As amostras de músculo gastrocnêmio foram adquiridas através de um trabalho em colaboração científica entre o Laboratório de Fisiologia do Exercício Equino e Farmacologia (LAFEQ) – DMFA/FCAV/UNESP – Jaboticabal e o Laboratório de Bioquímica do Exercício (LABEX) – UNICAMP, sob certificação do comitê de ética no uso de animais da UNICAMP (CEUA/UNICAMP) (Anexo I). Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP, Campus de Jaboticabal – SP (23593/15).
Após eutanásia com associação anestésica via i.p. seguida de punção cardíaca, a porção vermelha do músculo gastrocnêmio de ratos Wistar foi dissecada e retirada, sendo separada em pequenas alíquotas de 50 mg de tecido (n=5). Dois pedaços de músculo foram destinados ao fracionamento subcelular imediatamente após sua retirada (amostras frescas). Uma das amostras frescas foi processada conforme a nossa proposta metodológica e outra conforme a proposta padrão109. Outros dois pedaços de tecido foram congelados em
nitrogênio líquido e armazenados a -80°C. Posteriormente uma das amostras congeladas foi utilizada para o fracionamento subcelular. Outra amostra congelada foi utilizada para preparar o lisado total.
Preparação do Lisado Total
Para preparação do lisado total 50 mg de músculo gastrocnêmio vermelho foram pulverizadas sob nitrogênio líquido. O músculo em pó foi homogeneizado em 500 µl de tampão de lise (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% deoxicolato de sódio, 0,1% SDS e inibidor de protease (Sigma- Aldrich) por sonicação em banho de gelo (dez pulsos, 2” cada e 20” de intervalo a 80% da potência). Em seguida os homogenatos foram mantidos por 20 min sob banho em fase de gelo e água e centrifugados por 10 min a 1000 g. O sobrenadante foi resgatado e o conteúdo total de proteínas foi determinado pelo método de Bradford com modificações71.
Fracionamento Subcelular
Todos os procedimentos foram realizados sob banho em fase de gelo e água com soluções geladas e microcentrifuga a 4°C. Cuidados foram tomados ao retirar os sobrenadantes, pois os sedimentos na camada superior dos pellets podem ser aspirados facilmente, causando contaminação entre as frações. Sempre deixamos um pequeno volume dos sobrenadantes sobre os pellets, salvo exceções descritas.
As amostras de músculo congeladas foram descongeladas em tampão intramuscular (TIm) (5 mM NaCl, 45 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4.3H2O, 5 mM
NaHPO4.H2O, 10 mM EDTA, pH 7.0) a temperatura ambiente por 1 min sob leve
agitação manual. Após o descongelamento a solução foi trocada pela mesma solução resfriada. O procedimento restante foi o mesmo aplicado no tecido fresco.
Amostras de músculo congelado ou fresco (50 mg) foram cortados em diminutos pedaços com tesoura em placa de petri sob banho de gelo em tampão TIm gelado, e sedimentado a 200 g por 1 min posteriormente. O pellet foi lavado em TIm e centrifugado por 1 min a 200 g por mais 2 vezes. Após as lavagens o pellet foi ressuspenso em 250 µl de tampão de isolamento (TIso) (880 mM sacarose, 20 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA e
inibidor de protease). A amostra foi homogeneizada manualmente por 4 min com pistilo frouxo todo de vidro sob banho de gelo e água (o procedimento consistiu de pequenas rotações com leves subidas e descidas sem retirar todo o pistilo da
solução e imprimindo leve pressão com o pistilo sobre o tecido). O homogenato foi transferido para um microtubo de centrífuga e centrifugado por 10 min a 1000 g. O pellet foi denominado como P1 e o sobrenadante S1.
A Figura 1 apresenta um organograma referente ao protocolo proposto.
Figura 1. Organograma do protocolo de fracionamento subcelular.
