The role of the human citomegalovirus in the oncomodulation of brain tumors Maria Cristina Carlan da Silva
6. Professor Titular Disciplina de Neurocirurgia Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Diretor – Divisão de Clínica Neurocirúrgica Hospital das Clínicas da Faculda-
de de Medicina da Universidade de São Paulo SINOPSE
O citomegalovírus Humano (HCMV) é um agente viral que acomete indivíduos imunocomprometidos e recém nascidos, causando uma variedade de doenças graves e podendo levar ao óbito. Recentes evidências indicam que o HCMV está en- volvido no processo de progressão tumoral. Estudos demons- traram que o DNA viral e proteínas virais estão presentes em diferentes tipos de câncer; proteínas virais são capazes de in- terferir com a progressão do ciclo celular, apoptose e ativação do sistema imune e há indicações de que a infecção de células tumorais pelo HCMV aumenta a malignidade das mesmas. Estas descobertas levaram à criação do termo oncomodula- ção, definido como a habilidade do vírus em promover um processo tumoral. Os estudos do papel do HCMV no processo de malignidade de tumores estão avançando enormemente e um melhor entendimento do fenômeno de oncomodulação é essencial para elucidação da participação do HCMV na pro- gressão de tumores e para determinação de proteínas virais que podem ser alvo terapêutico em certos tipos de cânceres. Esta revisão discute os mecanismos envolvidos na oncogêne- se e oncomodulação de gliomas malignos promovidas pelo HCMV.
Palavras-chave: citomegalovírus humano, gliomas, oncogê- nese, oncomodulação
ABSTRACT
Human cytomegalovirus (HCMV) is an important viral patho- gen that causes a variety of diseases in imunocompromised individuals and newborns that can culminate in death. Recent evidences indicate that HCMV is involved in tumor progres- sion. Studies demonstrated that the viral DNA and proteins are
present in many types of cancer tissues; viral proteins are able to interfere with cell cycle, apoptosis and the immune system. In addition, there are indications that the infection of tumor cells by HCMV increases their malignity. These evidences led to the creation of the term oncomodulation, defined as the abil- ity of the virus to promote tumor progression. The studies of the HCMV role in the process of tumor malignity are rapidly advancing and a better understanding of the oncomodulation phenomenon is essential to clarify the participation of HCMV in malignancy and for the determination of specific viral pro- teins that can be therapeutic targets in certain tumor types. This review discusses the mechanisms of tumor progression and on- comodulation promoted by HCMV in malignant gliomas. Keywords: Human cytomegalovirus, gliomas, oncomodulation.
I
ntroduçãoO citomegalovírus humano (HCMV), também conhecido como herpesvírus humano-5 (HHV-5), pertence à família Herpesvi- ridae, sub-família que é formada por HCMV, HHV-6 e HHV-7 40. Em países desenvolvidos, o número de indivíduos infecta- dos pelo HCMV varia de 40 a 60%, enquanto que em países em desenvolvimento a sua prevalência pode chegar até 90%44. A infecção primária geralmente ocorre na infância e se carac- teriza por uma fase aguda de replicação, onde ocorre intensa reprodução viral em vários tipos celulares tais como células epiteliais, endoteliais e musculares. Esta fase é seguida por ou- tra de persistência, na qual o vírus se replica lentamente devido
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à ativação do sistema imune e ao controle da replicação viral. Durante a fase de persistência, o vírus se reproduz em células das glândulas salivares e do rim e consequentemente é excreta- do esporadicamente na saliva e na urina40.
Como qualquer outro herpesvírus, o HCMV fica em estado de latência por toda a vida dos indivíduos infectados e este estado é caracterizado pela presença do DNA viral em células infecta- das e pela ausência de replicação viral. No entanto, reativação da replicação pode ocorrer em decorrência de estímulos como cancer e imunodeficiências30.
