Dissertação de Mestrado

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

Dissertação de Mestrado

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES CODIFICADORES DE FATORES SIGMA DE

Corynebacterium pseudotuberculosis EM

RESPOSTA A AGENTES GERADORES DE ESTRESSE OXIDATIVO

ORIENTADO: Thiago Luiz de Paula Castro ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Azevedo

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi

Thiago Luiz de Paula Castro

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES CODIFICADORES DE FATORES SIGMA DE

Corynebacterium pseudotuberculosis EM

RESPOSTA A AGENTES GERADORES DE ESTRESSE OXIDATIVO

ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Azevedo CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi

BELO HORIZONTE Outubro de 2009

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre pelo programa de Pós- Graduação em Genética, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação de mestrado ao meu pai Sylvio Mauro, à minha mãe Maria Lúcia, aos meus irmãos Júlio César e Fabiana de Castro, e a todos os demais familiares, que tanto

sempre me apoiaram.

AGRADECIMENTOS

Aos professores Vasco Azevedo e Anderson Miyoshi, pela importante orientação dada durante todos esses anos;

Ao Luis Pacheco, pelo seu inestimável auxílio e companheirismo;

À Núbia Seyffert, pelos ótimos momentos proporcionados e pelo considerável apoio prestado;

À professora Juliana Calábria, por gentilmente oferecer o seu laboratório para a realização de experimentos de real-time PCR;

Às agências de fomento de pesquisa, CNPq, FAPEMIG e CAPES;

Ao Leonardo Almeida, pela paciência e boa vontade em auxiliar a realização deste trabalho;

Aos grandes amigos do Laboratório de Genética Celular e Molecular, que sempre estarão na minha memória;

Aos colegas do Departamento de Biologia Geral e da Escola de Engenharia da UFMG;

A todos os familiares e amigos que gastaria páginas citando...

SUMARIO

LISTA DE FIGURAS ... I LISTA DE TABELAS ... III LISTA DE ABREVIATURAS ... IV

RESUMO ... 1

ABSTRACT...2

1. Introdução ... 3

1.1. Linfadenite caseosa ... 4

1.2. Corynebacterium pseudotuberculosis ... 6

1.2.1. Aspectos microbiológicos gerais ... 6

1.2.2. Determinantes moleculares de virulência e patogenicidade ... 7

1.3. Fatores sigma bacterianos ... 8

1.3.1. Propriedades gerais ... 8

1.3.2. Envolvimento na virulência ... 12

1.4. O estresse oxidativo ... 10

1.4.1 Respostas bacterianas ao estresse oxidativo ... 10

1.4.1.1. Mecanismos de tolerância ao peróxido de hidrogênio ... 11

1.4.1.2. Resistência ao íon superóxido ... 11

1.4.1.3. Resistência à oxidação de grupos tiólicos... 12

1.4.1.4. Resposta à oxidação da molécula de DNA ... 13

1.4.2. Oxidação promovida por agentes xenobióticos ... 14

1.5. PCR em tempo real (qPCR) ... 21

1.6. Justificativa de realização do trabalho ... 23

2. Objetivos ... 24

2.1. Objetivo geral ... 20

2.2. Objetivos específicos ... 20

3. Material e Métodos ... 21

3.1. Equipamentos utilizados ... 22

3.2. Reagentes utilizados ... 23

3.6. Determinação das condições experimentais ... 32

3.6.1. Identificação dos fatores sigma de C. pseudotuberculosis ... 32

3.6.2. Confecção de oligonucleotídeos iniciadores ... 32

3.6.3. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo .. 33

3.7. Avaliação de expressão gênica diferencial ... 39

3.7.1. Amostragem utilizada para obtenção de RNA total ... 39

3.7.2. Extração de RNA total de C. pseudotuberculosis ... 39

3.7.3. Ensaios de transcrição reversa e PCR quantitativa (RT-qPCR) ... 40

3.7.3.1. Transcrição reversa do RNA extraído ... 41

3.7.3.2. Seleção de controle endógeno de normalização para qPCR ... 41

3.7.3.3. Determinação da eficiência de amplificação dos iniciadores... 43

3.7.3.4. Reações para quantificação relativa e análise de expressão diferencial ... 43

3.7.3.5. Análise da especificidade das reações de qPCR...44

4. Resultados ... 45

4.1. Identificação dos fatores sigma de C. pseudotuberculosis ... 46

4.2. Susceptibilidade de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo ... 49

4.2.1. Efeito causado pela adição de peróxido de hidrogênio a cultivos de C. pseudotuberculosis ... 49

4.2.2. Efeito causado pela plumbagina a cultivos de C. pseudotuberculosis ... 52

4.3. Avaliação da expressão gênica diferencial ... 56

4.3.1. Determinação das concentrações dos agentes de estresse para as análises de expressão gênica diferencial ... 56

4.3.2. Cultivos de C. pseudotuberculosis submetidos ao peróxido de hidrogênio e à plumbagina para extração de RNA ... 57

4.3.3. RNA total obtido e transcrição reversa ... 60

4.3.4. Reações de PCR quantitativa ... 61

4.3.4.1. Eficiência de amplificação para os iniciadores utilizados ... 61

4.3.4.2. Gene 16s rDNA como controle endógeno ... 63

4.3.4.3. Especificidade das reações de qPCR: curvas de dissociação ... 64

4.3.4.4. Especificidade das reações de qPCR: eletroforese em gel de agarose ... 65

4.3.4.5. Validação da ausência de DNA genômico...66

4.3.4.6. Expressão gênica diferencial em resposta ao estresse causado por peróxido de hidrogênio ... 68

4.3.4.7. Expressão gênica diferencial em resposta ao estresse causado pela plumbagina ... 73

5. Discussão ... 78

6. Conclusão e perspectivas... 85

7. Referências ... 88

8. Anexos ... 61

8.1. Suplemento: resposta de C. pseudotuberculosis ao estresse oxidativo...100

8.1.1. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis ao estresse gerado por peróxido de hidrogênio, plumbagina e dicloreto de paraquat...100

8.1.2. Níveis de expressão dos genes codificadores de fatores sigma de C. pseudotuberculosis em resposta ao estresse gerado por H₂O₂ (100 mM), plumbagina (50 µM) e dicloreto de paraquat (150 µM)...103

8.2. Curriculum vitae...105

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Associação entre a RNA polimerase bacteriana e o fator de regulação transcricional σ... 9 Figura 2. Estruturas químicas da menadiona, da plumbagina e do Paraquat...20 Figura 3. Crescimento da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosis em caldo BHI com Tween^® 80...34 Figura 4. Representação esquemática da etapa inicial de curva de crescimento para avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a agentes de estresse...36 Figura 5. Esquema ilustrativo dos procedimentos adotados para o monitoramento das curvas de crescimento em intervalos de tempo específicos...38 Figura 6. Análise de domínios conservados dos fatores sigma identificados...47 Figura 7. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis ao peróxido de hidrogênio 150 mM...50 Figura 8. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 40 mM de peróxido de hidrogênio...51 Figura 9. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 50 µM de plumbagina...53 Figura 10. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 25 µM de plumbagina...54 Figura 11. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 15 µM de plumbagina...55 Figura 12. Avaliação suplementar da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 40 mM de peróxido de hidrogênio, referente ao experimento de análise da transcrição gênica...58 Figura 13. Avaliação suplementar da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 15 µM de plumbagina, referente ao experimento de análise da transcrição gênica...59 Figura 14. Determinação da eficiência de amplificação para os pares de iniciadores utilizados nos ensaios de qPCR...62 Figura 15. Curvas geradas a partir da amplificação de transcritos do gene 16s rDNA referentes ao T1 (15 min) de exposição ao peróxido de hidrogênio 40 mM...63 Figura 16. Curvas de dissociação contínua obtidas para os transcritos relativos ao gene sigA...65