Observa-se que o P1 foi utilizado para preparar a fração nuclear. Para isso o P1 foi ressuspenso em tampão hipotônico (THip) (20 mM HEPES pH 7.4, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100), homogeneizado com pistilo
de teflon justo (10 passagens a 600 rpm sob banho de gelo e água), transferido para um microtubo e centrifugado por 10 min a 1000 g. O sobrenadante (SN1) foi descartado e o pellet (PN1) ressuspenso em 500 µl de THip e centrifugado por 10 min a 1000 g. Novamente o sobrenadante (SN2) foi descartado e o pellet (PN2) ressuspenso em 500 µl de THip e centrifugado por 10 min a 1000 g. Sobrenadante (SN3) foi descartado. O pellet (PN3) foi ressuspenso em 200 µl de tampão de lise nuclear (TLN) (20 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 20% glicerol, 2 mM MgCl2, 1% triton X-100 e inibidor de protease) e mantido sob gelo
sonicado (10 pulsos de 2 seg com 20 seg de intervalo a 80% da potência) e finalmente centrifugado por 20 min a 20000 g. O sobrenadante resultante representa a fração nuclear.
O sedimento S1 resultante do tratamento inicial foi centrifugado novamente por 10 min a 1000 g. O pellet resultante (P2) foi descartado e o sobrenadante (S2) centrifugado por 25 min a 20000 g. O pellet resultante (PM1) e o sobrenadante (S3) foram destinados para extração das frações mitocondrial e citosólica, respectivamente.
O S3 foi centrifugado novamente por 25 min a 20000 g. O pellet (P2) foi descartado e o sobrenadante (S4) centrifugado novamente por 25 min a 20000 g. O pellet (P3) foi descartado. O sobrenadante (S5) representa a fração citosólica.
O pellet PM1 foi ressuspenso em 200 µl de TIso (utilizamos leves jatos com a pipeta para ressuspender o pellet sem tocá-lo com a mesma) e centrifugado por 25 min a 20000 g. O sobrenadante (SM1) foi retirado totalmente e descartado. O pellet (PM2) foi novamente ressuspenso em 200 µl de TIso e centrifugado por 25 min a 20000 g. O sobrenadante (SM2) foi descartado. O pellet resultante (PM3) ressuspenso em 20 ul de tampão de lise, submetido a 3 ciclos de congelamento/descongelamento a -80°C/temperatura ambiente, sonicado (10 pulso de 2 seg com 20 seg de intervalo a 50% da potência) e mantido sob o gelo por 20 min. A ressuspensão final representa a fração mitocondrial.
O conteúdo total de proteínas de cada uma das frações subcelulares foi determinado pelo ensaio de Bradford com modificações71.
Fracionamento subcelular de amostras frescas de músculo conforme protocolo padrão109.
Resumidamente, 50 mg de músculo gastrocnêmio fresco foi cortado em diminutos pedaços com tesoura na placa de petri sob gelo e ressuspenso em 300 μl de tampão STM (250 mM sacarose, 50 mM Tris-Cl pH 7,4, 5 mM MgCl2
suplementado com inibidor de protease), homogeneizado com pistilo de teflon justo por 1 minuto a 600 rpm sob banho em fase de água e gelo. O homogenato foi transferido para um microtubo de centrifuga e mantido sob gelo por 30 min,
agitado em vortex na máxima velocidade por 15 seg e centrifugado por 15 min a 800 g. O pellet foi utilizado para obtenção da fração nuclear e o sobrenadante usado para obtenção das frações citosólica e mitocondrial.
Western Blots
As amostras (2,5 µg de proteína) foram resolvidas em gel de SDS-PAGE de 10% para alfa-tubulina (ABCAM, 1:1000) e VDAC1 (CST, 1:1000) e de 15% para histona H3 (ABCAM, 1:1000), transferidas para membrana de PVDF de 0.22 μm (Bio-Rad) em tampão CAPS, bloqueadas com 3% BSA por 1 h a temperatura ambiente e incubadas overnight com anticorpo primário. Após as lavagens as membranas foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado a HRP (CST, 1:5000) e reveladas utilizando ECL (Thermo Fisher) no fotodocumentador (UV Tech). Foram adicionados 10 µg de proteínas do lisado total em 2 poços, um em cada extremidade das membranas, para igualar as intensidades obtidas das diferentes exposições das membranas. As intensidades das bandas foram quantificadas pelo software imageJ.
