Produção In Vitro de Metabólitos Secundários

Em geral, a biossíntese de metabólitos secundários é ativada na fase final do crescimento logarítmico ou já na fase estacionária da fermentação, como destacado na Figura 13, quando a divisão celular e a produção de biomassa ocorrem em níveis muito baixos (ROBINSON et al., 2001).

Figura 13 – Curva de crescimento bacteriano, em destaque o momento de maior biossíntese de metabólitos secundários

Fonte: O Autor

Tabela 4 – Alguns compostos produzidos por actinobactérias endofíticas e suas

respectivas atividade biológica

Compostos Bioativos Actinobactérias

Endofíticas Função Referência

Celastramicinas A e B Streptomyces sp. MaB-QuH-8 Antimicrobiana Pullen et al. (2002) Kakadumicinas Streptomyces sp. NRRL 30566 Antibiótica Castillo et al. (2003) Cedarmicinas A e B Streptomyces sp. TP-A0456 Antifúngica Igarashi (2004) Coronamicinas Streptomyces sp. MSU-2120 Antibiótica Ezra et al. (2004) Dinactina dimérica e Nonactina dimérica Streptomyces sp. Is9131 Antimicrobiana e antitumoral Zhao et al. (2005) Naftomicina K Streptomyces sp. CS Antitumoral Lu & Shen (2007) Saadamicina Streptomyces sp. Hedaya48 Antifúngica El-Gendy & El-Bondkly (2010)

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O crescimento dos micro-organismos pode ocorrer em fase sólida (usualmente ágar suplementado com nutrientes específicos) ou líquida, esta última podendo ou não ser submetida à aeração. O uso de fermentadores específicos é desejável, devido à obtenção da reprodutibilidade do processo fermentativo. Novas técnicas, como a fermentação em estado (ou suporte) sólido têm surgido, visando promover um crescimento microbiano mais rápido e uma produção diferenciada de metabólitos secundários (ASAGBRA et al., 2005).

Neste método, emprega-se um substrato natural como fonte de carbono, em presença de uma quantidade mínima de água. Substratos sintéticos, como polímeros, com suplementação nutricional, sozinhos ou misturados a substratos naturais, também têm sido usados, desde que o material sintético seja inerte frente ao micro-organismo alvo do processo fermentativo. A fermentação em estado sólido para a produção de antibióticos tem sido considerada muito vantajosa, com um aumento do rendimento e com o período fermentativo mais curto em relação a procedimentos paralelos realizados em culturas submersas (MIZUMOTO et al., 2006).

Observando as condições utilizadas para a produção de antibióticos por micro-organismos, parece consensual que meios de cultura de constituição complexa são mais adequados do que aqueles de constituição quimicamente definida (TAKAHASHI & LUCAS, 2008). A capacidade biossintética do micro- organismo e as condições de fermentação influenciam a produção de metabólitos secundários quali e quantitativamente. Consequentemente, a manipulação de parâmetros envolvidos no processo fermentativo pode alterar a expressão e a diversidade dos compostos produzidos (TAKAHASHI & LUCA, 2008; SCHERLACH & HERTWECK, 2009; MOUSA & RAIZADA, 2013). Ou seja, variando a composição do meio de cultura, a aeração, a temperatura, ou, até mesmo, a forma do recipiente de cultivo, pode-se chegar à descoberta de novos produtos naturais (BADER et al., 2010).

Uma produção sustentável de metabólitos secundários está sendo estudada por inúmeros pesquisadores, em diferentes países (KUSARI et al., 2012). Uma hipótese mais aceitável para a capacidade dos micro-organismos, em especial os endofíticos, na produção dos metabólitos secundários é a existência, nos seus genomas, de ―gene clusters‖, sendo este um grupo de genes permanentemente

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alinhados, e que são coletivamente responsáveis em um processo multivariado na biossíntese (SWAMINATHAN et al., 2009; OSBOURN, 2010).

Intensas pesquisas das rotas metabólicas desses ―gene clusters‖ possibilitarão um constante desenvolvimento de tecnologia com o intuito de realizar a transferência de clusters entre organismos. A transferência genética horizontal (HGT, do inglês, Horizontal Gene Transfer) da planta para o micro-organismo é extremamente rara, principalmente em angiospermas, contudo, esse fenômeno foi comprovado recentemente em pelo menos nove casos (RICHARDS et al., 2011; RENNER & BELLOT, 2012). Alguns autores redesenharam as rotas de biossíntese de metabólitos secundários de vários micro-organismos, incorporando-as à bactéria Escherichia coli (procariótico) e à levedura Saccharomyces cerevisiae (eucariótico), sendo estes micro-organismos caracterizados como fábricas biológicas. Muito embora essa metodologia necessite ainda de aperfeiçoamento, principalmente em relação a alguns metabólitos, ela poderá representar a solução desejável na produção de importantes compostos bioativos úteis para a humanidade (IMMETHUM et al., 2013).