Figura 17. Resolução em gel de agarose 1,5% de produtos amplificados por qPCR para os 12 pares de iniciadores utilizados ...66 Figura 18. Ausência de amplificação por qPCR dos produtos de RNA extraídos de C.

pseudotuberculosis tratados com RNase...67 Figura 19. Comparação entre Cts obtidos para os genes sigK e 16s rDNA após 270 min (T5) de exposição ao peróxido de hidrogênio 40 mM...69 Figura 20. Níveis de expressão gênica diferencial - LN(2^-∆∆Ct) - após 15, 60, 180 e 270 min de exposição a 40 mM de peróxido de hidrogênio...72 Figura 21. Níveis de expressão gênica diferencial - LN(2^-∆∆Ct) - após 15, 60, 180 e 270 min de exposição a 15 µM de plumbagina...76 Figura 22. Representação esquemática das alterações dos níveis transcricionais dos genes codificadores de fatores sigma, catalase, PMSR e Zn-SOD, em resposta à exposição ao peróxido de hidrogênio e à plumbagina...77 Figura 23. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis às concentrações de 50 µM e 100 µM de plumbagina...100 Figura 24. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis às concentrações de 150 µM e 200 µM de paraquat...101 Figura 25. Avaliação da susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a 150 µM de paraquat conforme duas réplicas biológicas distintas...102 Figura 26. Expressão gênica diferencial de C. pseudotuberculosis após 15 min de exposição a 100 mM de peróxido de hidrogênio...103 Figura 27. Expressão gênica diferencial de C. pseudotuberculosis após 15 min de exposição a 50 µM de plumbagina...104 Figura 28. Expressão gênica diferencial de C. pseudotuberculosis após 15 min de exposição a 150 µM de paraquat...104

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Exemplos de fatores sigma alternativos envolvidos na virulência de diferentes bactérias patogênicas...14 Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados, seus alvos e tamanhos dos produtos amplificados esperados...33 Tabela 3. Agentes geradores de estresse oxidativo utilizados nas curvas de crescimento...37 Tabela 4. Reagentes e suas quantidades utilizadas nas reações de qPCR...42 Tabela 5. Parâmetros selecionados em termociclador “7500 Real-Time PCR System” para o processamento das reações de q-PCR...42 Tabela 6. Fatores σ identificados em C. pseudotuberculosis e suas principais características...48 Tabela 7. Impacto dos agentes de estresse testados sobre o crescimento em cultivos de C.

pseudotuberculosis...56 Tabela 8. Rendimentos das extrações de RNA total e quantidades empregadas nas reações de transcrição reversa...60 Tabela 9. Valores de Cts obtidos segundo a amplificação de cDNA relativo ao gene 16s rDNA...64 Tabela 10. Valores de ∆Ct calculados para a normalização dos Cts obtidos para as amplificações por qPCR, relativos ao estresse induzido pelo peróxido de hidrogênio a 40 mM...70 Tabela 11. Valores de 2^-∆∆Ct calculados para cada gene e tempo de análise após a exposição a 40 mM de peróxido de hidrogênio...71 Tabela 12. Valores de ∆Ct calculados para a normalização dos Cts obtidos para as amplificações por qPCR relativas ao estresse induzido pela plumbagina a 15 µM...74 Tabela 13. Valores de 2^-∆∆Ct calculados para cada gene e tempo de análise após a exposição a 15 µM de plumbagina...75

LISTA DE ABREVIATURAS

 Ahp - Alquil hidroperóxido redutase

 BHI - Brain Heart Infusion

 BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

 cDNA - DNA complementar

 CMN - Corynebacterium-Mycobacterium-Nocardia

 cm² - Centímetro quadrado

 Ct - Cycle threshold

 Cu - Cobre

 CXXC - Motivo protéico com dois resíduos de cisteína

 DNA - Ácido desoxirribonucléico

 dNTPs - Desoxirribonucleotídeos trifosfatados

 DMSO - Dimetilsulfóxido

 DEPC - Dietilpirocarbonato

 DO - Densidade óptica

 2-ME - 2-mercaptoetanol

 ECF - Extracitoplasmic function

 EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético

 EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

 Fe - Ferro

 Fe-S - Ferro-enxofre

 g - Grama

 GSH - Glutationa

 HCl - Ácido clorídrico

 HOCl - Ácido hipocloroso

 IFN-g - Interferon-gama

 Kg - Quilograma

 L - Litro

 LN - Logaritmo natural

 M - Molar

 Min - Minuto

 mg - Miligrama

 mL - Mililitros

 mM - Milimolar

 Mn - Manganês

 MSH - Micotiol

 NOX2 - Oxidase fagocítica

 NaCl - Cloreto de sódio

 NaOH - Hidróxido de sódio

 ng - Nanograma

 nm - Nanômetro

 NTC - No-template control

 O2 - Oxigênio

 O2.-

- Superóxido

 O3 - Ozônio

 ¹O2 - Oxigênio singlete

 Obs - Observação

 OH - Hidroxila

 Ohr - Organic hydroperoxide resistance

 ORF - Open reading frame

 ºC - Grau Celsius

 pb - Pares de bases

 PCR - Polymerase chain reaction

 PEG - Polietilenoglicol

 pH - Potencial hidrogeniônico

 pM - Picomol

 PMSR - Redutase de sulfóxido de metionina peptídica

 qPCR - Quantitative PCR

 qsp - Quantidade suficiente para

 rDNA - DNA codificador do RNA ribossomal

 ROS - Reactive oxygen species

 RGMG - Rede Genoma de Minas Gerais

 rpm - Revoluções por minuto

 RNA - Ácido ribonucléico

 RNAP - RNA polimerase

 RT- qPCR - Quantitative reverse transcription-PCR

 SDS - Dodecilsulfato de sódio

 sig - Sigma (σ)

 SOD - Superóxido dismutase

 Taq - Thermus aquaticus

 TBE - Tris-borato-EDTA

 ufc - Unidade formadora de colônia

 µg - Micrograma

 µL - Microlitro

 µM - Micromolar

 Zn - Zinco

 -SH - Grupo tiol

 vf - Volume final

RESUMO

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa - doença que acomete os pequenos ruminantes e causa grandes prejuízos para a ovinocaprinocultura mundial. A persistência de C. pseudotuberculosis dentro de fagolisossomos, durante infecção de macrófagos, aponta para a ativação de importantes mecanismos nessa bactéria envolvidos na adaptação ao estresse gerado pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Em resposta às condições ambientais adversas, como na presença de agentes oxidantes, os fatores sigma alternativos da RNA polimerase bacteriana são ativados e desencadeiam a transcrição de genes responsáveis pelas modificações fisiológicas necessárias à sobrevivência e até mesmo à virulência e patogenicidade. Nesse contexto, o presente trabalho procurou investigar o envolvimento dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta ao estresse oxidativo gerado in vitro. Curvas de crescimento demonstraram que a adição de peróxido de hidrogênio (a 40 mM) ou plumbagina (a 15 µM) leva a uma redução de cerca de 30% no crescimento bacteriano, quando o estresse é induzido na fase exponencial inicial (DO_600nm = 0,2). Nos intervalos de 15, 60, 180 e 270 minutos após a adição desses agentes, nas concentrações supracitadas, foram isoladas alíquotas das culturas, das quais foi extraído RNA total. Os cDNAs gerados por transcrição reversa in vitro foram submetidos a ensaios de qPCR (quantitative PCR) para a quantificação relativa dos transcritos de 11 genes: sigA, sigB, sigC, sigD, sigE, sigH, sigK, sigM, catalase, PMSR e Zn- SOD. Os resultados alcançados sugerem que os fatores σ^H, σ^M e σ^B podem desempenhar importante papel na adaptação de C. pseudotuberculosis à condição oxidante gerada nos ambientes intra e extracelular. A variação temporal nos níveis transcricionais observados para os genes catalase, PMSR e Zn-SOD aparentemente se relacionam às alterações temporais nos níveis de expressão do gene sigM, quando há exposição ao estresse oxidativo. Além disso, os fatores σ^C e σ^K estão possivelmente envolvidos na resposta ao estresse oxidativo em C. pseudotuberculosis, o que ainda não foi claramente descrito para outras bactérias Gram-positivas.

