UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
Pedro Rafael Firmino Dias
RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE OXIDATIVO, AUTOFAGIA E
APOPTOSE NOS ESTADOS FOR E NFOR INDUZIDOS PELO
PROTOCOLO DE OVERTRAINING
CAMPINAS 2019
RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE OXIDATIVO, AUTOFAGIA E APOPTOSE NOS ESTADOS FOR E NFOR INDUZIDOS PELO PROTOCOLO DE
OVERTRAINING
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO PEDRO RAFAEL FIRMINO DIAS, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. DENISE VAZ DE MACEDO
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo (Orientadora)
Dr. Claudio Cezar Zoppi
Profa. Dra. Fúlvia de Barros Manchado Gobatto
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Célia Aparecida de Carvalho Firmino Dias e Nivaldo Firmino Dias; A minha irmã e sobrinho, Suelen Gabriela Firmino Dias e Vitor de Oliveira;
A minha companheira, Lana;
A minha orientadora, Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo; Aos meus amigos, Eduardo Pardin, Conceição e Domingos;
Agradeço a minha família, minha benção, sem ela nada seria possível. Agradeço enormemente a Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo, pela oportunidade, confiança, carinho, ensinamentos e exemplo de humildade.
Agradeço ao Prof. Dr. René Brenzikofer, pelos auxílios, ensinamentos e exemplo de simplicidade e humildade.
A Conceição, pelos auxílios, carinho e exemplo de simplicidade.
Aos técnicos do Instituto de Biologia (IB) e Faculdade de Ciências Médicas (FCM), Márcio, Paulinho, Érika, Rogério e Willian, pelas ajudas e atenção.
Ao Prof. Dr. Paulo Guimarães Gandra, pelas discussões e ensinamentos. Ao Prof. Dr. Guilherme de Campos Ferraz e Henriette Moranza do LAFEQ (UNESP-Jaboticabal), pela colaboração cientifica.
Aos colegas do LABEX e IB, pelos auxílios e boas conversas. A UNICAMP, por abrigar excelentes pessoas.
Ao curso de Pós Graduação em Biologia Funcional e Molecular e a banca de defesa, por aceitar, avaliar e contribuir neste trabalho.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - PROEX0232084.
O presente trabalho também foi realizado com apoio da Funcamp (convenio 927.7 BIO-0100).
O treinamento intensificado (overtraining - OT), resultado de um aumento na frequência de treinos diários com a consequente diminuição no período de descanso entre as sessões pode produzir dois estados diferenciados em relação ao desempenho: um estado de manutenção ou mesmo ligeiro aumento (funcional overreaching - FOR) ou um estado de perda do condicionamento previamente adquirido (non funcional overreaching - NFOR). Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa sugerem que a dinâmica mitocondrial está na gênese de ambos os processos. O objetivo deste trabalho foi analisar a possível existência de um sinal pró-apoptótico no músculo gastrocnêmio vermelho de animais classificados como NFOR em comparação com o grupo classificado como FOR após um protocolo de OT em esteira. Nossa hipótese é que a sinalização pró apoptótica induzida por um aumento nos níveis de estresse oxidativo explicaria o fluxo autofágico basal reduzido observado anteriormente na musculatura dos animais NFOR. A presente dissertação está dividida em 2 capítulos. No capítulo 1 apresentamos os resultados referentes a proteínas relacionadas ao processo autofágico e apoptótico induzidas por Espécies Reativas de Oxigênio (LC3 I e LC3 II, JNK1/2, p53, caspase 3) nos animais FOR e NFOR. O protocolo de overtraining foi realizado em colaboração cientifica com o Laboratório de Fisiologia de Equinos e Farmacologia (Unesp-Jaboticabal). O protocolo originalmente proposto (Hohl et al.,2009) prediz um período de 60h de descanso após o último teste de exaustão para a análise das amostras de ambos os grupos de animais. No entanto, a despeito da evidente existência de 2 grupos de animais diferenciados em relação ao desempenho, o sacrifício dos animais e a concomitante retirada das amostras de músculo imediatamente após o teste de desempenho claramente contaminaram a análise da resposta crônica frente ao protocolo de OT com a resposta aguda ao teste de exaustão. Essa conclusão foi evidenciada pela ausência de diferenças na atividade da enzima citrato sintase e razão LC3II/I nos grupos FOR e NFOR. Observamos nos animais NFOR uma redução do conteúdo de pró-caspase-3 mitocondrial com concomitante aumento de seu fragmento no citosol associado a maiores níveis de pró-caspase-3 citosólica. Esta alteração pode representar a clivagem da caspase-3 nas mitocôndrias e sua translocação para o citosol, sendo este um mecanismo associado a sinalização apoptótica. Observamos também maiores níveis da proteína p53 na fração citosólica do grupo NFOR. A localização dessas proteínas no citosol pode interferir na síntese de autofagossomos, uma vez que a ação sinérgica entre p53 e caspase-3 pode inibir proteínas do maquinário autofágico, evidenciado pela menor razão LC3II/I no grupo NFOR. Tal interferência poderia explicar a queda no desempenho no grupo NFOR. Somente a repetição do protocolo com um outro grupo de animais e a observância do tempo correto de descanso após o teste de exaustão podem confirmar ou refutar nossa hipótese.No capítulo 2 apresentamos a padronização de um protocolo de fracionamento subcelular de pequenas quantidades de amostras congeladas de tecido muscular esquelético. O congelamento de tecidos causa alterações estruturais nas células, induzindo rompimento de membranas celulares e de organelas, sendo as mitocôndrias muito sensíveis a esta condição. As análises por western blot das proteínas marcadoras das frações citosólica (alfa-tubulina), mitocondrial (VDAC1) e nuclear (histona H3) associadas a maior atividade enzimática da citrato sintase na fração mitocondrial indicaram que as
quantidades pequenas (50mg) de músculo esquelético produzissem frações subcelulares com razoável grau de pureza e com maior retenção do conteúdo solúvel da fração mitocondrial. A possibilidade de utilizar pequenas quantidades de tecidos viabilizou as análises apresentadas no capítulo 1, da distribuição das proteínas relacionadas a sinalização pró-apoptótica nas frações citosolica, mitocondrial e nuclear. Além disso, possibilita o fracionamento de amostras provenientes de biopsias, facilitando o planejamento de experimentos com humanos.
Palavras-Chave: Modelo animal, fracionamento subcelular, overreaching funcional, overreaching não funcional, treinamento.