Em indivíduos imunocompetentes, a infecção é geralmen- te assintomática, devido a um equilíbrio estabelecido entre o sistema imune do indivíduo infectado e a replicação viral. No entanto, em indivíduos nos quais o sistema imune não está completamente desenvolvido ou naqueles imunocomprometi- dos, o vírus pode causar doenças graves. Em pacientes trans- plantados, o HCMV é um dos principais agentes responsáveis por morte, especialmente em recipientes de órgãos sólidos45 e em indivíduos com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Apesar de a Terapia Antiretroviral Altamente Ativa contra o HIV (HAART), o HCMV continua a ser um grave problema, uma vez que alguns pacientes não respondem ou não têm acesso ao tratamento18.
Além disso, o vírus é também causa significativa de morbidade e mortalidade em recém-nascidos, sujeitos à infecção transpla- centária, durante o parto ou através de ingestão do leite ma- terno. A transmissão vertical do vírus da mãe para o feto, que ocorre através da placenta, comumente afeta o sistema nervoso central e os órgãos de percepção do feto, sendo o HCMV a causa principal de surdez em recém nascidos15.
e
struturae composiçãodovírusA partícula viral do HCMV, típica dos outros membros da fa- mília Herpesviridae17, é formada por um capsídeoicosaédrico, contendo uma dupla fita de DNA linear de aproximadamente 235 Kbp, envolto por uma camada de proteínas e RNA virais, denominada tegumento, e pelo envelope. Estima-se que a partí- cula viral seja composta de aproximadamente 59 proteínas estru- turais e várias proteínas celulares65, além do DNA e RNA virais2.
o
rganizaçãodogenoma docitomegalovírus huMano
O genoma do HCMV, composto de uma dupla fita de DNA li- near de aproximadamente 230.000 pares de bases, é formado por duas regiões únicas: a região única longa (UL, do inglês UniqueLong) e uma região única curta (US, do inglês Unique Short). Estas regiões são flanqueadas por seqüências terminais repetidas longas e curtas (TRL, do inglês Terminal Repeat Large TRS, Terminal Repeat Short) e por seqüências internas repeti- das (IRL, do inglês InternalRepeatLong e IRS, InternalRepeat Short)40. Estudos demonstram que o genoma viral possui 192 ORFs (Open Reading Frames) capazes de codificar proteínas41.
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eplicaçãodohCMv
O HCMV tem um ciclo de replicação longo, quando comparado a outros herpesvírus. A linhagem de laboratório AD169 comple- ta um ciclo de replicação entre 72 e 96 horas em fibroblastos em cultura, e isolados clínicos replicam-se ainda mais lentamente. O processo de replicação é dividido nas seguintes etapas: ade- são celular, penetração, expressão dos genes virais, replicação do DNA viral, montagem dos capsídeos, aquisição do envelo- pe e liberação celular40. Inicialmente a partícula viral se liga à superfície celular por interação com proteoglicanos de heparan Sulfato8. Logo após, uma ligação irreversível ocorre entre a gli- coproteína viral gB e o receptor celular de superfície do fator de crescimento epidérmico66, levando à fusão do envelope viral com a membrana plasmática8 e liberação dos capsídeos no ci- toplasma celular. No citoplasma, os capsídeos se deslocam até o núcleo onde o DNA viral é liberado através dos poros nucle- ares33,43.
No núcleo os genes virais são transcritos em forma de cascata, dando origem aos immediate-early, early, e late transcripts40. A maturação das partículas virais inicia no núcleo, com a forma- ção dos capsídeos e incorporação do DNA nos mesmos. Pos- teriormente os nucleocapsídeos são transportados para o cito- plasma através da membrana perinuclear. Durante esta etapa, ocorre um processo de envelopamento e de-envelopamento, e ao serem liberados no citoplasma, os capsídeos se deslocam para o sítio de aquisição do envelope final, que são provavel- mente membranas derivadas do complexo de Golgi, contendo glicoproteínas virais e algumas proteínas do tegumento viral. Finalmente, após aquisição do envelope a partícula viral com- pleta é liberada da célula por exocitose26,51,55.