ABSTRACT

Corynebacterium pseudotuberculosis is the aethiological agent of Caseous Lymphadenitis, a disease that affects sheep and goats in many parts of the globe and is responsible for huge economical losses in herds. The persistence of C. pseudotuberculosis inside fagolisossomes indicates the activation of important mechanisms in this bacterium to counteract the actions taken by reactive oxygen/nitrogen species. In response to environmental changes, as emergence of oxidant/nitrosant stress conditions, specific sigma factors of bacterial RNA polymerases can be activated, promoting the transcription of genes that are necessary for physiologic regulation, which turn might be important for virulence and pathogenicity. Considering this, the present work aimed to investigate sigma factors required for the response of C. pseudotuberculosis after exposure to in vitro oxidative stress. Kinetic curves indicates decrease of around 30% in growth when initial exponential C.

pseudotuberculosis cultures (OD600nm = 0,2) are exposed to 40 mM hydrogen peroxide or 15 µM plumbagin, during 360 minutes. In intervals of 15, 60, 120 and 270 minutes after addition of hydrogen peroxide or plumbagin, cultures samples were subjected to total RNA extraction. Reverse transcription was performed in vitro and cDNAs obtained were applied in quantitative real time-PCR analisys for evaluating transcriptional levels of 11 genes: sigA, sigB, sigC, sigD, sigE, sigH, sigK, sigM, catalase, PMSR and Zn-SOD. Results suggest the factors σ^H, σ^M e σ^B might play an important role in C. pseudotuberculosis adaptation when there are oxidizing conditions in intra or extracitoplasmic environments. The transcriptional temporal variations concerning non-sigma factors genes are apparently related to the profiles observed for sigM expression, during exposure to stress. Besides this, factors σ^C and σ^K are probably involved in response to oxidative stress, what is not clearly described for other Gram-positives.

1. Introdução

1.1. Linfadenite caseosa

A linfadenite caseosa (LC), enfermidade que acomete populações de pequenos ruminantes em todo o mundo, é causada por Corynebacterium pseudotuberculosis. perdas econômicas tais como redução da produção de lã, carne e leite, redução da capacidade reprodutiva dos animais e a condenação da pele e das carcaças nos abatedouros são apontadas como os principais problemas dessa patogenia na caprino e ovinocultura (Arsenault et al., 2003; Dorella et al., 2006a). Considerando-se, por exemplo, que o Brasil arrecadou cerca de 7,4 milhões de dólares no ano 2000 relativos à exportação de peles de caprinos e ovinos, é evidente que a LC pode levar à estagnação ou mesmo ao recuo desta e de outras atividades econômicas relacionadas à atividade da ovinocaprinocultura (EMBRAPA¹).

Os prejuízos causados pela LC acometem principalmente as áreas onde a atividade da ovinocaprinocultura é intensa. Na Europa, a LC apresenta ampla distribuição, estando presente em países como Inglaterra, França, Holanda e Espanha (Baird & Fontaine, 2007;

Ruiz L. et al., 2007). Na Austrália, inspeções em abatedouros revelaram prevalência da doença de 20% a 29% entre ovinos (Paton et al., 2003). Casos de LC também são frequentes na África e em países americanos, como Canadá, Estados Unidos, Cuba e Venezuela (Baird & Fontaine, 2007; Ruiz et al., 2007).

O Brasil é detentor de 3% do rebanho mundial de caprinos e ovinos. (EMBRAPA Semi-Árido, 2008). No país, a LC é conhecida principalmente por afetar a região nordeste, onde se encontra a maior parte dos rebanhos caprinos brasileiros (Faria et al., 2004). De acordo com Unanian et al. (1985), 41,6% dos caprinos desta região apresentam abscessos superficiais palpáveis, enquanto que lesões em orgãos internos estão presentes em cerca de 11% dos animais. No entanto, etudos epidemiológicos recentes têm mostrado dados alarmantes quanto à incidência da doença também na região sudeste. A prevalência da LC entre ovelhas no estado de São Paulo chega a 71%, enquanto a prevalência em Minas Gerais, estado onde a ovinocultura tem apresentado grande crescimento, é de aproximadamente 75,8% entre ovinos (Guimarães et al., 2009) e 78,9% entre caprinos (Seyffert et al., 2009).

lesões intra-torácicas decorrentes da LC sugere que a transmissão possa se dar através do contato do ar expelido pelos animais infectados com a pele dos animais recém-tosados (Kuria et al., 2001; Dorella et al., 2006a).

A infecção por C. pseudotuberculosis nos pequenos ruminantes geralmente acomete o sistema linfático, dando origem à forma mais freqüente da LC, caracterizada pela manifestação externa. A LC superficial é acompanhada da formação de abscessos em nódulos linfáticos e tecidos subcutâneos. (Piontkowski & Shivvers, 1998; Williamson, 2001).

Uma vez transmitida, a bactéria é drenada para o linfonodo mais próximo ao sítio da infecção no animal, tanto em sua forma livre quanto fagocitada. Em seguida, macrófagos e células polimorfonucleares se acumulam no linfonodo e fagocitam o patógeno, no entanto, a multiplicação das bactérias no ambiente intracelular ocasiona a morte das células hospedeiras e origina lesões pirogranulomatosas. Posteriormente, várias dessas lesões coalescem para a formação de um ou mais granulomas, resultando no acúmulo de material caseoso que permanece encapsulado e contido (Batey, 1986; Kuria et al., 2001).

Eventualmente, a infecção atinge os órgãos internos do animal, como pulmões, rins, fígado, útero e baço. Quando isso acontece, a formação dos abscessos pode se tornar sistêmica, caracterizando a LC visceral (Piontkowski & Shivvers, 1998).

C. pseudotuberculosis é sensível a diversos antibióticos in vitro, porém, a natureza caseosa do pus decorrente da infecção e as cápsulas espessas que envolvem os abscessos protegem as bactérias da ação dos antimicrobianos in vivo, dificultando o tratamento da LC (Williamson, 2001). O procedimento mais indicado para o controle da doença nos rebanhos inclui a remoção dos animais infectados e a vacinação dos animais sadios (Guimarães et al.

2009). Ainda assim, tais medidas são ineficazes para o controle da donça, considerando-se que a detecção do patógeno nos animais infectados ocorre em estágio clínico avançado e as vacinas comercialmente disponíveis apresentam baixa eficiência de proteção (Dorella et al., 2006a; Dorella et al., 2009).