The intensified training (Overtraining - OT), resulting from an increase in the frequency of daily workouts with the consequent decrease in the rest period between sessions can produce two differentiated states related to performance: a state of maintenance or even slight increase (functional overreaching - FOR) or a state of loss of previously acquired conditioning (non-functional overreaching - NFOR). Previous studies from our research group suggest that mitochondrial dynamics is in the genesis of both processes. The objective of this work was to analyze the possible existence of a pro-apoptotic signal in the red gastrocnemius muscle of animals classified as NFOR in comparison with the group classified as FOR after an OT protocol. Our hypothesis is that the pro-apoptotic signaling induced by an increased oxidative stress levels would explain the reduced basal autophagic flow observed previously in muscle of NFOR animals. This dissertation is divided in 2 chapters. In Chapter 1 we present the results referring to proteins related to the autophagic and apoptotic process (LC3 I and LC3 II, JNK, p53, caspase-3) induced by reactive oxygen species in FOR and NFOR animals. The OT protocol was conducted in scientific collaboration with the Laboratory of Physiology of Equines and Pharmacology (UNESP-Jaboticabal). The protocol originally proposed (Hohl et al.,2009) predicted a 60h rest after the exhaustion test for the analysis of samples from both groups of animals. However, in this work the muscle samples were collected immediately after the exhaustion test and frozen in liquid nitrogen. Thus, the results presented here do not represent only the chronic response to the OT protocol, being contaminated with the acute effects of the incremental exhaustion test. This conclusion can be evidenced by the absence of differences in the citrate synthase activities and LC3II/I ratio in the FOR and NFOR groups. We observed a pro-apoptotic signaling coming from the mitochondria in NFOR animals, which presented reduction of the mitochondrial pró-caspase-3 content with concomitant increase of its fragment in the cytosol associated with higher levels of cytosolic pró-caspase-3. This alteration may represent the cleavage of caspase-3 in mitochondria and its translocation to the cytosol, a mechanism associated with mitochondrial apoptotic signaling. We also observed higher levels of p53 in the cytosolic fraction of the NFOR group. The cytosolic localization of these proteins may interfere with the synthesis of autophagosomes, since the synergistic action between p53 and caspase-3 can inhibit autophagic machinery proteins, evidenced by the lowest LC3II/I ratio in the NFOR. Such interference could reduce the capacity of mitochondria degradation, increasing the content of dysfunctional mitochondria and decrease in performance in the NFOR group. In Chapter 2 we present the standardization of a subcellular fractionation protocol of small amounts of frozen samples of skeletal muscle tissue. Tissue freezing causes structural alterations in cells, inducing disruption of cell membranes and organelles, being mitochondria very sensitive to this condition. Western blot analyses of cytosolic (alpha-tubulin), mitochondrial (VDAC1) and nuclear (histone H3) fractions in association with citrate synthase activity in mitochondrial fraction indicated that the modifications introduced in the protocol associated with the care reported during the homogenization of frozen samples allowed to produce subcellular fractions with a reasonable degree of purity of small amounts (50mg) of skeletal muscle and with greater retention of the soluble content of the mitochondrial fraction. The possibility of using small amounts of tissues enabled
important contaminations among these fractions. In addition, it allows the fractionation of samples from biopsies, facilitating the planning of experiments with human beings.
Keywords: Animal model, subcellular fraction, functional overreaching, non-functional overreaching, training.
Introdução
Figura 1 Curva hipotética da homeostasia e a resposta de supercompensação envolvida na adaptação aos treinos... 17
Capítulo 1
Figura 1 Maquinaria envolvida na sinalização da autofagia... 27 Figura 2 Regulação das vias relacionados a autofagia... 30 Figura 3 Regulação das vias de sobrevivência e apoptose induzido por
EROs... 35 Figura 4 Organograma representando o protocolo... 40 Figura 5 Desempenho dos grupos C, FOR e NFOR nos Tmáxs... 43 Figura 6 Atividade da enzima citrato sintase do músculo gastrocnêmio vermelho dos animais C, FOR e NFOR... 44 Figura 7 Western blot das proteínas LC3I, LC3II, razão LC3II/I, caspase-3, p53 e
JNK1/2 fosforilada do lisado total do músculo gastrocnêmio vermelho dos grupos C, FOR e NFOR...45 Figura 8 Western blot das frações citosólica, mitocondrial e nuclear... 46 Figura 9 Western blot da proteína caspase-3 nas frações citosólica e mitocondrial
do músculo gastrocnêmio vermelho dos grupos C, FOR e NFOR... 47 Figura 10 Western blot da proteína p53 nas frações citosólica, mitocondrial e nuclear do músculo gastrocnêmio vermelho dos grupos C, FOR e NFOR... 48 Figura 11 Western blot da proteína JNK1/2 fosforilada nas frações citosólica,
mitocondrial e nuclear do músculo gastrocnêmio vermelho dos grupos C, FOR e NFOR... 49
Capítulo 2
Figura 1 Organograma do protocolo de fracionamento subcelular... 62 Figura 2 Imagem representativa e gráfico representando as intensidades óticas obtidas nos westerns blot das frações subcelulares das preparações utilizando amostras congeladas e frescas... 65 Figura 3 Atividade da enzima citrato sintase das frações subcelulares obtidas das preparações utilizando tecido congelado e fresco... 66 Figura 4 Imagem representativa dos western blots e atividade da enzima citrato sintase das frações subcelulares obtidas das preparações utilizando protocolo padrão... 67
Introdução
Tabela 1 Quadro comparativo que resume os principais resultados do grupo em relação ao desempenho e respostas metabólicas e moleculares do músculo gastrocnêmio vermelho dos animais dos grupos FOR e NFOR... 22
Capítulo 1
Tabela 1 Protocolo de treinamento com modificações... 38
Capítulo 2
Tabela 1 Rendimento proteico total das frações subcelulares obtidas com amostras de tecido muscular congelado e fresco... 65
Anexo I Informação CEUA/UNICAMP... 82
VDAC1 Voltagem Dependent Anion Channel 1 EROs Espécies Reativas de Oxigênio
TIm Tampão intramuscular
TIso Tampão de isolamento
THip Tampão hipotônico
SDS-PAGE Sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis PVDF Polyvinylidene fluoride
CAPS N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid
BSA Bovine serum albumin
HRP Horseradish peroxidase
ECL Enhanced chemiluminescence
OT Overtraining
FOR Functional overreaching
NFOR Non-functional overreaching
LC3 Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 JNK1/2 c-Jun N-terminal kinase 1/2
OTS Overtraining syndrome
