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Produção de pectina esterase e poligalacturonase por
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INTRODUÇÃO
A pectina é capaz de formar géis em soluções e é amplamente utilizada na indústria de alimentos. Pode ser extraída através de diversas matérias primas, como casca de frutas cítricas (Menezes et al., 2015). As enzimas pectinolíticas são produzidas em diferentes combinações pelas plantas e por microrganismos como fungos, leveduras e bactérias. As pectinases são amplamente utilizadas em indústrias alimentícias, como na clarificação de sucos de frutas, melhorando a eficiência de filtração, no tratamento preliminar da uva em indústrias vinícolas, na maceração, liquefação e extração de tecidos vegetais, na fermentação de chá, café e cacau para melhorar a extração de óleos vegetais, na extração de polpa de tomate e no tratamento e degomagem de fibras naturais para as indústrias têxteis e de papel (Duchiron and Suneetha, 2011). O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de enzimas pectinolíticas por uma linhagem de Aspergillus sp. isolada de frutos de jatobá-do-cerrado, bem como utilizar fontes de carbono de origem vegetal em condições submersas.
MATERIAL E MÉTODOS Microrganismo e inóculo
A linhagem de Aspergillus sp. JT 102 foi isolada a partir de frutos do jatobá-do-cerrado.
A cepa é mantida em placas de Petri e tubos inclinados, contendo meio BDA 2% (batata dextrose ágar), sob refrigeração a 4 oC, no LABAP - Laboratório de Biotecnologia de Alimentos e Purificação de Produtos, Habite – Incubadora de Empresas de Biotecnologia da UFT, campus universitário de Gurupi, da Universidade Federal do Tocantins.
O inóculo foi preparado após o crescimento da linhagem em tubos de cultura contendo BDA inclinado. Os conídios foram suspensos em solução salina 0,8% (m/v) esterilizada. A contagem de células foi realizada em câmara de Neubauer para obter uma concentração de 107 conídios/mL. Utilizou-se 1 mL dessa suspensão para inocular os meios de cultura líquidos.
Seleção do meio de cultivo
Os cultivos foram preparados em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 20 mL dos meios de cultura. Foram avaliados 5 meios de cultivo: meio A (g/L): 5,5 de K2HPO4; 15
141 de KHPO4; 0,5 de MgSO4.7H2O; 0,2% Extrato de levedura; Meio B (g/L): MgSO4•H2O 0,14; K2HPO4 0,5; com substituição de CaCO3 5,0 por CaCl2•2H2O 7,2; 0,2% Extrato de levedura; Meio C (g/L): NaH2PO4 12,0; KH2PO4 2,0; CaCl2•2H2O 0,03;
ZnSO4•7H2O 0,03; FeSO4•7H2O 0,005; 0,2% Extrato de levedura, Meio D (g/L):
NaH2PO4 12,0; KH2PO4 2,0; MgSO4•H2O 0,168; CaCl2 •2H2O 0,331; 0,2% Extrato de levedura; Meio E (g/L): Solução salina de Vogel, 0,2% 2xtrato de levedura. Os meios de cultivos foram suplementados com 1,0 % (m.v-1) de pectina cítrica e o pH ajustado a 6,0. Os meios foram esterilizados em autoclave durante 15 minutos a 121 ºC, inoculados e mantidos na incubadora shaker a 28 ºC, 180 rpm durante 120 horas. Os cultivos foram realizados em triplicata.
Seleção da fonte de carbono
Após a etapa de seleção do meio de cultivo foram testados 12 resíduos agroindustriais como fonte de carbono: bagaço de abacaxi, farinha de batata doce, farelo de trigo, casca de mandioca, casca de soja, farinha de bacaba, sabugo de milho, palha de milho, bagaço da cana de açúcar, bagaço de laranja, casca de maracujá e casca de banana. O meio de cultivo foi preparado e distribuído em frascos Erlenmeyers de 125 mL, cada um contendo 20 mL de meio e foram suplementados com 1,0 % (m.v-1) da fonte de carbono. Foram realizados dois cultivos, nos tempos 72 e 120 horas. Os meios foram esterilizados em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos, inoculados e mantidos na incubadora shaker a 28 ºC em 180 rpm. Os cultivos foram realizados em duplicata.
Obtenção dos extratos proteicos e biomassas
Os caldos fermentados foram filtrados utilizando bomba a vácuo para separação dos extratos enzimáticos e biomassas. Os extratos obtidos foram armazenados a -4 ºC, para posterior análise da atividade enzimática. As biomassas retidas no papel filtro foram secas até peso constante em estufa com circulação de ar a 60 ºC. O valor da biomassa seca foi utilizado para verificar a concentração de biomassa produzida em cada cultivo (g.L-1).