1.2. Corynebacterium pseudotuberculosis

1.2.1. Aspectos microbiológicos gerais

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva pertencente à Classe Actinobacteria. Os membros desta classe são conhecidos principalmente pelo alto conteúdo de bases nitrogenadas guanina e citosina no cromossomo. Dentre as actinobactérias, os gêneros Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus constituem o grupo CMN (Corynebacterium-Mycobacterium-Nocardia), caracterizado pela organização da parede celular baseada num grande complexo polimérico de peptideoglicano, arabinogalactano e ácido micólico. Algumas espécies do grupo CMN se destacam pelo elevado potencial de emprego biotecnológico - como Corynebacterium glutamicum e Corynebacterium efficiens, importantes produtoras de aminoácidos para a indústria -, mas também há grande destaque para as espécies patogênicas, como Mycobacterium tuberculosis e Corynebacterium diphteriae - causadoras, respectivamente, da tuberculose e da difteria em humanos - e Arcanobacterium pyogenes, Corynebacterium renale e a própria C. pseudotuberculosis, de grande relevância veterinária (Moore et al., 2009 in press).

C. pseudotuberculosis não esporula, não forma cápsula, é imóvel e possui fímbrias.

Reações em testes bioquímicos dos isolados de C. pseudotuberculosis apresentam resultados bastante variados, principalmente no que diz respeito à habilidade de fermentação. C. pseudotuberculosis é fosfolipase e catalase positiva, oxidase negativa e beta-hemolítica (Jones & Collins, 1986; Muckle & Gyles, 1982; Dorella et al., 2006a).

Linhagens isoladas de pequenos ruminantes geralmente não são capazes de reduzir nitrato (Merchant & Packer, 1967; Buxton & Fraser, 1977; Dorella et al., 2006a).

Patógeno intracelular facultativo, a C. pseudotuberculosis é capaz de infectar diversos animais, como cabras, ovelhas, cavalos, alpacas, lhamas, búfalos, camelos, antílopes e primatas (Baird & Fontaine, 2007). Essa bactéria, no entanto, já esteve associada à ocorrência de pelo menos 25 casos de infecção humana até o ano de 2005,

1.2.2. Determinantes moleculares de virulência e patogenicidade

Embora o processo patogênico da LC seja bem entendido, muito pouco foi estudado sobre os determinantes moleculares de patogenicidade da C. pseudotuberculosis (McKean et al., 2005 e 2007a; Dorella et al., 2006b). A virulência desta bactéria é atribuída principalmente à constituição lipídica da parede celular e à fosfolipase D, uma exotoxina com atividade esfingomielinase codificada pelo pld, um gene monocistrônico e de cópia única no cromossomo (Williamson, 2001; McKean et al., 2007a). Infecções experimentais demonstraram que linhagens de C. pseudotuberculosis mutantes para o gene pld são incapazes de causar os abscessos típicos da LC e de se disseminar dentro do hospedeiro, revelando o papel fundamental da toxina para o estabelecimento da enfermidade (Hodgson et al., 1992). Estudos recentes indicam que a expressão do pld é reduzida quando a C.

pseudotuberculosis é exposta ao choque térmico (43°C) e aumentada quando a bactéria infecta macrófagos (McKean et al., 2007a e 2007b).

Outros genes/fatores possivelmente envolvidos na virulência da C.

pseudotuberculosis têm sido descritos recentemente. Billington et al. (2002) identificaram um sistema de permease do ferro codificado pelo operon fagABC e pelo gene fagD. Caprinos infectados com uma linhagem de C. pseudotuberculosis mutante para o gene fagB(C) não desenvolveram abscessos, indicando que uma deficiência no sistema de captação do ferro prejudica a sobrevivência da bactéria dentro do hospedeiro (Billington et al., 2002).

Utilizando-se da técnica de “Indução Diferencial de Fluorescência” (DFI), McKean et al.

(2005) identificaram dois genes que são ativados na C. pseudotuberculosis apenas durante a infecção de macrófagos: um deles codifica uma sintetase peptídica não-ribossômica e o outro codifica uma subunidade da enzima propionil-CoA-carboxilase.

Através de inserções do elemento transponível “TnFuZ” no cromossomo da C.

pseudotuberculosis, foram identificados, em nosso laboratório, vários genes codificadores de proteínas exportadas, dentre as quais se destacam aquelas envolvidas na captação de ferro e na formação de adesinas e fímbrias, estruturas importantes para os estágios iniciais de infecção (Dorella et al., 2006b). Linhagens mutantes para esses fatores exportados têm apresentado virulência reduzida e a capacidade de induzir resposta imunológica protetora em animais previamente imunizados tem sido animadora (Dorella, 2009).

Patógenos intracelulares, como C. pseudotuberculosis, devem se adaptar às diferentes condições ambientais durante o curso da infecção, além de resistir à resposta adaptativa do hospedeiro. Especificamente, a C. pseudotuberculosis é capaz de sobreviver

às condições adversas do meio ambiente por até oito meses, antes de infectar um organismo hospedeiro (Dorella et al., 2006a; Baird & Fontaine, 2007). Durante o processo infeccioso, essa bactéria também é exposta a uma gama de diferentes ambientes, desde o ponto de entrada no hospedeiro, passando pelo sistema linfático, até a replicação intracelular dentro de macrófagos e o estabelecimento de lesões dentro dos órgãos (McKean et al., 2007a; 2007b). Diferentemente de patógenos como M. tuberculosis e Brucella abortus, a C. pseudotuberculosis não impede a fusão entre o fagossomo e o lisossomo nos macrófagos, se destacando sua capacidade de resistir ao ambiente com baixo pH, alta atividade proteolítica e de grande potencial oxidativo existente dentro do fagolisossomo (Tashjian & Campbell, 1983; Rohde et al., 2007).

1.3. Fatores sigma bacterianos

1.3.1. Propriedades gerais

As bactérias possuem uma classe de proteínas que constituem subunidades dissociáveis da RNA polimerase denominadas fatores sigma (σ). O cerne da RNA polimerase bacteriana, denominado RNAP, não apresenta por si só afinidade específica pelo DNA, e é constituído por 5 subunidades (α2, β, β’ e ω) (Figura 1A). Já a holoenzima da RNA polimerase, constituída pelo cerne mais uma subunidade de fator sigma, é capaz de reconhecer promotores gênicos e ativar a transcrição de forma específica (Figura 1B) (Helmann, 2002; Paget & Helmann, 1998). Portanto, os fatores sigma funcionam como reguladores globais que asseguram a expressão coordenada de conjuntos gênicos (regulons) fisiologicamente ou desenvolvimentalmente relacionados (Nesvera & Pátek, 2008).

Figura 1. Associação entre a RNA polimerase bacteriana e o fator de regulação transcricional σ. A) A holoenzima da RNA polimerase bacteriana confere especficidade no reconhecimento de seqüencias consensos -10 e -35 dos promotores gênicos. B) Etapas necessárias para a iniciação da transcrição pela RNA polimerase. Primeiramente, a holoenzima da RNAP se liga ao promotor para formar o complexo fechado, e então mudanças conformacionais abrem o complexo permitindo a ligação à região -10 do promotor. Em seguida, a holoenzima inicia a produção de pequenas moléculas de RNA (2 a 12 pb) dando origem ao complexo ternário. Finalmente, o fator σ é liberado e a RNAP inicia a transcrição da molécula de RNA. Adaptado: Paget & Helmann, Genome Biology. 4(203), 2003;

Wösten, FEMS Microbiology Reviews. 22, 1998.

A)

B)

As eubactérias possuem pelo menos um fator sigma principal ou primário, pertencente à família σ⁷⁰, ativador da transcrição da maioria dos genes essenciais ao crescimento exponencial em meio mínimo, sob condições ótimas de cultivo (genes housekeeping) (Halgasova et al., 2001). Por exemplo, o σ^A de Bacillus subtilis e o σ⁷⁰ codificado pelo rpoD de Escherichia coli são fatores sigma reguladores da transcrição de genes essenciais às respectivas espécies. No entanto, a exposição a estímulos ambientais particulares pode alterar a transcrição gênica através de um mecanismo no qual a subunidade σ primária ligada ao cerne da RNA polimerase é substituída por um fator sigma alternativo (Helman, 2002; Kazmierczak et al., 2005).