O2.- Radical ânion superóxido
H2O2 Peróxido de hidrogênio
O2 Oxigênio
OH. Radical hidroxila
ATP Adenosina trifosfato
TFAm Transcription factor A mitochondrial
PGC-1α Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha
DNA Ácido desoxirribonucleico
TBARs Thiobarbituric acid reactive substances mTOR mammalian Target of rapamycin ULK1/2 Unc-51 like kinase 1
ATGs Autophagy-related genes
FIP200 Focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kDa
PAS Phagophore assembly site
VPS34 Vacuolar protein sorting 34
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
PI3KIII Phosphoinositol 3 kinase family III PtdIns(3)P Phosphatidylinositol 3 phosphate
E1 Ubiquitin-activating enzyme
E2 Ubiquitin-conjugation protein
E3 Ubiquitin-protein ligase
∆ψm Potencial de membrana mitocondrial Bnip3 Bcl2 interacting protein 3
Ca2+ Íons cálcio
AMPK AMP-activated protein kinase
RAPTOR Regulatory-associated protein of mTOR TSC1/2 Hamartin and Tuberin
Rheb Ras homolog enriched in brain
MAPK Mitogen-activated protein kinase ERK Extracellular signal-regulated kinase
p38 Mitogen-activated protein kinase p38
Bak Bcl-2 homologous antagonist/killer
Bax Bcl-2-associated x protein
Bcl-XL Bcl-2-like protein
SMAC/DIABLO Second Mitochondrial-derived Activator Caspase / Direct IAP-binding protein with low pI
AIF Apoptotic-Inducing Factor
EndoG Endonuclease G
Apaf1 Apoptotic protease activating factor 1 Caspase Cysteine-aspartic acid protease
Bad Bcl-2-associated death promoter
Bim Bcl-2-interacting mediator of cell death
Bmf Bcl-2 modifying factor
Bid BH3 interacting-domain death agonist
ATF-2 Activating transcription factor-2
AP1 Activator protein 1
TNFα Tumor necrosis factor-alpha
FasL Fas ligand
Mdm2 Murine double minute 2
PUMA p53 upregulated modulator of apoptosis Mcl-1 Myeloid cell leukemia 1
m/min metros por minute
Tmáx Teste de desempenho D Desempenho W Trabalho mecânico m Massa d Distância Kg.m Quilogramas x metro
Via i.p Via Intraperitoneal
nm Nanometros
Tom20 Translocase of outer membrane
GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase HSP60 Heat shock protein 60
HSP10 Heat shock protein 10
UVB Ultravioleta B
CD 95 Cluster of differentiation 95
BMD188 Cis-1-hydroxy-4-(1-naphthyl)-6-octylpiperidine-2-one
TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate
MnSOD Manganese superoxide dismutase
PHF-20 Plant Homeodomain Finger-containing protein 20 HSP27 Heat shock protein 27
Introdução...17
Capítulo 1 – Relação entre estresse oxidativo, autofagia e apoptose nos estados FOR e NFOR induzidos pelo protocolo de overtraining...23
1. Resumo... 24 2. Introdução... 25 3. Objetivos... 36 4. Materiais e Métodos... 37 5. Resultados... 43 6. Discussão... 50 7. Limitações do Estudo... 56
Capítulo 2 – Fracionamento subcelular de amostras congeladas de músculo esquelético...57 1. Resumo... 58 2. Introdução... 59 3. Protocolo Experimental... 60 4. Resultados... 65 5. Discussão... 67 6. Conclusões... 70 Conclusão Geral... 72 Referência Geral... 73 Anexos... 82
INTRODUÇÃO
“Training vs Overtraining”
O exercício físico constitui um evento estressor para o organismo como um todo. O distúrbio na homeostase do tecido muscular esquelético e demais estruturas envolvidas com o movimento aciona a secreção de hormônios catabólicos e vias metabólicas produtoras de energia com o consequente aumento na produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Os danos teciduais devido ao estresse metabólico e mecânico são de magnitudes diferentes e dependentes da aplicação de variáveis do treino como intensidade e volume, dentre outras1,2.
Subsequente ao término do exercício inicia-se a resposta adaptativa, com a reparação dos tecidos e a restauração dos estoques de energia. Para isso são ativadas diversas cascatas de sinalizações, também dependentes do tipo de estímulo aplicado nos treinos1,2. É no repouso entre os esforços que acontece a
síntese de diversos componentes necessários para a recuperação de estruturas celulares e o armazenamento dos estoques energéticos. Durante a recuperação também são ativadas as vias de degradação dos componentes celulares danificados pelo estresse imposto para posterior substituição1,2.
Quando as cargas de treino estão adequadas em relação ao tempo de recuperação entre as sessões, o restabelecimento homeostático tecidual é otimizado. Nesse caso ocorre leve aumento nas concentrações e atividades de determinadas enzimas e otimização de reservas energéticas na musculatura em relação ao estado em que se encontravam anteriormente ao treino. Esse momento é denominado na área esportiva de supercompensação3-5 (Figura 1).
Figura 1. Curva hipotética da homeostasia e a resposta de supercompensação
É importante notar que na supercompensação as alterações homeostáticas induzidas pelo estresse em sessões subsequentes serão menores se os treinos forem semelhantes, justificando a necessidade de progressão das cargas de treino para a otimização contínua do desempenho6. A
consequência visível e mensurável é o aumento do desempenho em capacidades biomotoras diversas.
A medida que os atletas se adaptam ao treinamento a taxa de aumento de desempenho se torna menor, de forma que quanto mais próximo do máximo os atletas se encontrarem mais difícil será promover melhoras de desempenho através do treinamento5. Uma estratégia que é utilizada em indivíduos altamente
treinados para contornar esse problema é aplicar períodos de treinamento intensificado, caracterizados principalmente pela redução no tempo de recuperação entre os estímulos de exercícios7.
Essa estratégia tem sido amplamente utilizada no alto rendimento porque muitos atletas submetidos a um período de treinamento intensificado exibem ligeiras melhoras do condicionamento7. O problema é que não são todos os
atletas que respondem com aumento de desempenho quando submetidos a períodos semelhantes de treinamento intensificado. Alguns deles, em um determinado momento perdem a capacidade adaptativa e exibem queda do desempenho previamente atingido7. Com isso, é necessário a paralisação das
atividades do atleta até sua recuperação completa, que pode contribuir para o destreinamento.
Adotamos no nosso laboratório a nomenclatura proposta pelo Colégio Europeu de Esportes em 2006, referendada em 20137, que denominou os
períodos de treinamento intensificado de overtraining (OT). Os dois estados possíveis em relação ao desempenho físico foram denominados de overreaching7. Se o estado for de aumento do desempenho é denominado
overreaching funcional (FOR). Se o estado for de queda do desempenho previamente adquirido é denominado overreaching não-funcional (NFOR). Como não acomete a todos os atletas com igual magnitude, o estado NFOR como possível efeito colateral indesejável do OT não inibe a sua utilização durante períodos competitivos. A persistência do desequilíbrio entre treino/descanso
pode evoluir para um quadro mais difuso e de recuperação muito mais lenta (meses, anos), denominado de síndrome do overtraining (OTS).