142 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Seleção do meio de cultura
O fungo Aspergillus sp. JT102 foi cultivado em diferentes meios de cultura para verificar a produção de pectina esterase (PE) e poligalacturonase (PG). A maior produção de pectina esterase (2,330 U/mL) e poligalacturonase (1,793 U/mL) foi obtida utilizando o meio E (VOGEL, 1956). O meio de Vogel é composto por ácido cítrico, ZnSO4, Fe(NH4)2(SO4)2, CuSO4, MnSO4, H3BO3, NaMoO4, Na3C6H5O7, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, CaCl2, biotina. O meio de Vogel tem sido utilizado por diversos autores para a produção de diversas enzimas como celulases, xilanase, lipases (KNOB et al., 2013; ALMEIDA et al., 2013).
Tabela 1. Produção de pectina esterase e poligalacturonase utilizando diferentes meios de cultivo submersos.
Meios de cultivo
Biomassa (g/L)
Atividade PE (U/mL)
Atividade PG (U/ml)
A 12,175 0,337 0,125
B 13,732 0,064 0,122
C 10,077 0,118 0,049
D 14,697 0,085 0,146
E 8,434 2,330 1,793
A escolha da composição de sais para o crescimento microbiano e produção de enzimas é um passo importante para a otimização de um processo fermentativo uma vez que cada microrganismos apresenta exigências nutricionais distintas.
Seleção da fonte de carbono
As fontes de carbono que induziram a maior produção de enzimas PE e PG, respectivamente, foram: bagaço de abacaxi (1,90 U/mL e 2,49 U/mL) e palha de milho (1,36 U/mL e 1,53 U/mL) após 120 horas de cultivo. A produção de biomassa nos cultivos pode estar relacionada com a produção de outras enzimas no meio de cultura como celulases, xilanase que favorecem a liberação de monômeros de açúcar para o crescimento microbiano.
143 Tabela 2. Produção de pectina esterase e poligalacturonase diferentes biomassas como fontes de carbono.
72 horas 120 horas
Fonte de carbono Biomassa (g/L)
PE (U/mL)
PG (U/mL)
Biomassa (g/L)
PE (U/mL)
PG (U/mL)
Bagaço de abacaxi 14,95 0,65 0,02 12,37 1,90 2,49
Farinha de batata doce 14,09 ND ND 13,77 0,41 0,18
Farelo de trigo 17,57 ND ND 13,76 0,49 0,18
Casca de mandioca 19,02 ND ND 13,55 0,42 0,01
Casca de soja 18,77 0,32 0,01 17,47 0,35 0,38
Farinha de bacaba 20,63 ND ND 17,20 0,47 0,21
Sabugo de milho 14,33 0,63 0,01 13,89 0,60 0,45
Palha de milho 16,88 ND ND 13,31 1,36 1,53
Bagaço cana de açúcar 19,58 0,70 0,02 18,96 0,46 0,407
Bagaço de laranja 14,40 0,61 ND 13,51 0,21 0,22
Casca de maracujá 11,16 0,28 0,02 14,08 0,48 0,54
Casca de banana 10,93 ND ND 11,58 0,72 0,43
Nota: PE – pectina esterase; PG – poligalacturonase; ND – não dectado.
Ezugwu et al. (2014) relatam a produção de pectinases por Aspergillus niger utilizando cascas de abacaxi e laranja e a produção de pectinases por Aspergillus fumigatus utilizando cascas de manga em fermentação submersa.
CONCLUSÕES
Conclui-se que o meio Vogel é eficiente na produção de pectinases por Aspergillus sp. Nos cultivos utilizando resíduos agroindustriais como fonte de carbono, verificou-se que o cultivo de 120 horas obteve maior produção de pectina esterase e poligalacturonase, utilizando o bagaço de abacaxi como fonte de carbono. A produção de pectinases utilizando fontes renováveis da agroindústria pode ser uma alternativa viável para a produção de enzimas em condições submersas.
144 REFERÊNCIAS
ALMEIDA, A.F., TAUK-TORNISIELO, S.M.; CARMONA, E.C., 2013. Acid lipase from Candida viswanathii: production, biochemical properties, and potential application. BioMed Research International, 2013. EZUGWU, A. L.; EZIKE, T. C.;
IBEAWUCHI , A. N..; NSUDE, C. A.;
UDENWOBELE, S. O. O.; EZE, D. I.; ANYAWU, C. U..; CHILAKAET; F. C.
Comparative studies on pectinases obtained from Aspergillus fumigatus and Aspergillus niger in submerged fermentation system using pectin extracted from mango, orange and pineapple peels as carbon sources. Nigerian Journal of Biotechnology, v. 28, n. 1, p. 26-34, 2014.
KNOB , A., et al. Production , purification , and characterization of a major Penicillium glabrum xylanase using brewer ’s spent grain as substrate . BioMed Research International, 8 p., 2013.
VOGEL, H. J. A convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).
Microbiology Genetic Bulletin, v. 13, p. 42–43, 1956.
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