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IPos CelularesInFeCtados elinhagens do
hCMv
O HCMV infecta vários tipos celulares no organismo como: células epiteliais, endoteliais, neuronais, musculares, fibro- blastos, monócitos e macrófagos46. Células epiteliais são as primeiras células infectadas e estão envolvidas em dissemina- ção e persistência do vírus. O envolvimento dos outros tipos celulares é observado em casos de infecção disseminada em imunocomprometidos e pacientes com câncer40.
C
itomegalovírus ecâncerA associação do HCMV com diferentes tipos de câncer tem sido investigada por décadas. Em 1971, Fuccillo et al. detec- taram um aumento nos títulos de anticorpos anti-HCMV em pacientes com carcinoma de cérvix comparado a indivíduos saudáveis. Desde então, muitos estudos compararam títulos de anticorpos em pacientes com câncer e pessoas saudáveis, em- bora com resultados inconclusivos38.
A transformação de fibroblastos de camundongo pelo HCMV foi demonstrada por Geder et al.16. Estudos posteriores demons- traram que o HCMV é capaz de induzir mutações em genes crí- ticos para transformação oncogênica. No entanto, o DNA viral não foi detectado na maioria das células transformadas. Uma tentativa de explicar o processo de transformação tumoral foi a criação da teoria “hit andrun”, a qual sugere que o hCMV pode ser um fator responsável somente pela iniciação tumoral1,12,42,54. Estudos subseqüentes demonstraram que o HCMV não é capaz de induzir por si só a transformação em células normais, contudo, o DNA viral, mRNA virais e proteínas continuaram a ser detectados em diversos tecidos tumorais e as evidências destes achados leva- ram à criação do termo oncomodulação em 1996. Desta maneira, durante o processo de oncomodulação, os distúrbios em uma cé- lula cancerosa, como alterações em vias de sinalização celular e controle transcricional proporcionam um ambiente propício para que o vírus exerça seu potencial oncomodulatório em células tu- morais, aumentando a malignidade do tumor3,4.
Suporte para a oncomodulação veio a partir de resultados de experimentos que mostraram que proteínas do HCMV influen- ciam propriedades celulares alteradas em células tumorais incluindo proliferação celular, sobrevivência, invasão, imuno- genicidade, angiogênese tumoral, estabilidade cromossomal38. Estudos em biópsias, usando técnicas altamente sensíveis continu- aram a detectar o HCMV em tumores como carcinoma coloretal24,
câncer de próstata50 câncer de pele67, e especialmente em gliomas malignos5,39,53. Importante mencionar que grupos que não usaram técnicas suficientemente sensíveis falharam na detecção do vírus em tecidos tumorais20, 25, 34,47, 49.
Os glioblastomas são os tumores mais estudados quanto a sua relação com a infecção pelo HCMV. Cobbs et al.5 e Mitchell et al.39, detectaram o HCMV em cerca de 100% dos glioblas- tomas com expressão restrita a células cancerosas, não sendo a mesma detectada em tecidos saudáveis adjacentes. Scheurer et al.53 detectaram uma frequência de 76% de células HCMV positivas em glioblastoma multiforme, comparado com frequ- ência de 48% em tumores de baixo grau.
Além disso, experimentos in vitro demonstraram que a infecção pelo HCMV em linhagens celulares de glioblastoma estimula a progressão do ciclo celular e invasividade6,7,35. Em um estudo específico, com pacientes com glioblastoma, agrupados de acor- do com o nível de replicação do HCMV, surpreendentemente pacientes com baixos níveis de replicação viral sobreviveram quase o dobro do tempo comparado com pacientes com altos ní- veis de replicação viral, sugerindo, portanto, que a infecção pelo HCMV em células tumorais altera o curso da doença59.
Enfim, muitas evidências sugerem uma contribuição do HCMV na progressão de tumores, especialmente glioblastomas.
