Propriedades gerais

As bactérias possuem uma classe de proteínas que constituem subunidades dissociáveis da RNA polimerase denominadas fatores sigma (σ). O cerne da RNA polimerase bacteriana, denominado RNAP, não apresenta por si só afinidade específica pelo DNA, e é constituído por 5 subunidades (α2, β, β’ e ω) (Figura 1A). Já a holoenzima da RNA polimerase, constituída pelo cerne mais uma subunidade de fator sigma, é capaz de reconhecer promotores gênicos e ativar a transcrição de forma específica (Figura 1B) (Helmann, 2002; Paget & Helmann, 1998). Portanto, os fatores sigma funcionam como reguladores globais que asseguram a expressão coordenada de conjuntos gênicos (regulons) fisiologicamente ou desenvolvimentalmente relacionados (Nesvera & Pátek, 2008).

Figura 1. Associação entre a RNA polimerase bacteriana e o fator de regulação transcricional σ. A) A holoenzima da RNA polimerase bacteriana confere especficidade no reconhecimento de seqüencias consensos -10 e -35 dos promotores gênicos. B) Etapas necessárias para a iniciação da transcrição pela RNA polimerase. Primeiramente, a holoenzima da RNAP se liga ao promotor para formar o complexo fechado, e então mudanças conformacionais abrem o complexo permitindo a ligação à região -10 do promotor. Em seguida, a holoenzima inicia a produção de pequenas moléculas de RNA (2 a 12 pb) dando origem ao complexo ternário. Finalmente, o fator σ é liberado e a RNAP inicia a transcrição da molécula de RNA. Adaptado: Paget & Helmann, Genome Biology. 4(203), 2003;

Wösten, FEMS Microbiology Reviews. 22, 1998.

A)

B)

As eubactérias possuem pelo menos um fator sigma principal ou primário, pertencente à família σ⁷⁰, ativador da transcrição da maioria dos genes essenciais ao crescimento exponencial em meio mínimo, sob condições ótimas de cultivo (genes housekeeping) (Halgasova et al., 2001). Por exemplo, o σ^A de Bacillus subtilis e o σ⁷⁰ codificado pelo rpoD de Escherichia coli são fatores sigma reguladores da transcrição de genes essenciais às respectivas espécies. No entanto, a exposição a estímulos ambientais particulares pode alterar a transcrição gênica através de um mecanismo no qual a subunidade σ primária ligada ao cerne da RNA polimerase é substituída por um fator sigma alternativo (Helman, 2002; Kazmierczak et al., 2005).

Com exceção daqueles pertencentes à família σ⁵⁴, os fatores σ alternativos estão estruturalmente relacionados à família σ⁷⁰, constituindo três classes distintas: (i) a dos σ ativadores de mecanismos gerais de resposta a estresse, que apresentam grande similaridade estrutural com os fatores σ primários; (ii) a dos σ envolvidos principalmente nas alterações morfológicas do organismo, como formação de estruturas flagelares e esporulação; (iii) a dos fatores σ ECF (Extracitoplasmic function), os quais estão envolvidos na ativação de mecanismos de adaptação às mudanças do ambiente extracelular (Kazmierczak et al., 2005; Potvin et al., 2008).

Uma vez que o regulon de um único fator σ pode ser compreendido por centenas de genes, os fatores σ proporcionam mecanismos efetivos para a regulação simultânea da expressão de vários genes bacterianos. Em alguns casos, os genes que compreendem o regulon de um fator σ possuem uma função primária claramente definida (por exemplo, genes regulados pelos fatores σ de esporulação em Bacillus subtilis); em outros, os genes que compreendem um regulon podem contribuir para funções múltiplas da fisiologia do organismo (por exemplo, a regulação dos genes de resposta geral ao estresse e dos genes expressos na fase estacionária pelo fator σ^B de Listeria monocytogenes) (Helmann, 2002;

Kazmierczak et al., 2005).

Um dos primeiros fatores σ alternativos identificados foi o σ^B de B. subtilis.

Pertencente à família σ⁷⁰, seus domínios protéicos são similares aos dos fatores σ primários.

