4.1 Introdução
Xilana é o principal componente encontrado na fração hemicelulósica de tecidos vegetais. Esse complexo heteropolimero é composto por um esqueleto de unidades de D- xilopiranose (xilose) unidos por ligações glicosídicas β-(1,4) (BIELY; SINGH; PUCHART, 2016; SAHA, 2003), podendo apresentar diferentes ramificações, compostas por pentoses (D- xilose, L-arabinose), hexoses (D-manose, D-glicose, D-galactose) e/ou ácidos urônicos (ácidos D-glucurônico, D-4-O-metilglucurônico e D-galacturônico) (EBRINGEROVÁ; HROMÁDKOVÁ; HEINZE, 2005). Outros carboidratos como L-ramnose e L-fucose podem também estar presentes em pequenas quantidades, além das hidroxilas dos açúcares poderem estar parcialmente acetiladas (GÍRIO et al., 2010).
Dada a diversidade de estruturas de xilana existentes, a completa e eficiente hidrólise desse heteropolímero requer a ação combinada das principais enzimas de degradação da cadeia principal, incluindo endo-1,4-xilanases (EC 3.2.1.8) e β-d-xilosidases (EC 3.2.1.37) e enzimas que atuam nas cadeias laterais, incluindo as α-L- arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), α-glucuronidases (EC 3.2.1.139), acetil-xilan esterase (EC 3.1.1.72), e feruloil esterases (EC 3.1.1.73) (BIELY, 2003; BIELY; SINGH; PUCHART, 2016; TERRASAN et al., 2016a). Endo-1,4-xilanases são as principais enzimas responsáveis pela degradação da cadeia principal do polímero em xilooligossacarídeos (XOS) de diferentes comprimentos de cadeia. Por sua vez, β-xilosidases hidrolisam em monossacarídeos os xilooligossacarídeos (X2‒4) a partir das extremidades não redutoras, permitindo então a
aplicação da xilose liberada em processos industriais subsequentes como a fermentação para a produção de biocombustíveis e outros bioprodutos (JORDAN; WAGSCHAL, 2010).
Embora atualmente boa parte dos trabalhos foquem sua aplicação na produção de biocombustíveis, β-xilosidases são utilizadas em uma grande variedade de processos em escala industrial, como processamento de polpa de madeira para produção de papel e celulose (DHIMAN; SHARMA; BINDU, 2008), melhoramento da qualidade nutricional de massas de panificação (DORNEZ et al., 2007), produção de xilose para posterior redução a xilitol (POLIZELI et al., 2005), extração e liberação de aroma e sabor na produção de vinhos (MANZANARES; RAMÓN; QUEROL, 1999) etc.
Complexos xilanolíticos são produzidos principalmente por microrganismos que atuam na decomposição das paredes celulares das plantas, como fungos filamentosos, bactérias aeróbias e anaeróbias, insetos e protozoários (POLIZELI et al., 2005; WILSON, 2011). Contudo, os elevados custos envolvidos nas etapas de produção, purificação e difícil recuperação da enzima ativa ao término da reação constituem um obstáculo para aplicação mais ampla em processos biotecnológicos (BRENA; GONZALEZ-POMBO; BATISTA-VIERA, 2013). Em muitos casos, as formas nativas das enzimas são instáveis nas condições onde irão operar, estando mais suscetíveis a sofrer distorções estruturais devido a elevadas temperaturas, pHs extremos ou presença de solventes (MATEO et al., 2007; TROBO- MASEDA et al., 2018). A existência de múltiplas subunidades na estrutura enzimática constitui um fator adicional a ser considerado, haja visto que a primeira etapa do processo de inativação de enzimas multiméricas é a perda do correto enovelamento da estrutura ou a dissociação das subunidades que a compõem (FERNANDEZ-LAFUENTE, 2009).