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uMoresdosIsteMa nervosoCentraleglioblastoma
Os tumores cerebrais são uma das principais causas de morte entre a população em geral. No total, estima-se que o câncer do sistema nervoso central (SNC) compreende 1,1% dos tumores malignos de ocorrência recente, sendo a terceira causa de mor- tes entre 15 a 34 anos de idade e a quarta em homens entre 35 a 54 anos53.
Estes tumores apresentam uma grande variedade de tipos e são classificados de acordo com o local, o tipo de tecido envolvido (se benigno ou maligno), e invasividade, além de outros fatores45. Os tumores em células da glia, chamados de glioma, são os mais comuns. Quando ocorrem nos astrócitos recebem a deno- minação de astrocitoma, que podem ocorrer em quatro níveis. Os graus I e II correspondem a tumores benignos com células diferenciadas, que não invadem tecidos adjacentes e não re- sultam em metástases. Já os de graus superiores (III e IV) são tumores malignos que apresentam baixa taxa de sobrevivência. Gliomas grau IV são chamados de glioblastomas11.
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O glioblastoma é o tumor do SNC mais freqüente e o mais ma- ligno. Caracteriza-se por apresentar uma proliferação celular muito acelerada e uma alta capacidade de invasão de outros te- cidos, e representam cerca de 50,7% dos tumores do cérebro37.
P
ossíveisMeCanIsMos MoleCularesdeindução daoncomodulaçãoPelo
hCMv
A biologia dos glioblastomas está associada com um uma des- regulação de processos normais das células como: ciclo celu- lar, proliferação, motilidade e reconhecimento do sistema imu- ne. Várias proteínas codificadas pelo HCMV são capazes de interferir com estes processos.
As proteínas immediate early 1 (IE1-72), immediate early2 (IE2-86) e a proteína do tegumento pp71 são capazes de se ligar a proteínas da família Rb (pRb, p107 e p130) e inibir suas funções promovendo entrada das células na fase S do ciclo ce- lular23,31,32,48. A proteína kinase UL97 é capaz de fosforilar e inativar pRB, inibindo também sua função.
Diversas proteínas virais são capazes de inibir apoptose. A pro- teína IE2-86, em alguns tipos celulares, é capaz de se ligar a p53 e inibir sua função de transativação, impedindo a indu- ção de apoptose mediada por p5363; a proteína codificada pelo gene UL36 se liga à caspase 8, inibindo apoptose mediada por Faz58; a proteína produto do gene UL37 exon1 (UL37x1) inibe recrutamento dos membros da família Bcl-2, Bax e Bak para a mitocôndria, resultando em inibição de sua função19 e a proteína codificada pelo gene UL38 bloqueia ativação de caspase 364 . Evidências sugerem que o HCMV é capaz de contribuir na in- dução do processo angiogênico, através da proteína US28 (re- ceptor viral acoplado a proteina G). Experimentos demonstra- ram que esta proteína induz expressão do fator de crescimento endotelial vascular in vitro e in vivo. Além disso, linhagens celulares de glioblastoma que expressam US28 aumentam a malignidade do tumor após sua injeção em camundongos36. Recentemente foi demonstrado que as proteínas IE72 e IE86 são capazes de ativar a expressão da enzima telomerase, even- to crucial para transformação celular61. Em resumo, existem vários indícios que o HCMV pode estar envolvido nos proces- sos de oncogênese e oncomodulação de tumores cerebrais. No futuro, estratégias terapêuticas específicas podem apresentar impacto considerável no tratamento dos gliomas malignos.
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eferências1. Boldogh I, Huang ES, Rady P, Arany I, Tyring S, Albrecht T. Al- teration in the coding potential and expression of H-ras in human
cytomegalovirus-transformed cells. Intervirol 1994; 37:321–9.
2. Bresnahan WA, Shenk T. A subset of viral transcripts pack- aged within human cytomegalovirus particles. 2000; Science 288:2373-6.
3. Cinatl J, Jr, Cinatl J, Vogel JU, Rabenau H, Kornhuber B, Doerr HW. Modulatory effects of human cytomegalovirus infection on
malignant properties of cancer cells. Intervirol. 1996; 39:259–9.