Diversos grupos de pesquisa têm se dedicado em explicar e buscar biomarcadores sensíveis para a diferenciação dos estados FOR do NFOR. As investigações envolvem respostas hormonais, neurais, metabólicas, psicológicas. No entanto, ainda não há um consenso sobre a causa da troca do estado FOR para o NFOR durante períodos de overtraining. Em função disso não foram descritos ainda biomarcadores confiáveis do estado NFOR7. A queda
do desempenho tem sido o sinal comum reportado em todos os estudos, sendo considerada, dessa forma, o padrão ouro para o diagnóstico.
Resultados prévios do grupo de pesquisa sobre o tema
Os pesquisadores do Laboratório de Bioquímica do Exercício (LABEX) há muito tempo se dedicam a entender as causas moleculares dos estados FOR e NFOR. Para isso desenvolveram um protocolo de OT em modelo animal capaz de produzir animais nos estados FOR e NFOR após um período de treinamento onde todos os animais se adaptaram. O protocolo é realizado na esteira pelo motivo de modalidades cíclicas como corrida e ciclismo serem mais associadas a ocorrência da síndrome do overtraining. É realizado com ratos devido à dificuldade de encontrar atletas voluntários que se predisponham a ser submetidos a um protocolo que pode causar queda do desempenho previamente atingido, prejudicando seu resultado em competições. A linhagem Wistar garante a heterogeneidade genética, possibilitando observações de causa e efeito pelo protocolo e não devido a alguma predisposição presente em linhagem isogênica. O protocolo de OT consiste inicialmente de um período adaptativo (“training”), onde os exercícios são diários e com incremento da carga (4 semanas), seguido de um período de manutenção da carga por mais 4 semanas, sempre com 24h de descanso entre as sessões de treino. A finalidade dessas 8 semanas é garantir que todos animais exibam melhora no desempenho como resposta adaptativa. Após as 8 semanas começa o período de OT, durante o qual a frequência de treinos diário é aumentada semanalmente em 2, 3 e 4 vezes, com concomitante redução do período regenerativo para 4, 3 e 2h entre cada sessão, respectivamente. Como o padrão ouro no diagnóstico desses
estados é a queda ou não do desempenho, são realizados testes incrementais até a exaustão entre as fases adaptativas e após cada uma das 3 semanas do período de OT. Após as 3 semanas de OT os animais são separados em 2 grupos distintos em relação ao desempenho. Os animais classificados como NFOR apresentam desempenho reduzido e os classificados como FOR apresentam desempenho ligeiramente aumentado ao longo das 3 semanas de OT quando comparado ao momento training (8 semanas).
A utilização desse modelo animal possibilitou ao nosso grupo investigar tanto os efeitos comuns do OT (respostas observadas nos dois estados) quanto as respostas diferenciadas no grupo NFOR quando comparado ao FOR, permitindo avançar no entendimento das causas dos estados FOR e NFOR8-11.
O estudo inicial de Hohl et al.8 mostrou que a redução do desempenho
dos animais do grupo NFOR estava associada com a redução do metabolismo oxidativo. Os autores mostraram redução da atividade da enzima citrato sintase no músculo gastrocnêmio vermelho sem alterações nas concentrações de glicogênio e/ou atividade da enzima lactato desidrogenase no grupo NFOR quando comparado com o grupo FOR. Posteriormente observou-se que além da atividade da citrato sintase também a atividade do complexo IV mitocondrial estava reduzida nos animais do grupo NFOR. Também os níveis de estresse oxidativo no músculo dos animais do grupo NFOR era maior comparativamente ao grupo FOR. Nesse contexto, mesmo com as enzimas antioxidantes apresentando aumento de atividade em ambos os grupos houve aumento significativo na peroxidação lipídica somente nos animais do grupo NFOR10.
Os autores observaram aumento na produção de O2- e H2O2, além de
menor consumo de O2 e queda na produção de ATP por mitocôndrias isoladas
do músculo gastrocnêmio dos animais do grupo NFOR. Esses dados sugeriam mitocôndrias disfuncionais como a principal fonte de EROs no grupo NFOR11.
Além disso, não foi observado alterações na atividade da enzima xantina oxidase muscular nem a presença de infiltrados de neutrófilos e leucócitos nas análises histológicas nos animais de ambos os grupos, descartando o metabolismo das purinas ou o burst respiratório como as principais fontes de EROs nos animais NFOR.
A continuidade dos estudos levou a investigação de biomarcadores da dinâmica mitocondrial em ambos os grupos para identificar a possível causa da presença de mitocôndrias disfuncionais11. Os dados obtidos por Ferraresso
(Tese de doutorado) mostraram que os animais FOR apresentaram fluxo autofágico basal aumentado (razão LC3II/LC3I aumentada) com redução da proteína p62 e menor quantidade de TFAm (Transcription Factor A mitochondrial) em relação aos animais NFOR, indicando que nestes animais os processos de mitofagia e biogênese mitocondrial estavam ocorrendo adequadamente11. O aumento do desempenho provavelmente refletia a
qualidade mitocondrial do grupo FOR11. Em contrapartida, os músculos do grupo
NFOR apresentavam redução do fluxo autofágico basal (redução da taxa LC3II/LC3I) junto ao aumento da p62, indicando a redução da mitofagia no músculo como a responsável pelo aumento de mitocôndrias disfuncionais nos animais do grupo NFOR11.
Em relação a biogênese mitocondrial, os animais de ambos os grupos apresentaram aumentos na concentração de PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), proteína coordenadora da biogênese mitocondrial11. No entanto, o grupo NFOR apresentou maiores níveis
de TFAm, fator de transcrição envolvido na replicação e transcrição do DNA mitocondrial11. Uma hipótese aventada para explicar esse aumento foi que a
redução da mitofagia e o consequente aumento na produção de EROs por mitocôndrias disfuncionais regularia o maquinário de importação mitocondrial no grupo NFOR. A proteína TFAm ficaria, dessa forma, impedida de induzir a estabilização, replicação e transcrição do DNA dessas mitocôndrias defeituosas até como um mecanismo de defesa, para que as mesmas não se propaguem.
A Tabela 1 apresenta o quadro comparativo dos resultados já obtidos no músculo gastrocnêmio com o modelo animal de OT nos animais dos grupos FOR e NFOR.
Tabela 1. Quadro comparativo que resume os principais resultados do grupo em relação
ao desempenho e respostas metabólicas e moleculares do músculo gastrocnêmio vermelho dos animais dos grupos FOR e NFOR8,10,11.