Atividade da Enzima Citrato Sintase
A atividade da enzima citrato sintase foi determinada conforme proposto por Srere72 commodificação para microplaca. Utilizamos 5 µg de proteína diluída
em 140 µl de 100 mM Tris-Cl pH 8,3, adicionamos 20 µl de 1 mM DTNB [5,5’dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)] (Sigma-Aldrich), 20 ul de 3 mM de Acetil-Coa (Sigma-Aldrich) e realizamos 13 leituras da absorbância a 412 nm a cada 15 segundos num intervalo de 3 minutos. Após a leitura inicial adicionamos 20 µl de 5 mM de Oxaloacetato (Sigma-Aldrich) para iniciar a reação e a releitura da absorbância nos mesmos padrões anteriores. A atividade da citrato sintase foi expressa em nmol.min-1.μg de proteína-1.
Análise estatística
Os dados da atividade da citrato sintase e western blots das diferentes frações obtidas pelas três preparações inicialmente passaram pelo teste de Jarque-Bera, e posteriormente a ANOVA com post-hoc de Tukey. Utilizamos
intervalo de confiança de 5% (p˂0,05). Os dados estão apresentados em média ± desvio padrão. Os resultados apresentados são referentes a 5 experimentos independentes (n = 5).
RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta o rendimento proteico das frações subcelulares do tecido muscular congelado e fresco submetidos ao nosso protocolo.
Tabela 1. Rendimento proteico total das frações subcelulares obtidas com amostras de tecido muscular congelado e fresco.
Frações Celulares Tecido Congelado (μg) Tecido Fresco (μg)
Citosol 255,8 ± 62,1 235,4 ± 88,5
Mitocôndria 38,5 ± 9,8 39,7 ± 16,9
Núcleo 353,7 ± 164,3 323,3 ± 223,6 Dados apresentados como média e desvio padrão.
Não houve diferença significativa entre o rendimento proteico das frações celulares entre as amostras congeladas e frescas.
A Figura 2 apresenta a pureza das frações subcelulares obtidas pelo nosso protocolo com amostras de tecido congelado e fresco avaliadas através do Western Blot de proteínas marcadoras de núcleo, citosol e mitocôndrias em todas as frações.
Figura 2. Imagem representativa e gráfico representando as intensidades óticas obtidas
nos westerns blot das frações subcelulares das preparações utilizando amostras congeladas e frescas. Dados apresentados como média e desvio padrão. CIT = citosol; MIT = mitocôndria; NUC = núcleo.
Observamos bandas intensas referentes as proteínas marcadoras do citosol (alfa-tubulina), mitocôndria (VDAC1) e núcleo (histona H3) nas respectivas frações em ambas as preparações de amostras frescas e congeladas, apresentando uma quantidade muito baixa de contaminação entre elas.
Para analisar a retenção de proteínas solúveis mitocondriais durante os processos de fracionamento quantificamos a atividade da enzima citrato sintase nas três frações subcelulares. Esses dados estão apresentados na Figura 3.
Figura 3. Atividade da enzima citrato sintase (nmol.min-1.µg de proteína-1) das frações
subcelulares obtidas das preparações utilizando tecido congelado e fresco. Dados apresentados em média e desvio padrão. & p < 0.05 em relação a todas as frações
obtidas pelas duas preparações. # p < 0.05 em relação as frações citosólicas e nucleares
das duas preparações. CIT = citosol, MIT = mitocôndria, NUC = núcleo.
A atividade enzimática da citrato sintase foi significativamente maior na fração mitocondrial em comparação às outras frações, independente se as amostras eram congeladas ou frescas. No entanto a atividade da enzima se apresenta maior na fração mitocondrial da preparação com tecido fresco em relação ao congelado.
A Figura 4 apresenta o western blot e atividade da citrato sintase das frações subcelulares derivadas do protocolo padrão.
Figura 4. Imagem representativa dos western blots e atividade da enzima citrato sintase das frações subcelulares obtidas das preparações utilizando protocolo padrão. CIT = citosol; MIT = mitocôndria; NÚC = núcleo.
