PROTOCOLO DO ESTUDO

Trata-se de um estudo transversal, com amostra de conveniência, reunindo um total de 70 pacientes.

Os pacientes foram avaliados quanto à calciúria em 24h, Z- score e conteúdo mineral ósseo da densitometria óssea.

Os pacientes foram divididos em 2 grupos de acordo com os níveis de calciúria na data da coleta das amostras: calciúria descompensada (n=23) e calciúria compensada (n=47). A calciúria descompensada foi definida como excreção de cálcio igual ou superior a 4mg/kg/24h.

Os pacientes também foram estratificados levando-se em consideração a idade ( 12 anos, n=18; > 12 anos, n=52) e o Z- score da densidade mineral óssea (Z-score >-1 desvio padrão, n=28; Z-score ≤-1 desvio padrão, n=18), quando disponível.

Os pacientes foram submetidos a exame clínico e avaliação laboratorial de acordo com o protocolo utilizado pela Unidade de Nefrologia Pediátrica do Hospital das Clínicas da UFMG. Todos os pacientes realizaram hemograma, gasometria venosa, dosagens séricas de uréia, creatinina, ácido úrico, sódio, potássio, cloreto, cálcio, fosfato e magnésio, PTH, TSH, T4 livre, exame de urina rotina, determinação de pH urinário em urina recém emitida, urocultura e, em urina de 24 horas, dosagens de cálcio, fósforo,

citrato, magnésio, ácido úrico, cistina, oxalato e creatinina. Os exames foram realizados para afastar causas secundárias de hipercalciúria (4, 6).

Após confirmação do diagnóstico de HI e assinatura do termo de consentimento, os pacientes foram submetidos, em única ocasião, a coletas simultâneas de amostras de sangue e urina para determinação de citocinas e quimiocinas conforme detalhado a seguir.

4.5. COLETAEPROCESSAMENTODE

AMOSTRAS

A coleta de sangue foi realizada em veia periférica, entre 7 e 9 horas da manhã, em tubo estéril contendo citrato como anti- coagulante. As amostras foram, então, transportadas em embalagem com gelo e processadas em até 30 minutos após a coleta. Foi utilizada centrífuga refrigerada (Jouan BR4i) a 4ºC, de acordo com o seguinte protocolo: foi feito inicialmente um ciclo a 700 g por 10 minutos; o plasma sobrenadante foi, a seguir, transferido para tubo estéril, que, por sua vez, foi centrifugado a 1300 g por 20 minutos para sedimentar plaquetas (4). Depois desta etapa, o plasma foi aliquotado em amostras de 0,5 ml, que foram armazenadas em freezer -80ºC até a data do ensaio.

As amostras de urina foram coletadas no mesmo momento em que foi realizada a coleta das amostras de sangue. Após homogeneização, 10 ml de urina foram recondicionados em tubo estéril. As amostras foram, então, centrifugadas a 1300 g por 20 minutos. Alíquotas de 1,5 ml foram também conservadas em freezer a -80ºC.

4.6. ENSAIOS

IMUNOENZIMÁTICOS

Os níveis plasmáticos e urinários de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, TGF-β1 e MCP-1 foram medidos usando kits de ensaio imuno- enzimático (enzyme-linked immunoassay - ELISA) produzidos pelo laboratório R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA).

Foram seguidas as instruções do fabricante para cada kit. As amostras foram analisadas em duplicata. O protocolo de ELISA utilizou um anticorpo monoclonal específico para determinação de cada citocina ou quimiocina estudada, fornecido pelo fabricante.

Em linhas gerais, os anticorpos de captura, específicos para cada citocina (fornecidos pelo kit), foram diluídos em tampão fosfato (PBS) e adicionados a cada poço de placas de poliestireno (96 poços). As placas foram, então, incubadas a 4ºC por 12 horas. Em seguida, foram submetidas a quatro ciclos de lavagem com PBS e Tween 20 a 0,05% (Sigma). As placas foram então bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) 1% e PBS, e incubadas por uma hora

em temperatura ambiente. Um novo procedimento de lavagem foi feito, como descrito acima. Em seguida, as amostras foram adicionadas às placas e incubadas por 12 horas a 4ºC, sendo depois submetidas a novos ciclos de lavagem. Os anticorpos de detecção específicos para cada citocina, diluídos em PBS, foram adicionados, e foi feita incubação por duas horas em temperatura ambiente, seguida de novo procedimento de lavagem. A seguir, o reagente de cor (fenilenediamina) foi adicionado a cada poço e as placas deixadas no escuro por 15 minutos. A reação foi parada com a adição de 1M H2SO4 aos poços. A absorbância foi lida em um leitor

de placas (Emax, Molecular Devices, MN, EUA), ajustado no comprimento de onda de 492nm.

Especificamente para a determinação das concentrações de TGF-β1, foi utilizado kit do tipo Quantikine® (R&D Systems). O kit fornece placas de poliestireno já preenchidas com anticorpo monoclonal anti-TGF-β1. As amostras de plasma e de urina foram submetidas inicialmente ao procedimento específico de ativação do TGF-β1, da seguinte forma: foi adicionado a cada amostra 20μL HCl e incubado por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a amostra acidificada foi neutralizada usando 20μL de NaOH/HEPES. As amostras foram, então, adicionadas aos poços, apropriadamente diluídas, com diluente fornecido no kit, e depois incubadas em

temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, os poços foram submetidos a quatro ciclos de lavagem com tampão de lavagem. O conjugado específico, que consiste de anticorpo anti-TGF-β1 conjugado a peroxidase, foi adicionado a cada poço, sendo a placa incubada por uma hora em temperatura ambiente. Foi realizado, em seguida, novo ciclo de lavagens. O próximo passo foi adicionar aos poços a solução de substrato, contendo peróxido de hidrogênio e tetra-metil-benzidina. As placas foram, então, deixadas por 15 minutos em temperatura ambiente, protegidas da luz. Em seguida, foi adicionada a cada poço a solução de parada, e foi medida a densidade óptica usando leitor de placas, ajustado no comprimento de onda de 450nm (Emax, Molecular Devices, MN, EUA).

As concentrações plasmáticas de citocinas foram expressas em pg/ml. Em relação às dosagens urinárias, os resultados foram expressos em valores absolutos das concentrações (pg/ml) e valores relativos à creatinina urinária medida simultaneamente na mesma amostra de urina (pg/mg cr). Os limites de detecção para cada citocina foram de: 0,1 μg/mL (IL-1β), 0,039 pg/mL (IL-6), 6 pg/mL (IL- 8), 0,106 pg/mL (TNF-α), 6 pg/mL (TGF-β1), 8 pg/mL (MCP-1). As determinações de IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, TGF-β1 e MCP-1 foram realizadas em um único ensaio para eliminar variações inter-ensaio. A variação intra-ensaio foi inferior a 3%.