Importante ressaltar que a redução do fluxo autofágico basal nos animais NFOR não pode ser explicado pela inibição de sua indução pela ação da mTORC1 (Mammalian Target of Rapamycin Complex 1)11. Houve inibição da
mTOR em ambos os grupos, ou seja, o problema não está na iniciação do processo autofágico. Esses dados nos permitiram especular que a redução da mitofagia poderia estar associada a algum sinal pró-apoptótico iniciado pelo aumento na produção de EROs, que justificaria um período maior de descanso para o restabelecimento da homeostasia no estado NFOR, sendo o objeto de estudo da presente dissertação.
FOR NFOR
Desempenho (kg.m) ↑ ↓
Capacidade oxidativa (citrato sintase e complexo IV) ↑ ↓ Enzimas antioxidantes (Superóxido Dismutase e Catalase) ↑ ↑
Peroxidação Lipídica (TBARs) - ↑
Consumo de O2 e produção de ATP (mitocôndrias isoladas) ↑ ↓
Produção de O2-. e H2O2 (mitocôndrias isoladas) - ↑
Inibição da iniciação autofágica: mTOR fosforilada ser2448 ↓ ↓ Fluxo autofágico basal: LC3II/LC3I
p62 ↑ ↓ ↓ ↑ Biogênese mitocondrial: ↑ ↓ PGC-1 alfa ↑ ↑ TFAm ↓ ↑
Capítulo 1
RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE OXIDATIVO, AUTOFAGIA E APOPTOSE NOS ESTADOS FOR E NFOR INDUZIDOS PELO PROTOCOLO DE
Resumo
Pesquisadores do nosso laboratório desenvolveram um protocolo de overtraining (OT) em esteira que induz ratos Wistar ao estado overreaching funcional (FOR) e overreaching não-funcional (NFOR). O protocolo tem se mostrado reprodutível. O conjunto de resultados já obtidos pelo nosso grupo indica que a queda de desempenho está relacionada a estresse oxidativo concomitante a uma redução nos processos de biogênese e degradação mitocondrial (mitofagia) no músculo dos animais do grupo NFOR. OBJETIVOS: Identificar a possível existência de um quadro pró-apoptótico induzido por Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), que pode estar relacionado a inibição da autofagia na musculatura esquelética dos animais NFOR. METODOLOGIA: O protocolo de OT teve duração de 12 semanas e foi realizado de acordo com o proposto por Hohl et al (2009). As análises de algumas proteínas que possuem papel na autofagia, apoptose, sinalização pró-apoptótica induzida por EROs e inibição autofágica, como a LC3I, LC3II, caspase-3, p53 e JNK1/2 foram realizadas por Western Blot no conteúdo total muscular e nas frações citosólica, mitocondrial e nuclear. Analisamos também a atividade da enzima citrato sintase no lisado total. RESULTADOS: Não observamos diferenças na atividade da citrato sintase, que se mostrou aumentada em ambos os grupos. Identificamos menor razão LC3II/I nos grupos FOR e NFOR, apesar destes apresentarem maior conteúdo de LC3I e LC3II total muscular comparativamente ao grupo C. Não houve diferenças na clivagem da caspase-3 no conteúdo total muscular entre os grupos. Provavelmente esses resultados refletem o efeito agudo do teste de desempenho (Tmáx-7), uma vez que os animais foram sacrificados imediatamente após o teste. Quando analisamos as mesmas proteínas nas frações subcelulares observamos que o grupo NFOR apresentou redução da pró-caspase-3 na fração mitocondrial e aumento do fragmento da capsase-3 na fração citosólica quando comparado com o grupo FOR. Também observamos maiores níveis de pró-caspase-3 citosólica em relação ao grupo C, sugerindo a clivagem da caspase-3 mitocondrial e translocamento para o citosol no grupo NFOR. Identificamos maiores níveis de fosforilação da JNK1/2 muscular total e na fração citosólica nos grupos FOR e NFOR, junto a maior fosforilação desta quinase na fração nuclear no grupo NFOR em relação ao grupo C. Os níveis de p53 também não apresentaram diferenças no conteúdo total muscular e nas frações mitocondrial e nuclear. No entanto, o grupo NFOR apresentou maior quantidade de p53 na fração citosólica, sugerindo uma possível ação anti-autofágica. Dessa forma, a menor razão LC3II/I poderia estar associada a uma redução da pró-caspase-3 mitocondrial, aumento do fragmento da caspase-3 citosólica e p53 citosólica no grupo NFOR. CONCLUSÕES: Os dados apresentados sugerem que a sinalização pró-apoptótica vinda das mitocôndrias, representada pela clivagem da caspase-3 mitocondrial e seu translocamento para o citosol, junto ao aumento de p53 no citosol poderiam interferir na síntese de autofagossomos, uma vez que estas proteínas podem inibir proteínas do maquinário autofágico no citosol celular, contribuindo para o aumento de mitocôndrias disfuncionais devido a uma menor capacidade de degradação dessas organelas no grupo NFOR.
INTRODUÇÃO
Espécies reativas de oxigênio e estresse oxidativo
O oxigênio molecular (O2), que se encontra no estado gasoso em
condições normais de temperatura e pressão é um birradical formado por duas moléculas de oxigênio, com dois elétrons desemparelhados e spins paralelos nos dois orbitais mais externos (estado triplete). Esta configuração impõe a molécula de oxigênio aceitar um elétron por vez até sua redução total a água (H2O). Em organismos biológicos, a redução do O2 a H2O ocorre no complexo IV
da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial.
A redução da molécula de O2 no complexo IV ocorre de forma
monoeletrônica, onde inicialmente recebe um elétron do citocromo c e se torna um radical ânion superóxido (O2.-). Posteriormente, O2.- é reduzido a peroxido de
hidrogênio (H2O2) pela adição de um outro elétron e dois prótons (H+) a sua
estrutura. A adição do terceiro elétron produz uma molécula de água (H2O) e um
radical hidroxila (OH.). O OH. é reduzido a outra molécula de H
2O pela adição de
outro elétron e um H+ a sua estrutura12.
Embora a produção de H2O pelo complexo IV seja a reação predominante
na célula, pode ocorrer vazamento de elétrons em outros componentes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, que ao reagirem com o O2
produzem radical ânion superóxido (O2.-). O O2.- dá origem a H2O2 e OH..
Coletivamente essas espécies parcialmente reduzidas derivadas do oxigênio são chamadas de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Como são mais reativas, reagem com outras biomoléculas capturando seus elétrons para estabilizar-se, e consequentemente desestabilizam a molécula atacada, causando um efeito oxidativo em cascata nas estruturas celulares tais como lipídios de membrana, lipoproteínas, glicoproteínas, proteínas e DNA, quebrando as interações secundárias e terciarias, e as ligações entre fosfato-ribose12.