O enriquecimento das frações foi confirmado pela presença de bandas intensas das proteínas específicas de cada compartimento em suas respectivas frações subcelulares, também com uma quantidade muito baixa de contaminação entre elas. A atividade enzimática da citrato sintase foi significativamente maior na fração mitocondrial em relação as frações citosólica e nuclear obtidas pelo protocolo padrão. No entanto, a atividade enzimática da citrato sintase foi significativamente menor na fração mitocondrial do protocolo padrão do que das amostras congeladas e frescas processadas de acordo com o nosso protocolo, indicando menor retenção do conteúdo solúvel da fração mitocondrial pelo protocolo padrão.
DISCUSSÃO
Os dados apresentados nesse estudo mostraram que o protocolo de fracionamento subcelular a partir de pequenas quantidades de amostras congeladas de tecido muscular esquelético proporcionou o fracionamento das frações citosólica, nuclear e mitocondrial relativamente puras (Figura 2). A atividade da enzima citrato sintase nas frações mitocondriais foi significativamente maior quando comparada com a atividade nas outras sub- frações, confirmando maior retenção de proteínas solúveis na fração mitocondrial (Figura 3). A diferença na atividade, ligeiramente para menor nas amostras congeladas quando comparadas com as amostras frescas (Figura 3) era esperada, devido ao próprio processo de congelamento.
Atividade da Citrato Sintase 63,35 112,04 * 30,93
Os microcristais de gelo formados nos compartimentos intra e extracelulares pelo congelamento da amostra levam a desidratação da célula, e consequentemente ao aumento da concentração local de eletrólitos e redução da solubilização da cabeça polar dos fosfolipídios de membranas biológicas, causando sua desorganização e fragmentação115-117. Tais alterações podem
levar ao extravasamento para o citosol de enzimas solúveis de organelas como as mitocôndrias, mas sem alterações na localização de enzimas transmembranas como o complexo II110,117. Os dados da quantidade de VDAC1
(Figura 2) e da atividade da enzima citrato sintase (Figura 3), que representam o conteúdo mitocondrial transmembrana e solúvel, respectivamente, corroboram com essa interpretação. Não observamos diferenças na intensidade de VDAC1 na fração mitocondrial entre as preparações com amostras congeladas ou frescas, apenas na atividade enzimática da citrato sintase.
Para reduzir os criodanos ao tecido combinamos alta taxa de congelamento com descongelamento rápido das amostras. O descongelamento rápido é superior para manter a estrutura celular quando comparado ao descongelamento lento, possivelmente pela rápida inibição de enzimas degradativas liberadas da lise de lisossomos, que podem comprometer a integridade celular caso não sejam inibidas de forma rápida116,118. A alta taxa de
congelamento (amostras expostas a -196°C) formam cristais de gelo menores e consequentemente produzem menos dano116,117,119. Já a taxa de congelamento
lento (obtidas ao colocar amostras em -20 a -80°C) causam maiores danos a célula por formar cristais de gelo maiores116,117,119.
A utilização do tampão intramuscular (TIm) durante o descongelamento possivelmente permitiu a manutenção da osmolaridade do meio nesta etapa. Testamos a homogeneização direta com o tecido congelado no tampão de isolamento e o uso de tampão salino para o descongelamento, mas ambos não apresentaram resultados satisfatórios, com baixa retenção do conteúdo solúvel na fração mitocondrial (dados não mostrados).
O fato de mitocôndrias de músculo esquelético serem estruturas alongadas e ramificadas120 torna a etapa de homogeneização da amostra um
passo crucial no processo de fracionamento subcelular. O êxito do protocolo deriva de uma homogeneização inicial delicada, feita com pistilo de vidro. Esse
tipo de homogeneização pode explicar o baixo rendimento proteico obtido pelo método (Tabela 1), mas com maior qualidade em termos de características retidas nas frações. Testamos uma homogeneização inicial mais severa com pistilo de teflon acoplado a um rotor, mas houve pouca retenção do conteúdo solúvel na fração mitocondrial (dados não mostrados). Isso pode ser explicado pelo maior dano mecânico imposto sobre a amostra, que fragmenta e torna as mitocôndrias esferoides112. Corroborando essa interpretação, a
homogeneização mais severa proposta pelo protocolo padrão pode explicar o conteúdo solúvel mitocondrial reduzido, indicado pela baixa atividade da citrato sintase nessa fração mitocondrial, embora associada com boa marcação das frações com as proteínas específicas de cada compartimento (Figura 4).
