADOLFO LUTZ (2005).

4.1.2 Seleção e liofilização da levedura do caldo da algaroba

A levedura utilizada nesta pesquisa foi selecionada e isolada do próprio caldo de algaroba. Com a obtenção de uma linhagem pura de levedura, foram caracterizadas e

identificadas geneticamente, seu gênero e espécie. O critério de escolha foi aplicado para as linhagens identificadas como S. cerevisiae.

4.1.2.1 Extração do caldo da vagem de algaroba e preparo do meio de cultivo para o crescimento das leveduras selvagens

Depois de selecionada e fragmentada, a vagem foi embebida em água a 40 °C por 30 minutos, em seguida prensada com o objetivo de extrair o caldo das vagens de algaroba. O °Brix do meio foi determinado em refratômetro de bancada Abbe AR1000S.

O meio de cultivo foi preparado a partir do caldo de algaroba diluído, partindo-se de um volume de dois litros com °Brix inicial igual a 7, medindo por meio de um refratômetro Abbe AR1000S. Utilizou-se um sistema composto por um compressor de aquário da marca AIR PUMP AC-1000 com capacidade de vazão de 1,2 litros de ar por minuto, filtro de ar, mangueira de silicone e pedra porosa, que auxiliaram a promover a aeração no meio de cultivo e consequente proliferação da microbiota selvagem. Ao final de cada 24 horas era adicionado um xarope de algaroba. Por meio da evaporação, o caldo foi concentrando até 70 °Brix a uma temperatura de 90 °C. O xarope obtido possui açúcares redutores e sacarose não cristalizada diluída a uma concentração de 10 °Brix; este ciclo foi encerrado quando se alcançou massa celular suficiente para a etapa de isolamento das leveduras.

4.1.2.2 Meio de cultivo, fases de propagação e isolamento de leveduras

Os meios sintéticos ou artificiais utilizados para o isolamento foram preparados em tubos e placas a partir de meio completo, conforme se segue: peptona, 10 g; extrato de levedura, 10 g; K2HPO4, 0,5 g; dextrose, 20 g; agar, 20 g; água destilada 1.000 mL e

com correção de pH para 4,5; em seguida, realizou-se a esterilização do meio a 121 ºC, por 15 minutos em autoclave.

Esses meios foram utilizados para promover a propagação e o isolamento das leveduras presentes na massa celular, conforme relatado no subitem 4.1.2.1. Foi utilizada a técnica das diluições sequenciais por transferência de 1 mL das células crescidas para 9 mL de meio, visando à obtenção de colônias isoladas e puras de leveduras, conforme visualizado na Figura 4.1.

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL DILUIÇÕES: 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Em balão de 1000 mL (Diluição10-2₎

Figura 4.1 - Fase de seleção e isolamento de leveduras do caldo de algaroba

Com o auxílio de uma alça de platina, as células de levedura foram transferidas dos tubos de ensaios com maior diluição, para as placas de Petri e incubadas durante 48 h em estufa de cultura bacteriológica 410ND da marca Nova Ética, a 28 ºC, para promover o desenvolvimento das unidades formadoras de colônias. A partir de uma unidade formadora de colônia pura, identificada como as características morfológicas da

S. cerevisiae, foi realizada a repicagem para um tubo de ensaio e conduzida sua

multiplicação para obtenção da massa celular suficiente para a identificação genética e para a produção de aguardente; na Figura 4.2 se encontra ilustrada a fase de multiplicação das leveduras selecionada da algaroba.

Figura 4.2 – Inoculação e propagação de leveduras selecionadas 4.1.2.3 Análise genética de identificação de leveduras da algaroba

ponto de vista genético, por meio da metodologia de amplificação de DNA por eletroforese, usando-se como iniciador (GTG)5 segundo SCAVUZZI (2007).

4.1.2.4Analises de viabilidade celular

O crescimento microbiano foi quantificado em câmara de Neubauer segundo metodologia recomendada por LOPES (2005).

Foram realizados testes de pureza microbiana no fermento, por meio de análise qualitativa, com o objetivo de se observar a estabilidade da cultura em relação à presença de microrganismos contaminantes.

A viabilidade celular foi determinada utilizando-se o azul de metileno em uma câmara de Neubauer, sendo viáveis as que não absorveram o corante e inviáveis aquelas que o absorveram, ou seja, estarão mortas aquelas que apresentarem coloração azul (REINA, 2003).

O resultado da contagem é expresso em número de células por mililitro de acordo com a população quantificada a partir da Equação 1:

004

,

0

1000

.

.f

n

N



n - média do número de células ƒd - fator de diluição