Nosso organismo possui um sistema antioxidante constituído por enzimas e outros compostos de baixo peso molecular para nos defender do ataque oxidativo de EROs. O sistema antioxidante enzimático compreende as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), e o sistema glutationa peroxidase/redutase (GPX/GR). Essas enzimas são capazes de reagir e neutralizar as EROs. A ação da SOD sobre o O2.- produz H2O2, que sofre ação
da CAT com formação de dois H2O e um O2 pela reação de duas moléculas de
H2O2; ou da GPX, que utiliza a glutationa reduzida (GSH) como doadora de
elétrons, formando dois H2O e glutationa oxidada (GSSG), que é revertida à
forma reduzida pela GR com utilização de NADPH e H+ 13.
Em adição ao sistema antioxidante enzimático, possuímos antioxidantes não enzimáticos de baixo peso molecular, compostos por vitaminas, GSH, flavonoides, entre outros, obtidos de forma endógena ou exógena. Esses antioxidantes também possuem a capacidade de reagir e neutralizar as EROs. Quando a proteção contra EROs ocorre de forma ineficiente causando danos a estruturas celular, estes componentes danificados podem ser retirados do meio celular através da degradação pela via autofágica12. Quando a produção de
EROs ultrapassa a capacidade de defesa antioxidante e a capacidade de remoção de danos oxidativos, as células entram em um estado chamado de estresse oxidativo.
É importante ressaltar que atualmente existe consenso que as EROs podem agir de forma antagônica nas células. Aparentemente o efeito dual das EROs é dependente da quantidade produzida e tempo de exposição celular aos agentes oxidantes. Em concentrações ótimas parecem agir como segundo mensageiro através da oxidação de resíduos de cisteína de quinases e fosfatases e fatores de crescimento, ativando vias de proliferação e síntese proteica, aumentando a sobrevivência celular14. No entanto, quando a alteração
no estado redox celular em função das EROs é excessiva, os danos oxidativos podem levar ao desenvolvimento de patologias e morte celular (apoptose)13.
O exercício físico constitui uma fonte de EROs, cuja concentração também possui efeitos antagônicos sobre a resposta adaptativa. Pode contribuir com a upregulation de enzimas antioxidantes e proteínas envolvidas com a autofagia15, mas também pode iniciar cascatas de sinalização para a apoptose
das células e sua remoção por fagocitose16.
Autofagia
O termo autofagia deriva de auto (própria) e phagos (digestão)17. É a
maior via de degradação celular, sendo capaz de degradar organelas (mitofagia, reticulofagia), bactérias e vírus (xenofagia), ribossomos (ribofagia), agregados proteicos entre outros17,18. Essa via atua para garantir a sobrevivência celular,
disponibilizando energia e macronutrientes em situações de estresse energético, privação nutricional de aminoácidos, carboidratos e redução de fatores de crescimento19-21. Além disso, atua mediando adaptações metabólicas e o
controle dos danos induzidos por estressores22. A desregulação dos processos
autofágicos está associada a diversos quadros patológicos como fibrose, doenças neurodegenerativas, cardiovasculares, câncer entre outros. Também aumenta a vulnerabilidade a estressores, levando a incapacidade de atender exigências energéticas extremas17-23.
O processo autofágico ocorre através da síntese de uma bicamada lipídica chamada autofagossomo, que envolve o material celular (“carga”) a ser degradado. A subsequente fusão com o lisossomo (autofagolisossomo) permite que enzimas hidrolíticas degradem a “carga”, liberando aminoácidos, lipídios e carboidratos, com excreção do corpo residual21,24.
A formação do autofagossomo possui 3 passos: indução, nucleação e alongamento. A Figura 1 apresenta as principais proteínas envolvidas na formação do autofagossomo.
Figura 1. Maquinaria envolvida na sinalização da autofagia (Adaptado de
A indução ocorre com a ativação da ULK1 (Unc-51 like kinase 1) do complexo ULK1/2, formado por ULK1 e 2, ATG13 (autophagy-related gene 13), ATG101 e FIP200 (Focal adesion kinase family Interacting protein de 200kDa)20.
Uma vez ativado, o complexo ULK1/2 se autofosforila e através da ATG13 se liga a um ponto de montagem da membrana, ou PAS (phagophore assembly site). Este domínio pode estar localizado num subdomínio do reticulo endoplasmático denominado de omegassomo, ou na membrana das mitocôndrias, endossomos e complexo de Golgi18,22,26,27.
Após a marcação no PAS se inicia o processo de nucleação. A ULK1 ativa por fosforilação a Beclin1 do complexo VPS34, formado por VPS34 (Vacuolar Protein Sorting 34), p150, ATG14L, dineína e Bcl-2 (B-cell lymphoma 2). A Beclin1 fosforila a ATG14L que ativa a VPS34, proteína pertencente à família PI3KIII (Phosphoinositol 3 Kinase Family III), recrutando dessa forma o complexo VPS34 ao fagóforo, onde a VPS34 fosforila os fosfoinisitidios formando PtdIns(3)P (Phosphatidylinositol 3 phosphate), evento crítico na maturação do fagóforo a autofagossomo28. Durante a fase de expansão, a ATG16L juntamente
com a PtdIns(3)P recruta para a membrana complexos formados por ATGs responsáveis pela maturação do fagóforo18,20,24.
A maturação do fagóforo inicia-se com a ação da ATG4, uma cisteína protease que cliva as ATGs8 (família das proteínas semelhantes a ubiquitina) próximo ao C-terminal expondo o resíduo de glicina. Pertencendo a esta família está a LC3 (Light Chain 3)18,29. A LC3 após ser clivada pela ATG4 se torna LC3I,
e a exposição da glicina da LC3I possibilita a ação da ATG7 (proteína semelhante a E1), que ativa o grupo carboxila da glicina formando ligação tioéster com a cisteína 234 do sítio catalítico da ATG3 (proteína semelhante a E2). Concomitantemente a ATG7 ativa a ATG12, possibilitando sua conjugação com a ATG5 pela ATG10, outra proteína semelhante a E2, formando um complexo ATG12-ATG5. Este complexo é conjugado a ATG16L formando um complexo E3 ligase, necessário para o passo de lipidação do fagóforo. O complexo ATG12-ATG5-ATG16L reorienta o sítio catalítico da ATG3, conjugando a LC3I ao grupo amino da fosfatidiletanolamina, maior componente da maioria das membranas intracelulares22,30-32. Após a conjugação, LC3I se
torna LC3II, sendo estes passos relativo a síntese de autofagossomos, geralmente representado pela razão LC3II/I33,34.