Outro fator conhecido por influenciar a integridade da fração mitocondrial é o meio de isolamento. Dounce et al108 demonstraram que mitocôndrias isoladas
de tecido hepático em meio isotônico de sacarose não eram morfologicamente intactas quando comparadas à mitocondrias in situ, mas eram superiores ao isolamento em meio isotônico com eletrólitos (KCl, NaCl, entre outros), que causa o inchamento mitocondrial devido ao transporte osmótico dos eletrólitos e o extravasamento de proteínas solúveis para o citosol121-124. Hogeboom et al123
demonstraram que concentrações entre 0.8-1M de sacarose aumentaram a preservação da morfologia de mitocôndrias isoladas de tecido hepático, ficando bem parecidas com as mitocôndrias observadas in situ. Provavelmente o aumento da pressão osmótica coloidal externa exercida pela alta concentração de sacarose, e a desidratação da organela por osmose auxiliem na preservação morfológica da organela. A posterior reidratação quando as organelas são ressuspensas em meio isotônico não causa inchaço, preservando sua morfologia125,126.
Diferentes estudos demonstraram a superioridade da utilização de altas concentrações de sacarose na manutenção da morfologia de mitocôndrias isoladas através de microscopia eletrônica. Com 250 mM sacarose as mitocôndrias se apresentaram esféricas, inchadas, com cristas circulares, matriz menos densa sendo tais alterações irreversíveis. Já com 880 mM sacarose as mitocôndrias ficaram alongadas, com cristas e matriz altamente condensados, além de possuírem maior atividade ATPasica108,125,127,128.
A utilização de 880 mM de sacarose no tampão de isolamento possivelmente contribuiu para a integridade mitocondrial e maior retenção de seu conteúdo. Utilizamos ainda no tampão de isolamento EGTA, MgCl2 e 50 mM de
NaCl que auxiliam na redução do inchaço e rompimento da membrana mitocondrial129. Já o protocolo da preparação padrão utiliza tampão de
isolamento contendo 250 mM sacarose. Já foi demonstrado que mitocôndrias de músculo esquelético isoladas em tampão com 250 mM de sacarose apresentam menor atividade do complexo I quando comparada com a atividade deste complexo em fibras permeabilizadas112. É possível que o extravasamento do
conteúdo da matriz durante o fracionamento em meio isotônico de sacarose reduziu a quantidade de enzimas e coenzimas do ciclo de Krebs, e consequentemente a atividade do complexo I130. Seria interessante avaliar o
consumo de O2 de mitocôndrias isoladas pelo nosso protocolo, uma vez que elas
apresentam maior retenção do conteúdo solúvel quando comparado as mitocôndrias obtidas pelo protocolo padrão.
Em relação a fração nuclear podemos observar maior intensidade da banda obtida para histona H3no western blot nas amostras congeladas e frescas quando comparadas com as amostras obtidas pelo protocolo padrão, possivelmente devido ao uso de 0,1% de Triton X-100 no tampão hipotônico na segunda homogeneização (P1) e nas lavagens dos pellets relacionados a fração nuclear. Gagnon et al131 demonstraram que organelas como o retículo
endoplasmático, que estão associadas a membrana nuclear são removidas com a utilização de 0,3% de NP-40, levando a maior concentração de núcleo nesta fração por reduzir organelas contaminantes. Como os dois detergentes são não- desnaturantes e não-iônicos, a utilização de Triton X-100 pode ter levado a esse mesmo fenômeno.
CONCLUSÕES
As modificações introduzidas no protocolo associadas aos cuidados relatados durante a homogeneização das amostras congeladas possibilitaram que quantidades pequenas (50mg) de músculo esquelético produzissem frações subcelulares com razoável grau de pureza e com maior retenção do conteúdo solúvel da fração mitocondrial. A possibilidade de utilizar pequenas quantidades
de tecidos possibilita o fracionamento de amostras provenientes de biopsias, facilitando o planejamento de experimentos com humanos.