Com exceção daqueles pertencentes à família σ⁵⁴, os fatores σ alternativos estão estruturalmente relacionados à família σ⁷⁰, constituindo três classes distintas: (i) a dos σ ativadores de mecanismos gerais de resposta a estresse, que apresentam grande similaridade estrutural com os fatores σ primários; (ii) a dos σ envolvidos principalmente nas alterações morfológicas do organismo, como formação de estruturas flagelares e esporulação; (iii) a dos fatores σ ECF (Extracitoplasmic function), os quais estão envolvidos na ativação de mecanismos de adaptação às mudanças do ambiente extracelular (Kazmierczak et al., 2005; Potvin et al., 2008).

Uma vez que o regulon de um único fator σ pode ser compreendido por centenas de genes, os fatores σ proporcionam mecanismos efetivos para a regulação simultânea da expressão de vários genes bacterianos. Em alguns casos, os genes que compreendem o regulon de um fator σ possuem uma função primária claramente definida (por exemplo, genes regulados pelos fatores σ de esporulação em Bacillus subtilis); em outros, os genes que compreendem um regulon podem contribuir para funções múltiplas da fisiologia do organismo (por exemplo, a regulação dos genes de resposta geral ao estresse e dos genes expressos na fase estacionária pelo fator σ^B de Listeria monocytogenes) (Helmann, 2002;

Kazmierczak et al., 2005).

Um dos primeiros fatores σ alternativos identificados foi o σ^B de B. subtilis.

Pertencente à família σ⁷⁰, seus domínios protéicos são similares aos dos fatores σ primários.

Em C. glutamicum, a expressão gênica global de linhagens de C. glutamicum deficientes e proficientes para sigB foi avaliada pelo emprego da técnica de microarranjo de DNA. Uma

Há vários estudos indicando que o fator σ^B está relacionado a mecanismos gerais de resposta a estresses. O σ^B de Bacillus subtillis é responsável pela regulação da transcrição de pelo menos 127 genes envolvidos em funções variadas, dentre as quais se destacam a resistência ao etanol, às temperaturas elevadas (heat shock) e à acidez. (Kazmierczak et al., 2005). O gene sigB de C. glutamicum é expresso principalmente durante a transição das culturas da fase de crescimento exponencial para a fase estacionária, enquanto ocorre simultaneamente a redução da expresão de sigA (Larish et al., 2007; Nesvera & Pátek, 2008). Há ainda várias evidêncas para o envolvimento de σ^B de C. glutamicum na resposta aos estresses ácido, osmótico, alcoólico e de temperatura, sendo que o gene sigB é provavelmente regulado por um σ alternativo de função extracitolasmática (ECF) (Nesvera &

Pátek, 2008).

Os σ ECF se destacam dentre os fatores alternativos da família σ⁷⁰ por compreenderem proteínas relativamente compactas que frequentemente controlam processos relacionados ao envelope celular bacteriano, incluindo secreção, síntese de exopolissacarídeos, influxo/efluxo de ferro, e síntese de proteases extracelulares (Helmann, 2002). A transcrição de cada gene codificador de σ^ECF pode ser regulada pelo próprio fator sigma que está sendo produzido ou por um ou mais fatores sigma distintos. Geralmente os fatores sigma são cotranscritos com seus respetivos ligantes anti-sigma, os quais atuam como reguladores negativos. Os fatores anti-sigma se desligam dos fatores σ na presença de sinais específicos de mudança no ambiente extracelular (Nesvera & Pátek, 2008).

Análises comparativas entre seqüencias genômicas bacterianas disponíveis em bancos de dados revelaram uma ampla variação no número de genes de fatores σ ECF entre diversos microrganismos: 2 em E. coli, 7 em B. subtilis, 10 em M. tuberculosis e 50 em Streptomyces coelicolor (Helmann, 2002). Um trabalho recente buscou avaliar se há um conjunto mínimo de genes de fatores σ ECF necessários para o crescimento vegetativo de B. subtilis. Nesse estudo, foram mutados todos os 7 genes de fatores σ ECF do genoma de uma mesma linhagem de B. subtilis, a qual interessantemente demonstrou ser viável na ausência de estresses, sendo ainda capaz de esporular como a bactéria selvagem (Asai et al., 2008).

Um dos fatores σ ECF de corinebactéria envolvido na adaptação a situações geradoras de estresse é o σ^M de C. glutamicum. Análises de microarranjo de DNA envolvendo uma linhagem desta espécie desprovida de σ^M (∆sigM) revelaram que este fator regula a atividade dos genes codificadores das proteínas tiorredoxina e SufR, ambas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo resultante da modificação de grupos tiol (-SH).

Além disso, o σ^M também ativa a expressão de genes envolvidos na resposta ao estresse

causado por heat shock, como groES, groEL e clpB. Nesta condição, a frequência de formação de proteínas que não atingem sua conformação correta é maior, sendo desencadeada a ativação de chaperonas moleculares e de proteases do complexo Clp (Ventura et al., 2006).

O estudo de diversas sequências gênicas revelou que os promotores reconhecidos por σ^M e σ^H contêm sequências consenso a -10 e -35 similares entre si (Nesvera & Pátek, 2008), podendo indicar algum envolvimento de σ^H com a resposta ao estresse oxidativo.

Resultados interessantes foram alcançados por Nakunst et al. (2007) após a deleção do gene sigH de C. glutamicum. Foi demonstrado que a indução de estresses decorrentes da variação da temperatura e da oxidação de grupos tiólicos provoca o aumento da expressão de sigM apenas na linhagem selvagem, indicando que este gene é provavelmente regulado pelo fator σ^H. No entanto, como σ^M e σ^H reconhecem promotores estruturalmente parecidos, é provável que a expressão de sigM também seja auto-regulada (Nesvera & Pátek, 2008).

Os dados obtidos até então acerca da resposta ao estresse em C. glutamicum apontam para o fato de que, durante o heat shock, as células se preparam para uma possível ocorrência de ROS (Reactive oxygen species), cujas concentrações podem se elevar sob diversas situações de estresse ambiental (Nesvera & Pátek, 2008).

1.3.2. Envolvimento na virulência

A modulação da expressão gênica tem um papel definitivo nas adaptações e modificações necessárias para a sobrevivência às alterações ambientais extremas e rápidas, sendo portanto crucial para a bactéria realizar uma infecção de sucesso. Nesse contexto, a busca por novos determinantes de virulência tem levado ao estudo das proteínas ativadoras/reguladoras da transcrição de genes específicos em resposta às alterações das condições ambientais (Kazmierczak et al., 2005).

Os fatores σ alternativos podem regular a expressão tanto de genes de virulência, codificadores de proteínas cujas funções são essenciais para a bactéria estabelecer efetivamente uma infecção no organismo hospedeiro, quanto de genes associados à

importante que contribui para a virulência bacteriana (Bashyam & Hasnain, 2004; McKean et al., 2007a).

Foi demonstrado que o fator alternativo σ^B está envolvido na resistência a condições de estresse nas bactérias patogênicas Listeria monocitogenes e B. anthracis, agentes etiológicos da listeriose e da antrax, respectivamente. Em L. monocytogenes, o σ^B participa de uma rede regulatória envolvida na indução da expressão dos genes de internalinas (proteínas que contribuem para a invasão de células de mamíferos) e de outros genes envolvidos na virulência desta bactéria (McGann et al., 2007). Em B. anthracis, a inativação do fator σ^B produziu uma linhagem mutante menos fatal que a linhagem selvagem de acordo com infecções experimentais em camundongos, indicando que o σ^B é um dos fatores associados à virulência deste organismo (Fouet et al., 2000). Outros exemplos de fatores sigma alternativos envolvidos na ativação de mecanismos relacionados à virulência estão relacionados na Tabela 1.