Em C. glutamicum, a expressão gênica global de linhagens de C. glutamicum deficientes e proficientes para sigB foi avaliada pelo emprego da técnica de microarranjo de DNA. Uma

Há vários estudos indicando que o fator σ^B está relacionado a mecanismos gerais de resposta a estresses. O σ^B de Bacillus subtillis é responsável pela regulação da transcrição de pelo menos 127 genes envolvidos em funções variadas, dentre as quais se destacam a resistência ao etanol, às temperaturas elevadas (heat shock) e à acidez. (Kazmierczak et al., 2005). O gene sigB de C. glutamicum é expresso principalmente durante a transição das culturas da fase de crescimento exponencial para a fase estacionária, enquanto ocorre simultaneamente a redução da expresão de sigA (Larish et al., 2007; Nesvera & Pátek, 2008). Há ainda várias evidêncas para o envolvimento de σ^B de C. glutamicum na resposta aos estresses ácido, osmótico, alcoólico e de temperatura, sendo que o gene sigB é provavelmente regulado por um σ alternativo de função extracitolasmática (ECF) (Nesvera &

Pátek, 2008).

Os σ ECF se destacam dentre os fatores alternativos da família σ⁷⁰ por compreenderem proteínas relativamente compactas que frequentemente controlam processos relacionados ao envelope celular bacteriano, incluindo secreção, síntese de exopolissacarídeos, influxo/efluxo de ferro, e síntese de proteases extracelulares (Helmann, 2002). A transcrição de cada gene codificador de σ^ECF pode ser regulada pelo próprio fator sigma que está sendo produzido ou por um ou mais fatores sigma distintos. Geralmente os fatores sigma são cotranscritos com seus respetivos ligantes anti-sigma, os quais atuam como reguladores negativos. Os fatores anti-sigma se desligam dos fatores σ na presença de sinais específicos de mudança no ambiente extracelular (Nesvera & Pátek, 2008).

Análises comparativas entre seqüencias genômicas bacterianas disponíveis em bancos de dados revelaram uma ampla variação no número de genes de fatores σ ECF entre diversos microrganismos: 2 em E. coli, 7 em B. subtilis, 10 em M. tuberculosis e 50 em Streptomyces coelicolor (Helmann, 2002). Um trabalho recente buscou avaliar se há um conjunto mínimo de genes de fatores σ ECF necessários para o crescimento vegetativo de B. subtilis. Nesse estudo, foram mutados todos os 7 genes de fatores σ ECF do genoma de uma mesma linhagem de B. subtilis, a qual interessantemente demonstrou ser viável na ausência de estresses, sendo ainda capaz de esporular como a bactéria selvagem (Asai et al., 2008).

Um dos fatores σ ECF de corinebactéria envolvido na adaptação a situações geradoras de estresse é o σ^M de C. glutamicum. Análises de microarranjo de DNA envolvendo uma linhagem desta espécie desprovida de σ^M (∆sigM) revelaram que este fator regula a atividade dos genes codificadores das proteínas tiorredoxina e SufR, ambas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo resultante da modificação de grupos tiol (-SH).

Além disso, o σ^M também ativa a expressão de genes envolvidos na resposta ao estresse

causado por heat shock, como groES, groEL e clpB. Nesta condição, a frequência de formação de proteínas que não atingem sua conformação correta é maior, sendo desencadeada a ativação de chaperonas moleculares e de proteases do complexo Clp (Ventura et al., 2006).

O estudo de diversas sequências gênicas revelou que os promotores reconhecidos por σ^M e σ^H contêm sequências consenso a -10 e -35 similares entre si (Nesvera & Pátek, 2008), podendo indicar algum envolvimento de σ^H com a resposta ao estresse oxidativo.

Resultados interessantes foram alcançados por Nakunst et al. (2007) após a deleção do gene sigH de C. glutamicum. Foi demonstrado que a indução de estresses decorrentes da variação da temperatura e da oxidação de grupos tiólicos provoca o aumento da expressão de sigM apenas na linhagem selvagem, indicando que este gene é provavelmente regulado pelo fator σ^H. No entanto, como σ^M e σ^H reconhecem promotores estruturalmente parecidos, é provável que a expressão de sigM também seja auto-regulada (Nesvera & Pátek, 2008).

Os dados obtidos até então acerca da resposta ao estresse em C. glutamicum apontam para o fato de que, durante o heat shock, as células se preparam para uma possível ocorrência de ROS (Reactive oxygen species), cujas concentrações podem se elevar sob diversas situações de estresse ambiental (Nesvera & Pátek, 2008).