4. Cinatl J, Scholz M, Kotchetkov R, Vogel JU, Doerr HW. Molec- ular mechanisms of the modulatory effects of HCMV infection
in tumor cell biology. Trends Mol Med. 2004; 10:19–23.
5. Cobbs CS, Harkins L, Samanta M, Gillespie GY, Bharara S, King PH et al. Human cytomegalovirus infection and expression
in human malignant glioma. Cancer Res 2002; 62:3347–50. 6. Cobbs CS, Soroceanu L, Denham S, zhang W, britt WJ, Pieper
R et al. Human cytomegalovirus induces cellular tyrosine kinase signaling and promotes glioma cell invasiveness. J Neurooncol 2007; 85:271-80.
7. Cobbs CS, Soroceanu L, Denham S, zhang W, Kraus Mh. Modu-
lation of oncogenic phenotype in human glioma cells by cytomeg- alovirus IE1-mediated mitogenicity. Cancer Res 2008; 68:724-30. 8. Compton T, Nepomuceno RR, Nowlin DM. Human cytomega- lovirus penetrates host cells by pH-independent fusion at the cell surface. Virology 1992; 191:387-95.
9. Compton T, Nowlin DM, Cooper NR. Initiation of human cyto- megalovirus infection requires initial interaction with cell sur- face heparan sulfate. Virology 1993; 193:834-41.
10. Dal Monte P, Bessia C, Ripalti A, Landini MP, Topilko A, Plachter B et al. Stably expressed antisense RNA to cytomegalovirus UL83 inhibits viral replication. J Virol 1996; 70:2086-94.
11. Diskin SJ, Eck T, Greshock J, Mosse YP, Naylor T, Stoeckert CJ Jr et al. STAC: A method for testing the significance of DNA copy number aberrations across multiple array-CGH experi- ments. Genome Res 2006;16:1149-58.
12. Doniger J, Muralidhar S, Rosenthal LJ. Human cytomegalovirus and human herpesvirus 6 genes that transform and transactivate.
ClinMicrobiolRev 1999; 12:367–82.
13. Fernandes JV, Meissener RV, Fernandes TAAM, Rocha LRM, Cabral MC, Villa L. Comparação de três protocolos de extração de DNA a partir de tecido fixado em formol e incluído em para- fina. J Bras Patol Med Lab 2004; 40:1676-2444.
14. Fucillo DA, Sever JL, Moder FL, Chen TC, Catalano LW, John- son LD. Cytomegalovirus antibody in patients with carcinoma of the uterine cervix. Obstet Gynecol 1971; 38:599-601. 15. Gaytant MA, Steegers EA, Semmekrot BA, Merkus HM, Galama
JM. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemi- ology and outcome. Obstet Gynecol Surv 2002; 57: 245-56.
16. Geder K, Lausch R, O’Neill F, Rapp F. Oncogenic transforma-
tion of human embryo lung cells by human cytomegalovirus. Science 1976; 192:1134-7.
J Bras Neurocirurg 22 (1): 66-71, 2011
Silva MCC, Figueiredo EG, Correa C, Cabrera HN, Schimdt M, Teixeira MJ - Papel do citomegalovírus humano (HCMV) na oncomodulação de tumores cerebrais
17. Gibson W. Structure and assembly of the virion. Intervirol. 1996; 39:389-400.
18. Gilbert C, Boivin G. Human cytomegalovirus resistance to anti- viral drugs. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 873-83. 19. Goldmacher VS, Bartle LM, Skaletskaya A, Dionne CA, Keder-
sha NL, Vater CA et al. A cytomegalovirus-encoded mitochon- dria-localized inhibitor of apoptosis structurally unrelated to
bcl-2. Proc Natl Acad Sci uSA 1999; 96:12536–41.