Uma maneira de superar essas limitações seria imobilizar a enzima em um suporte sólido/insolúvel. A formação de ligações covalentes entre enzima e suporte em condições controladas aprimora a estabilidade operacional térmica devido à preservação estrutural, além de permitir a reutilização do biocatalisador em muitos ciclos operacionais (ADRIANO et al., 2008; MATEO et al., 2005; SHELDON; VAN PELT, 2013). No caso de enzimas multiméricas, a formação de múltiplas ligações covalentes entre as subunidades da enzima e o suporte ativado tem se mostrado uma ferramenta poderosa para a estabilização de proteínas, uma vez que todos os grupos envolvidos na imobilização mantêm suas posições relativas inalteradas, mesmo na presença de agentes capazes de provocar a distorção da estrutura tridimensional (BOLIVAR et al., 2010). Uma outra estratégia faria uso da existência de dois ou mais grupos amino-terminais (pKa 7,0-8,0), o que permite a imobilização a pH neutro ou levemente alcalino (TROBO-MASEDA et al., 2018). No evento dos resíduos terminais estarem localizados no mesmo plano, a ligação simultânea ao suporte resulta em uma imobilização semelhante à multipontual (BOLIVAR et al., 2009).
A β-xilosidase de Bacillus subtillis consiste em uma enzima multimérica, sendo a estrutura tridimensional composta por 4 subunidades contendo 533 aminoácidos cada. Cada subunidade apresenta seu próprio sítio ativo, sendo o acesso do substrato realizado através de uma pequena cavidade presente na superfície (DIOGO et al., 2015). A natureza multimérica desta enzima consiste em uma informação de extrema relevância, especialmente quando o objetivo é a sua estabilização através de técnicas de imobilização. Conforme explicado por Fernandez-Lafuente (2009), a estabilização de enzimas multiméricas não é algo trivial, haja visto que a primeira etapa do processo de inativação de tais enzimas é a perda do enovelamento correto ou dissociação das subunidades que constituem a estrutura quaternária
da enzima. Portanto, é fundamental evitar a dissociação das subunidades enzimáticas, preservando sua estrutura e atividade catalítica (TROBO-MASEDA et al., 2018).
Existem relativamente poucos trabalhos sobre a imobilização de β-xilosidase em diferentes suportes (BENASSI et al., 2013; DE OLIVEIRA et al., 2018; GUERFALI et al., 2009; SMAALI et al., 2009). Benassi et al. (2013) imobilizaram a β-xilosidase de Aspergillus niger em gel de agarose ativados com grupos amino (MANAE-Agarose). De Oliveira et al. (2018) aplicaram os derivados preparados com a enzima de Tricoderma reesei imobilizada em gel de agarose ativadas com grupos glioxil e recoberta com polietilenoamina (PEI) na hidrólise de xilana de bétula. Guerfali et al. (2009) avaliaram a imobilização da β-xilosidase de
Talaromyces thermophilus empregando diferentes metodologias (ligação iônica, covalente e
encapsulamento) em diferentes suportes, podendo o derivado ser reutilizado em 25 bateladas sem perda significativa de atividade.
Nesse contexto, o presente capítulo teve como objetivo avaliar as imobilizações covalentes da β-xilosidase recombinante purificada de Bacillus subtilis em pHs neutro e alcalino. Foram empregados dois suportes diferentes: géis de agarose e quitosana com ativações distintas (grupos glioxil e glutaraldeído), visando o aumento da estabilidade térmica da enzima bem como sua reutilização. Foram avaliados os perfis de pH e temperatura, bem como a estabilidade térmica dos derivados obtidos. Finalmente, os melhores derivados foram utilizados para a hidrólise da xilana de milho, um substrato natural rico em xilooligossacarídeos, em bateladas sucessivas.
4.2 Material e Métodos
4.2.1 Materiais
A β-xilosidase recombinante purificada e concentrada de Bacillus subtillis expressa em Escherichia coli foi fornecida pelo Laboratório de Fábricas Celulares (LAFAC) do DEQ-UFSCar. O 4-Nitrofenil-p-D-xilopiranídeo (p-NPX) foi adquirido da Goldbio (St. Louis, EUA). Glicidol e etilenodiamina (EDA) eram da Sigma-Aldrisch (St. Louis, EUA). Quitosana (85% desacetilação) da Polymar (Fortaleza, Brasil). Agarose 6% (6 BCL Sepharose™) da GE Healthcare Life Science (Buckinghamshire, Inglaterra) Borohidreto de sódio da Vetec (São Paulo, Brasil) e (meta) periodato de sódio da Synth (Diadema, Brasil). A xilana de milho foi adquirida da Carl Roth (Karlsruhe, Alemanha). Todos os demais reagentes químicos possuíam grau analítico.