Depois de formado o autofagossomo a LC3-II seleciona certas organelas para envolvimento da membrana e posterior degradação. As mitocôndrias que passaram pelo processo de fissão e encontram-se danificadas (baixo ∆ψm, capacidade oxidativa e resíntese de ATP diminuídas e maior produção de EROs) ou são desnecessárias, normalmente acabam sendo degradadas por meio da autofagia35.
O processo de degradação mitocondrial ou mitofagia ocorre através de marcação via ubiquitinação ou através de receptores específicos de mitofagia36.
A proteína p62/SQSTM1 (Sequestrosome 1) na membrana mitocondrial funciona como um adaptador autofágico que reconhece proteínas poliubiquitinadas e faz interação com LC3-II, fazendo com que o autofagossomo engolfe a mitocôndria disfuncional para posterior degradação lisossomal22,37-39. A proteína p62 parece
ainda ser responsável pela agregação de mitocôndrias disfuncionais em feixes compactos, diminuindo assim a área de exposição a outros componentes celulares, facilitando sua eliminação40. Trabalhos na literatura mostraram que
quanto maior for o fluxo autofágico menor a quantidade da proteína p62 após treinamento físico, sugerindo o aumento dos mecanismos autofágicos como um importante mecanismo adaptativo 39,41,42.
Resumindo, os aumentos nos níveis de autofagia basal (aumento da LC3-II e redução da p62), de proteínas relacionadas a autofagia (Bnip3) e proteínas autofágicas (ATG7, Beclin1 e LC3) são necessárias para adaptações metabólicas, mitocondriais e angiogênicas41.
Por outro lado, o acúmulo da proteína p62 na musculatura esquelética inviabiliza uma perfeita incidência dos processos mitofágicos prejudicando, consequentemente, a eliminação das mitocôndrias disfuncionais. Esse fato pode levar a instalação de quadros patológicos relacionados com doenças neurodegenerativas, câncer, obesidade e doenças associadas ao envelhecimento39.
Atualmente já existe certo entendimento sobre os eventos envolvidos na sinalização e regulação da autofagia, assim como dos processos de sinalização pelos quais as alterações nas homeostases energética, do Ca2+ e redox são
traduzidas para a ativação/regulação das cascatas de sinalização. A Figura 2 representa a regulação autofágica.
Figura 2. Regulação das vias relacionados a autofagia.
A proteína AMPK é ativada por EROs e desequilíbrio energético. Inibe a mTORC1 através da fosforilação da subunidade RAPTOR nas serinas 722 e 792, ou pela ativação do complexo TSC1/2 (Hamartin eTuberin) pela fosforilação da treonina 1227 e serina 1345, que por sua vez inibe a Rheb, uma GTPase ativadora da mTORC1. Essa inibição possibilita a autofagia21,43. Por outro lado,
a AMPK também possui atividade sobre os complexos ULK1/2 e FOXO3, podendo iniciar a formação do fagóforo devido a fosforilação das serinas 317 e 777 da ULK1, e por ativar a FOXO3 e a subsequente síntese de algumas ATGs essenciais21,44. Tais funções colocam a AMPK como uma proteína reguladora
chave da autofagia durante o estresse oxidativo e energético45.
A JNK1/2 é o último componente de uma via tripartite composta por MAP3Ks (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase), MAP2Ks ou MKKs (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase) e as MAPKs, pertencendo a este grupo as proteínas ERK (Extracellular signal–Regulated Kinase), JNK1/2 e
p3846,47. As MKKs são ativadas pelas MAP3Ks, onde existem ao menos 20
MAP3Ks que podem fosforilar e ativar uma ou mais das 7 MKKs conhecidas. As MKKs, por sua vez, ativam as MAPKs, sendo as MKK4 e 7 responsáveis por fosforilar a treonina 183 e tirosina 185 da JNK1/2 nesta via46,48,49. Esta rede de
proteínas quinases torna a célula sensível a diversas fontes de estresse celular como EROs, citocínas inflamatórias, dano estrutural, entre outros50.
A JNK também pode ativar a p53, sendo a AMPK outra proteína ativadora dela. A ativação da proteína p53 pode aumentar a síntese de antioxidantes e proteínas autofágicas para combater o estresse oxidativo51.
A inibição do processo autofágico aumenta o número de mitocôndrias danificadas e a produção de EROs, acelerando o processo de morte celular devido ao estresse oxidativo.
Apoptose
A morte celular programada ou apoptose é um processo onde a célula sofre alterações moleculares e morfológicas que resultam em sua remoção por fagocitose, prevenindo respostas imunológicas52. Este processo é necessário
para o desenvolvimento embrionário e homeostase tecidual. Citocínas, EROs, glicocorticóides, mitocôndrias, entre outros, são capazes de ativar as vias que levam a apoptose.
O processo apoptótico possui 4 fases: fase efetora, ponto de não retorno, fase de degradação e fase de limpeza. A fase efetora pode ocorrer de forma extrínseca, via receptores de morte localizados na membrana celular, ou intrínseca através da sinalização de proteínas pró-apoptóticas presentes nas mitocôndrias52. Nesse contexto, as mitocôndrias podem sofrer uma drástica
alteração: de organelas responsáveis pelo aporte energético para fonte de sinais para a morte celular. Tal mudança pode ser ativada por danos oxidativos devido à redução na síntese de ATP (adenosina trifosfato), perda do potencial de membrana, ativação das proteínas Bcls (B-cell lymphoma) pró-apoptóticas (Bak e Bax) e inibição das anti-apoptóticas (Bcl2 e Bcl-XL) com consequente formação
de poros na membrana externa mitocôndrial38.
As proteínas Bcls possuem a capacidade de formar homo-heteroligômeros quando associadas a membrana mitocondrial externa, aumentando ou reduzindo a formação de poros por onde proteínas pró-apoptóticas como SMAC/DIABLO (Second Mitochondrial-derived Activator Caspase / Direct IAP-binding protein with low pI), AIF (Apoptotic-Inducing
Factor), EndoG (Endonuclease G) e citocromo c se translocam das mitocôndrias para o citosol dando prosseguimento no sinal pró-apoptótico38.
Com o aumento da concentração citosólica de citocromo c forma-se um complexo denominado de apoptossomo, formado pelo citocromo c, dATP, Apaf1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1) e pró-caspase-9, que por sua vez ativa por clivagem a pró-caspase-9 presente no complexo. No citosol celular a caspase-9 ativa cliva a pró-caspase-3 em caspase-3, dando prosseguimento ao processo apoptótico até a chegada do ponto de não-retorno, caracterizada pelo maior sinal pró-apoptótico sobre o sinal anti-apoptótico. As caspases são cisteína aspartil proteases responsáveis por clivar diversas proteínas, causando sua ativação ou inibição, sendo responsáveis pela degradação do DNA, alteração do citoesqueleto e membrana celular, culminando na morte da célula durante o processo apoptótico53.