20. Grail A, Norval M. Elution of cytomegalovirus antibodies from
adenocarcinoma of the colon.Gut 1985; 26:1053–8
21. Greijer AE, Dekkers CA, Middeldorp JM. Human cytomegalo- virus virions differentially incorporate viral and host cell RNA during the assembly process. J Virol 2000; 74:9078-82. 22. Hagemann C, Meyer C, Stojic J, Eicker S, Gerngras S, Kühnel
S et al. High efficiency transfection of glioma cell lines and pri- mary cells for overexpression and RNAi experiments. J Neuro- sci Meth 2006; 30:194-202.
23. Hagemeier C, Caswell R, Hayhurst G, Sinclair J, Kouzarides T. Functional interaction between the HCMV IE2 transactivator and the retinoblastoma protein. EMBO 1994; 15:2897-903. 24. Harkins L, Volk AL, Samanta I, Mikolaenko I, Britt WJ, Bland
KI et al. Specific localisation of human cytomegalovirus nucleic acids and proteins in human colorectal cancer. Lancet 2002;
360:1557–63.
25. Hart H, Neill WA, Norval M. Lack of association of cytomega-
lovirus with adenocarcinoma of the colon. Gut 1982; 23:21–30.
26. Homman-Loudiyi M, Hultenby K, Britt W, Söderberg-Nauclér C. Envelopment of human cytomegalovirus occurs by budding into Golgi-derived vacuole compartments positive for gB, Rab 3, trans- golgi network 46, and mannosidase II. J Virol 2003; 77:3191-203. 27. Hume AJ, Finkel JS, Kamil JP, Coen DM, Culbertson MR, Kalejta RF. Phosphorylation of retinoblastoma protein by viral protein with
cyclin-dependent kinase function. Science 2008; 320: 797 – 99.
28. Hume AJ, Ishiwata I, Ishiwata C, Ishiwata E, Iguchi M, Sato Y et al. Establishment and characterization of human glioblastoma cell line (HUBT-n). Cell 2005; 18:59-65.
29. Ishiwata I, Ishiwata C, Ishiwata E, Iguchi M, Sato Y, Sonobe M et al. Establishment and characterization of human glioblastoma cell line (HUBT-n). Hum Cell 2005; 18:59-6.
30. Jarvis MA, Nelson JA. Human cytomegalovirus persistence and latency in endothelial cells and macrophages. Curr Opin Micro- biol 2002; 5: 403-7.
31. Johnson RA, Yurochko AD, Poma EE, zhu L, huang ES. Do-
main mapping of the human cytomegalovirus IE1-72 and cel- lular p107 protein-protein interaction and the possible functional consequences. J Gen Virol 1999; 80:1293-303.
32. Kalejta RF, Bechtel JT, Shenk T. Human cytomegalovirus pp71 stimulates cell cycle progression by inducing the proteasome- dependent degradation of the retinoblastoma family of tumor suppressors. Mol Cell Biol 23:1885-95.
33. Landini MP, Severi B, Furlini G, Badiali De Giorgi L. Human cytomegalovirus structural components: intracellular and intra- viral localization of p28 and p65-69 by immunoelectron micros- copy. Virus Res 1987; 8:15-23.
34. Lau SK, Chen YY, Chen WG, Diamond D, Mamelak A , zaia,
JA et al. Lack of association of cytomegalovirus with human
brain tumors. Mod Pathol 2005; 18:838–843.
35. Luo MH , Fortunato EA. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. J Virol 2007; 81:10424-36.
36. Maussang D, Verzijl D, van Walsum M, Leurs R, Holl J, Ples- koff O et al. Human cytomegalovirus-encoded chemokine re- ceptor US28 promotes tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 29:13068-73.
37. Merlo LM, Pepper JW, Reid BJ, Maley CC. Cancer as an evolu- tionary and ecological process. Nat Rev Cancer 2006; l6:924-35. 38. Michaelis M, Doerr HW, Cinatl J Jr. The story of human cy-
tomegalovirus and cancer: increasing evidence and open ques-
tions. Neoplasia 2009; 11:1–9.
39. Mitchell DA, Xie W, Schmittling R, Learn C, Friedman A, McLendon RE et al. Sensitive detection of human cytomegalo-