Um exemplo importante de σ ECF envolvido na virulência compreende o fator homólogo de σ^E da bactéria Pseudomonas aeruginosa (gene algU/algT). Isolados patogênicos de P. aeruginosa produzem um exopolissacarídeo abundante conhecido como alginato, que é considerado um dos principais fatores de virulência dessa bactéria. O fator algU, além de controlar a expressão dos genes de resposta ao estresse oxidativo, também regula as enzimas da via de biossíntese do alginato (Potvin et al., 2008). Similarmente, o fator σ^E de Salmonella enterica var. Typhimurium também regula genes que proporcionam resistência ao estresse oxidativo, auxiliando na sobrevivência da bactéria dentro de macrófagos (Kazmierczak et al., 2005). Dessa forma, é evidente a ligação existente entre regulação da transcrição gênica, virulência de microrganismos patogênicos, e resistência ao estresse oxidativo.

O fator σ^K, que também apresenta função extracitoplasmática, é conhecido por seus regulons relativamente pequenos (Bashyam & Hasnain, 2004) e pelo seu importante papel na transcrição de genes codificadores de proteínas imunogênicas, como mpb87 e mpb70 de M. bovis. Algumas linhagens atenuadas desta espécie (conhecidas por BCG) apresentam uma mutação no códon iniciador do gene sigK, a qual está relacionada à fraca expressão deste gene e, como conseqüência, à virulência reduzida da bactéria (Charlet et al., 2005). A corinebactéria de interesse biotecnológico C. glutamicum não possui o fator σ^K, sugerindo que este pode estar envolvido em algum mecanismo de virulência em C.

pseudotuberculosis.

Tabela 1. Exemplos de fatores sigma alternativos envolvidos na virulência de diferentes bactérias patogênicas.

Fator sigma (Família/Classe)

Espécie bacteriana

Família σ ⁷⁰ Resposta a estresses

σ ^B B. anthracis, L. monocytogenes, M. tuberculosis, S. aureus, S.

Epidermidis

σ^S E. coli, P. aeruginosa, S. Enterica var. Typhimurium, S. enterica var. Typhi

σ^F M. tuberculosis

Sub-família ECF

RpoE H. influenzae, S. enterica var. Typhimurium, V. Cholerae

AlgU; PvdS e Fpvl P. aeruginosa

σ^C; σ^D; σ^E; σ^H M. tuberculosis

HrpL Erwinia spp., P. Syringae

σ²⁸

FliA C. jejuni, H. pylori, S. enterica var. Typhimurium, V. cholerae, Y.

Enterocolitica

Família σ⁵⁴

σ^N C. jejuni, H. pylori, L. monocytogenes, P. aeruginosa, P.

syringae, V. cholerae, V. Parahaemolyticus

Adaptado: Kazmierczak et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69(4), 2005.

1.4. O estresse oxidativo

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são formadas nos organismos aeróbios como subprodutos do metabolismo celular, em decorrência da redução parcial do oxigênio molecular (O2) para ânion superóxido (O2.-

), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (OH^.) (Merkamm & Guyonvarch, 2001). Em bactérias, a maioria das ROS são geradas pelas enzimas da cadeia respiratória associada à membrana plasmática, responsáveis pela redução sequencial do oxigênio molecular (Cabiscol et al., 2000, Cash et al., 2007). Em Escherichia coli, por exemplo, foi demonstrado que a cadeia respiratória é responsável por cerca de 87% da produção total de H2O2 (González-flecha & Demple, 1995). As ROS também compreendem outros derivados do oxigênio que não são radicais mas são instáveis, como o ácido hipocloroso, (HOCl), o ozônio (O3) e o oxigênio singlete (¹O2) (Berra

& Menck et al., 2006).

Além das ROS produzidas endogenamente, as bactérias são frequentemente expostas aos radicais presentes no ambiente extracelular. As actinobactérias, por exemplo, são capazes de resistir às ROS extraceulares presentes no ambiente fagocítico, produzidas pelos macrófagos como retaliação à invasão do patógeno (Hengst & Buttner, 2008). O acúmulo de ROS, portanto, pode ocorrer tanto por causas endógenas quanto exógenas.

Independentemente da origem destas espécies, quando a quantidade de ROS excede a capacidade fisiológica normal de processamento das células é caracterizada a situação de estresse oxidativo. Assim, a regulação do estado fisiológico é essencial para a viabilidade do organismo frente às condições geradoras de estresse oxidativo, uma vez que diversos compostos químicos celulares são vulneráveis às ROS (Hengst & Buttner, 2008).

1.4.1 Respostas bacterianas ao estresse oxidativo

A susceptibilidade bacteriana às ROS é bastante diversificada, revelando a existência de mecanismos de tolerância variados que podem estar presentes ou ausentes dependendo da espécie. Serão abordados a seguir alguns dos sistemas descritos mais importantes de detecção e neutralização do estresse oxidativo em bactérias, com ênfase nos processos encontrados nas actinobactérias.

1.4.1.1. Mecanismos de tolerância ao peróxido de hidrogênio

Um dos mecansimos de resposta mais bem estudados envolve a ação da catalase, enzima responsável pela conversão de peróxido de hidrogênio em moléculas atóxicas (H2O e O2). A bactéria E. coli é produtora de 2 catalases: uma monofuncional (HPI), codificada pelo gene katG, e outra com atividade peroxidase (HPII), regulada pelo gene rpoS.

Enquanto as catalases monofuncionais são amplamente distribuídas entre os seres-vivos, as catalases peroxidases são típicas de bactérias e fungos. Bactérias patogênicas intracelulares podem produzir catalase dentro do compartimento fagossômico em macrófagos, havendo evidências de que esta habilidade pode desempenhar um papel importante na virulência de patógenos catalase-positivos como M. tuberculosis e Nocardia asteroides (Leblond-Francillard et al., 1989).

A proteína OxyR, exemplo clássico de regulador redox em E. coli, consiste em importante sensor de peróxido de hidrogênio. A OxyR ativa um regulon de mais de 20 genes antioxidantes, incluindo enzimas de desintoxicação como hidroperoxidase I (katG), hidroperóxido alquil redutase (ahpCF) e enzimas redutoras de dissulfetos, como a glutationa (Hengst & Buttner, 2001). Em muitas bactérias, a transcrição do gene catalase-peroxidase é ativada pela OxyR, mas nem todas as actinobactérias apresentam este regulador funcional, caso de M. tuberculosis. Nesta bactéria, o gene correspondente a OxyR foi inativado pela ocorrência de múltiplas mutações e deleções. A catalase KatG do bacilo tubérculo, bem como os demais mecanismos de resposta ao estresse oxidativo presentes nesta bactéria, é regulada por um fator diferente de OxyR. Zahrt et al. (2001) demonstraram que a proteína FurA, reguladora de aquisição de ferro e codificada por um gene a montante de katG, regula negativamente a produção de katG. Portanto, para as micobactérias desprovidas de oxyR funcional, FurA aparenta ser um importante regulador de mecanismos de resposta ao estresse oxidativo (Zahrt et al. 2001).

1.4.1.2. Resistência ao íon superóxido

bactérias, a SOD C se encontra no espaço extracelular de bactérias patogênicas (Merkamm

& Guyonvarch, 2001). O envolvimento de SOD C com patogenicidade foi demonstrado para o bacilo Gram-negativo Burkholderia cenopacea. Patógeno oportunista, este organismo produz SOD C periplasmática capaz de protegê-lo contra ânions superóxido de origem exógena, contribuindo para sua sobrevivência durante a infecção de macrófagos (Keith &

Valvani, 2007). Gouliemos et al. (2003) construíram uma linhagem de E. coli capaz de super-expressar Cu,Zn SOD de mosca Drosophyla sechellia, enzima que demonstrou ser capaz de proteger a bactéria de danos causados pelo O2-

após exposição ao agente oxidante dicloreto de paraquat.