Entretanto, a alta taxa de redescoberta de metabólitos secundários é um problema crônico na química de produtos naturais, evidenciando que novas abordagens são necessárias, no intuito de aumentar a probabilidade de encontrar estruturas biologicamente ativas inéditas. Pesquisas envolvendo sequenciamento genético têm revelado o grande potencial biossintético ainda não explorado que os micro-organismos apresentam. Isso pode ser ilustrado pelos genes que muitas vezes não são expressos devido ao uso de meios de cultivo inapropriados (GROSS, 2009; SCHERLACH & HERTWECK, 2009; ZERIKLY & CHALLIS, 2009).

Entre as novas abordagens visando à busca de compostos bioativos a partir de micro-organismos, destacam-se o cultivo simultâneo de microrganismos (co- culturas), o remodelamento epigenético da biossíntese através de agentes químicos, o estudo sobre moléculas sinalizadoras ou ―quorum-sensing‖ e o uso de métodos genômicos para acessar e manipular as vias biossintéticas (SHERLACH & HERTEWECK, 2009).

A utilização de co-culturas pode gerar um estímulo para a comunicação química entre as diferentes espécies, o que pode ampliar a diversidade química produzida em comparação com culturas individuais. Tem sido proposto, também,

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que processos epigenéticos exerçam importantes funções regulatórias silenciadoras em clusters de genes biossintéticos, principalmente em policetídeo sintetases e peptídeo sintetases não ribossomais. Evidente que a manipulação destas vias com agentes químicos, principalmente inibidores de histona desacetilase, tem levado a um remodelamento de vias biossintéticas e à produção de novos produtos naturais em fungos, como relatou Henrikson e colaboradores, em 2009.

Existem diversas metodologias de extração para a obtenção dos metabólitos secundários bioativos, as quais visam separar compostos de acordo com a polaridade, utilizando o próprio meio onde ocorreu a fermentação (SOUZA et al., 2004) e solventes como metanol (SILVA et al., 2002), clorofórmio, etanol e acetona (CUNHA et al., 2009). Após o procedimento de extração, os metabólitos são concentrados e sua atividade biológica testada, havendo positividade, o composto será identificado e verificada a sua toxicidade, podendo ser utilizado na forma de fármacos ou de outros produtos com alguma aplicabilidade (WENZEL et al., 2013).

2.4.3.1 Avaliação da Bioatividade dos Metabólitos Secundários Microbianos

Para avaliação das possíveis aplicações biotecnológicas dos metabólitos secundários, o isolamento e a identificação de espécies de micro-organismos endofíticos são as primeiras etapas para que se possa, posteriormente, contribuir com a descoberta de novas moléculas com atividade biológica (WENZEL et al., 2013).

A bioprospecção de metabólitos com atividade biológica precisa ser melhorada, utilizando novas tecnologias e alternativas como a engenharia genética; biossíntese mutacional; triagem de alta produtividade, além da identificação mais rápida de moléculas, de forma que seja viável economicamente (BOGGS & MILLER, 2004; GULLO & HUGHES, 2005; SAMIULLA et al., 2005).

Visando a urgência na terapêutica de algumas doenças, estudos a partir dos metabólitos secundários microbianos estão sendo conduzidos sob novas perspectivas, especialmente com inovações metodológicas. Os ensaios em larga escala tornaram-se cada vez mais difundidos. O rápido progresso no estudo do

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genoma humano proporcionou fácil acesso para uma grande variedade de alvos moleculares relacionados a várias doenças não infecciosas (BERDY, 2005).

A utilização de testes biológicos mais robustos e confiáveis é um aspecto importante para o sucesso na busca de novos fármacos. Atualmente, ensaios HTS (do inglês, high throughput screening) realizam, de forma rápida e automatizada, o experimentos de milhares de substâncias químicas em ensaios biológicos preditivos de eficácia clínica, onde os resultados permitem aos pesquisadores selecionar, a partir de amplas bibliotecas químicas, compostos que possuam bioatividade em determinadas vias metabólicas ou que interagem com alvos moleculares específicos. Substâncias identificadas como promissoras nesses ensaios HTS seguem para testes subsequentes, tendo por objetivo confirmar e avaliar os dados obtidos nas primeiras triagens. Trata-se do ponto de partida para a descoberta de novos fármacos. Esses ensaios são realizados por equipamentos automatizados, comumente conhecidos como robotizados, que permitem triagens in vitro e in vivo de grandes coleções de compostos (GUIMARÃES et al., 2009).

2.4.4 Aplicações dos Metabólitos Secundários de Micro-organismos