M. tuberculosis possui 2 genes codificadores de superóxido dismutases: sodA e sodC. SodC é uma superóxido dismutase dependente de Cu e Zn localizada no envelope celular micobacteriano. A ausência de sodC aumenta a susceptibilidade de M. tuberculosis ao superóxido, ao óxido nítrico combinado a superóxido, e à morte por macrófagos murinos peritoneais ativados por interferon gama (IFN-g) (Piddington et al., 2001). Por outro lado, macrófagos selvagens inativados e macrófagos ativados por IFN-g mas deficientes para NOX2 (oxidase fagocítica) não mataram Mtb∆sodC, demonstrando que a superóxido dismutase dependente de Cu e Zn contribui para a resistência da bactéria contra produtos de ataque de macrófagos ativados.

1.4.1.3. Resistência à oxidação de grupos tiólicos

Um dos mecanismos antioxidantes mais difundidos, o sistema tioredoxina é responsável por manter os grupos tiol (-SH) de resíduos protéicos de cisteína em sua forma reduzida (Holmgren, 1989). Em adição a este sistema, a maior parte dos organismos apresenta compostostos tiol de baixo peso molecular que auxiliam na prevenção do estresse dissulfeto, sendo o mais importantes deles o tripeptídeo glutationa (GSH) (Newton et al., 1993).

Embora a glutationa não esteja presente nos actinomicetos, estes organismos desenvolveram um mecanismo próprio de resposta ao estresse dissulfeto, caracterizado pela modificação de grupos tiol em decorrência do estresse oxidativo. As actinobactérias apresentam a micotiol (MSH), poteína que presumivelmente apresenta potencial antioxidante similar à glutationa (Newton et al., 1996). Há indícios de que a MSH seja importante para a viruência de Mycobacterium tuberculosis, sendo que um dos genes responsáveis pela sua biosíntese - o mshD - parece ser essencial para o estabelecimento

do patógeno durante infecção de macrófagos (Rengarajan et al., 2005). Além disso, foi relatado que a MSH tem sua expressão aumentada durante a transição da fase exponencial para a fase estacionária de crescimento de M. Tuberculosis (Buchmeier et al., 2003).

Análises preliminares do genoma de C. psedotuberculosis (RGMG - Rede Genoma de Minas Gerais) revelaram a presença do gene codificador de MSH, no entanto, ainda não há evidências sobre o papel desta proteína na proteção contra o estresse oxidativo ou na virulência do organismo. Além dos sistemas tioredoxina e micotiol, outro mecanismo importante de proteção antioxidante presente em actinobactérias baseia-se na formação de grupos prostéticos ferro-enxofre (Fe-S), os quais podem atuar como cofatores na ativação de reguladores transcricionais envolvidos na ativação de genes de resposta ao estresse oxidativo.

Os hidroperóxidos de lipídeos promovem a formação de radicais lipídicos altamente reativos que podem afetar as propriedades da membrana celular. O mecanismo mais bem caracterizado de detecção e metabolização de hidroperóxidos de lipídeos, gerados em decorrência do estresse oxidativo, envolve a alquil hidroperóxido redutase (AhpC). Presente na maior parte das bactérias, esta enzima, que converte hidroperóxidos orgânicos em álcoois, se torna ativa quando reduzida pela ação da AhpF. Em M tuberculosis, tal redução ocorre pela ação da AhpD, uma molécula do tipo tiorredoxina que apresenta em seu sítio catalítico motivo CXXC (Bryk et al. 2002). Outra enzima recentemente descrita, a Ohr - organic hydroperoxide resistance -, reduz hidroperóxidos orgânicos aos seus respectivos álcoois de forma independente de tiol. Esta proteína, cuja expressão é controlada pelo regulador transcricional OhrR, está amplamente distribuída entre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (Girotti, 1998; Atichartpongkul et al., 2001). Streptomyces coelicolor, actinobactéria não patogênica, contém 3 genes parálogos a ohr, sendo que a região codificadora de um deles (ohrC) está flanqueada por um gene de ferredoxina (fdxA) e outro de fator σ^ECF (Oh et al., 2007).

1.4.1.4. Resposta à oxidação da molécula de DNA

desoxiguanina formada a partir de guanina. Enquanto a guanina apresenta afinidade pela citosina, a 8-oxo-desoxiguanina se liga com facilidade à adenina. Esta alteração da propriedade da base pode culminar em transversão de guanina para timina após a replicação do DNA. (Neeley & Essigmann, 2006). Em E coli, a defesa contra a 8-oxo- desoxiguanina envolve a ação principalmente das glicosilases MutM e MutY, as quais ativam um mecanismo de reparo conservado dentre organismos procarióticos e eucarióticos (Hazr et al., 2001). A MutM remove a 8-oxo-desoxiguanina ligada à citosina na cadeia-dupla de DNA, enquanto a MutY remove eventual adenina ligada à 8-oxo-desoxiguanina. A MutT, uma pirofosfohidrolase, também previne erros na replicação do DNA decorrentes do estresse oxidativo ao hidrolisar 8-oxodGTP livre a 8-oxo-dGMP (Michaels et al., 1991).

Em E. coli, a ativação de mecanismos de reparo de DNA está intimamente ligada a um complexo denominado rede SOS regulatória. Fazem parte desta rede de reparo cerca de 20 genes, os quais têm sua expressão inibida pela proteína LexA. Em E. coli, a formação de cadeias simples de DNA, em decorrência de danos ou da paralisação da replicação, ativa a proteína RecA, que por sua vez promove a inativação de LexA. O reparo do DNA lesionado pode acontecer pela recombinação homóloga ou pelo recrutamento da DNA polimerase promovido pela RecA ligada à cadeia simples (Salles & Paleoletti, 1983).

1.4.2. Oxidação promovida por agentes xenobióticos

Diferentes agentes xenobióticos são comumente utilizados em pesquisas envolvendo o estudo de mecanismos de tolerância ao estresse oxidativo em bactérias. Dentre os agentes mais utilizados encontram-se a menadiona e a plumbagina, duas naftoquinonas conhecidas pela capacidade de recepção de elétrons provenientes do metabolismo aeróbio (De Paiva et al., 2004). De modo geral, dois eventos principais podem explicar a citotoxicidade destas e de outras quinonas. Primeiro, tais moléculas podem receber elétrons a partir de flavoproteínas, se transformando em radicais semiquinona que se envolvem no mecanismo de respiração celular e induzem a formação de ROS, como superóxido e peróxido de hidrogênio (Floreane et al., 1996). Segundo, as quinonas constituem excelentes eletrófilos, sendo capazes de reagir com os grupos tiol de proteínas e da GSH. Foi demonstrado que a oxidação de GSH pela ação de menadiona (Figura 2) é capaz de induzir estresse oxidativo e citotoxicidade em células eucariotas (Castro et al., 2008).

A plumbagina (Figura 2) constitui um pigmento amarelado extraído principalmente de raízes de plantas pertencentes à família Plumbaginaceae (Gujar, 1990). De Paiva et al.

(2003) demonstraram que a plumbagina exibe atividade antimicrobiana relativamente

específica. Enquanto o crescimento de Staphylococcus aureus foi completamente inibido na presença de plumbagina, as bactérias Gram-negativas E coli e Salmonella typhimurium aparentemente não sofreram efeitos pela exposição a este agente. Estudos realizados por Raman et al. (2001) demonstraram, por meio da realização de curvas de crescimento, que uma linhagem de M. tuberculosis deficiente para o fator σ^H é mais susceptível a 100 µM de plumbagina do que a linhagem selvagem.

O paraquat (Figura 2) é também uma substância amplamente empregada para a geração de ROS em modelos experimentais. Ele é um herbicida tido como gerador intracelular de superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila secundários. Em um ensaio interessante, Goulielmos et al. (2003) inseriam em E. coli um plasmídio produtor de Zn-SOD de Drosophila, e constataram que as bactérias transformantes apresentaram menor susceptibilidade, segundo curvas de crescimento, ao estresse oxidativo gerado pelo paraquat.

Figura 2. Estruturas moleculares da menadiona, da plumbagina e do dicloreto de paraquat.

Adaptado: Cao et al. 187(9), 2005.

Dicloreto de Paraquat

Plumbagina Menadiona

1.5. PCR em tempo real (qPCR)

A técnica de qPCR (também conhecida por PCR quantitativa ou PCR em tempo real) consiste na amplificação convencional de DNA associada à detecção e monitoramento dos produtos gerados ao longo dos ciclos da reação. A detecção simultânea ocorre com base na emissão de um sinal fluorescente captado por um sistema óptico, sendo as diferentes intensidades alcançadas durante os ciclos de reação transformadas em dados de amplificação por software associado ao termociclador utilizado (Ginzinger et al., 2002;

Mackay, 2004; Mckillip & Drake, 2004; Alves et al., 2004).

Uma variedade de fluoróforos e sondas podem ser utilizados na detecção e quantificação por qPCR, como o corante intercalante SYBR Green I e as sondas Taqman, Molecular Beacons e Scorpions (Ginzinger, 2002; Giulietti et al., 2001; Mackay, 2004). Na realização do presente trabalho foi utilizado o SYBR Green I, molécula que se liga ao DNA de cadeia dupla e que, quando excitada, emite fluorescência em proporção direta à quantidade do produto amplificado (Burgos et al., 2002; Dhae et al., 2001; Giulietti et al., 2001). Durante os ciclos iniciais de amplificação o sinal fluorescente é fraco e não pode ser distinguido da fluorescência de fundo (“background”). À medida que o produto de PCR (Polymerase chain reaction) se acumula, o sinal fluoresente é aumentado exponencialmente até se tornar saturado, em decorrência do consumo de componentes críticos para a reação, como iniciadores, sistema de detecção, dNTPs e limitação da quantidade de moléculas de Taq-polimerase (Watzinger et al., 2006; Kubista et al., 2006).

A técnica de qPCR é amplamente empregada para a análise da expressão gênica com base na amplificação de moléculas de DNA complementar, produzidas pela transcrição reversa in vitro de RNA extraído do organismo de interesse. Experimentos em que se objetiva avaliar a transcrição diferencial de genes em resposta à exposição do organismo a tratamentos específicos são realizados, em geral, pelo emprego da metodologia de quantificação relativa de transcritos especificos de RNA em comparação com a condição controle utilizada (ausência de tratamento). Este método de quantificação, também conhecido por Ct (Cycle threshold) comparativo, permite estimar em quantas vezes a transcrição dos genes estudados varia após a submissão do organismo aos tratamentos.

Para a realização deste tipo de inferência, é importante que sejam utilizados controles biológicos apropriados e que os mesmos procedimentos de extração, transcrição reversa, e amplificação sejam adotados para todas as amostras biológicas. Além disso, a quantificação relativa de transcritos exige a realização das reações de amplificação por qPCR de um gene cujos níveis transcricionais sejam similares entre a condição de tratamento e a condição

controle utilizada, de forma a se normalizar os resultados de amplificação obtidos para os genes de interesse (Livak & Schmittgen, 2001).

Um exemplo importante de emprego da técnica de qPCR para a avaliação da transcrição diferencial envolveu a bactéria M. tuberculosis. Manganelli et al. (1999) utilizaram um ensaio de RT-qPCR (Quantitative reverse transcription-PCR) para a caracterização dos níveis transcricionais de 10 genes de fatores σ durante a exposição a uma série de condições ambientais. Os resultados mostraram que todos os 10 genes analisados foram expressos durante a fase exponencial do crescimento bacteriano, mesmo que em níveis distintos. Os níveis de mRNA correspondentes ao fator essencial σ^A diminuíram quando a bactéria foi incubada em água, submetida ao crescimento sob baixa aeração e ao crescimento até a fase estacionária. Os genes sigB, sigE e sigH tiveram sua transcrição aumentada em resposta ao choque térmico e ao estresse de superfície celular induzido por tratamento com SDS (Manganelli et al., 1999).

1.6. Justificativa de realização do trabalho

A LC é uma doença de distribuição mundial que causa importantes perdas econômicas para a atividade da ovinocaprinocultura. O processo patogênico da doença está relativamente bem entendido, entretanto, maiores estudos em relação às bases moleculares da virulência da C. pseudotuberculosis são necessários para a descoberta de novos alvos para o combate à doença. Na busca por novos determinantes de virulência da C.

pseudotuberculosis, bem como com o intuito de compreender a regulação geral da expressão gênica dessa bactéria, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo dos fatores sigma alternativos da RNA polimerase. Um dos trabalhos atualmente desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa envolveu a geração de uma linhagem mutante para o gene do σ^E de C. pseudotuberculosis, e a avaliação dos efeitos dessa mutação na virulência e no perfil de proteínas extracelulares da bactéria está em andamento (Pacheco et al., tese em andamento).

Atualmente, o projeto Genoma da C. pseudotuberculosis, realizado pela Rede Genoma de Minas Gerais, se encontra em fase de conclusão. As seqüencias genômicas analisadas até o momento têm permitido a identificação de diversos genes que despertam interesse de estudo, de acordo com dados relativos a microrganismos filogeneticamente próximos descritos na literatura.

Nesse contexto, o presente trabalho surge a partir da necessidade de se compreender melhor os mecanismos de regulação da transcrição gênica presentes em C.

pseudotuberculosis. A modulação da resposta ao estresse oxidativo é importante alvo de estudo de diversos grupos de pesquisa interessados em desvendar o papel de fatores σ da RNA polimerase na virulência e patogenicidade de bactérias patogênicas.

A avaliação de quais fatores σ têm sua transcrição significativamente aumentada em resposta à exposição a agentes geradores de estresse oxidativo abre novas perspectivas para a busca de genes de virulência ou associados à virulência de C. pseudotuberculosis.

Assim, o presente trabalho se propõe a avaliar a expressão diferencial dos genes de fatores σ primários e alternativos presentes no genoma da bactéria C. pseudotuberculosis em resposta a diferentes condições ambientais geradoras de estresses, através da técnica de RT-PCR em tempo real.

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

 Avaliar os níveis de expressão diferencial dos genes codificadores de fatores sigma quando C. pseudotuberculosis é exposta a agentes geradores de estresse oxidativo.

2.2. Objetivos específicos

 Identificar os fatores sigma de C. pseudotuberculosis;

 Estabelecer metodologia de realização de curvas de crescimento;

 Avaliar a susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a agentes geradores de estresse oxidativo;

 Estabelecer concentrações ótimas dos agentes geradores de estresse oxidativo para a análise de expressão gênica diferencial;

 Estabelecer metodologias para extração de RNA total e transcrição reversa;

 Estabelecer e validar metodologia de qPCR;

 Identificar os genes de fatores sigma diferencialmente expressos quando C.

pseudotuberculosis é exposta a agentes geradores de estresse oxidativo.

3. Material e Métodos