A proteína JNK1/2 (c Jun N-Terminal Kinase 1/2) também possui ação na apoptose de forma dependente do tempo de ativação e de sua localização intracelular. Age, portanto, na regulação transcricional e pós-transcricional de proteínas que regulam tanto a sobrevivência celular através da autofagia, metabolismo e reparo do DNA para a restauração homeostática da célula, quanto na morte celular através da indução de proteínas pró-apoptóticas para remoção de células defeituosas e reparação dos tecidos54,55.
A modulação apoptótica frente ao estresse oxidativo pela JNK1/2 pode ocorrer de forma direta (mitocondrial) e indireta (núcleo). A ação direta da JNK1/2 ocorre através da ativação de proteínas que levam a formação de poros na membrana mitocondrial e indução da via intrínseca da apoptose51,54,56. Dessa
forma, no citosol celular a chaperonina 14-3-3 após ser fosforilada pela JNK1/2 perde sua interação com a Bad (Bcl-2-associated death promoter), a qual é translocada para a mitocôndria onde heterodimeriza com as Bcl2 e Bcl-XL,
inibindo a ação na inibição da formação de poros mitocondriais da Bcl2 e
Bcl-XL51,54,57. De forma semelhante, a JNK1/2 possui ação na ativação de Bim
(Bcl-2-interacting mediator of cell death), Bmf (Bcl2 Modifying Factor) e clivagem de Bid (BH3 interacting-domain death agonist), onde seu fragmento, a J-Bid, junto a Bim e Bmf se translocam para a mitocôndria ativando Bcls pró-apoptóticas como Bax e Bak, aumentando a formação de poros mitocondriais38,51,54,58,59. A
JNK1/2 pode também sofrer translocação para as mitocôndrias e fosforilar Bcl2 e Bcl-XL presente na membrana, inibindo suas funções54,55.
Já sua ação indireta ocorre através da sua translocação para o núcleo celular, onde ativa fatores de transcrição como c-fos, c-jun, ATF-2 (Activating transcription factor 2), estabilizando e levando a formação de AP-1 (Activator Protein 1), que regula a transcrição de genes pró-apoptóticos como TNFα (Tumor Necrosis Factor-alpha), FasL (Fas Ligand) e Bak54,55,60.
A p53 é uma proteína supressora de tumor que apresenta expressão aumentada em situações de estresse celular, como dano ao DNA e estresse oxidativo51,52. Seu papel já foi descrito na proliferação, crescimento,
diferenciação, apoptose e ferroptose, atuando em processos metabólicos, de reparo e replicação do DNA nuclear e mitocondrial, homeostase redox, dinâmica mitocondrial, entre tantos outros61-63. De forma semelhante a JNK1/2 a proteína
p53 também possui ação apoptótica dependente do tempo de ativação e de sua localização intracelular. Na ausência de estressores a p53 se encontra em maior concentração no citosol da célula, e seus níveis são mantidos pela Mdm2 (Murine double minute 2), uma E3 ligase presente no citosol e núcleo celular 64-66. A p53 pode ser ativada de diversas formas67. Pode sofrer fosforilação pela
JNK1/2, p38 e AMPK devido ao aumento da respiração celular e dano oxidativo. Todos esses fatores causam a estabilidade e ativação da p53 por dissociar-se da Mdm251,55,65,66,68.
A p53 quando ativada de forma sustentada possui ação direta na apoptose devido sua translocação para as mitocôndrias, induzindo a formação de poros através da interação e inibição de Bcls anti-apoptóticas e ativação das Bcls pró-apoptóticas57,66,69. Sua ação apoptótica indireta ocorre através da sua
translocação ao núcleo celular e transcrição de genes pró-apoptóticos como Bax, Bak, Apaf-1, PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), Bid e supressão de genes anti-apoptóticos como Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 (Myeloid cell leukemia
1)51,57,59,66,70.
O aumento persistente de EROs pode iniciar uma resposta pró-apoptótica via JNK1/2 e p53. Estas ativações levam a célula a uma maior sinalização pró-apoptótica, elevando a ativação das caspases via apoptose intrínseca, onde a caspase-3 junto da p53 podem inativar por clivagem a Beclin-1, ATG5 e FIP200,
inibindo dessa forma a autofagia38,51,53,71. Como consequência, ocorre o acúmulo
de mitocôndrias danificadas/disfuncionais, sendo este mecanismo uma amplificação do sinal pró-apoptótico vindo das mitocôndrias para a progressão da apoptose38,51,53,71.
A Figura 3 apresenta um panorama da regulação das vias de sobrevivência (autofagia) e apoptose induzida por EROs relacionadas as proteínas estudadas na presente dissertação de mestrado. Assim, curtos episódios de aumento de EROs induzem aumento da transcrição de proteínas antioxidantes e autofágicas induzindo reparo ao DNA mitocondrial através da ativação da JNK1/2, p53 e FOXO3, ao mesmo tempo que inicia uma sinalização pró-apoptótica branda através da ação sobre Bcls pró e anti-apoptótica (Figura 3A). Aumento nos níveis de estresse oxidativo induz ativação sustentada da JNK1/2 e p53, onde JNK1/2 induz maior sinalização pró-apoptótica através da ativação das Bcl apoptóticas e aumento da transcrição de fatores apoptóticos, e p53 altera sua ação na sobrevivência e se torna uma proteína pró-apoptótica (Figura 3B). A proteína p53 reprime a transcrição de proteínas antiapoptóticas e induz a transcrição de proteínas pró-apoptóticas, junto a inibição das Bcls anti-apoptóticas e ativação das Bcls pró-apoptóticas presentes na membrana mitocondrial durante a sinalização apoptótica induzida por estresse oxidativo (Figura 3C). A sinalização apoptótica inibe as etapas de iniciação, nucleação e expansão da via autofágica, reduzindo a degradação de mitocôndrias disfuncionais aumentando, consequentemente, a sinalização pró-apoptótica induzida por EROs (Figura 3D).
Figura 3. Regulação das vias de sobrevivência (autofagia) e apoptose induzido por
EROs. Setas verdes representam ativação. Setas vermelhas representam inibição. Setas grandes representam maior grau de ação entre as proteínas.
OBJETIVOS
Analisar a capacidade oxidativa do músculo gastrocnêmio vermelho dos animais dos grupos FOR e NFOR para avaliar a reprodutibilidade dos resultados referentes ao protocolo de OT.
Identificar a possível existência de um quadro pró-apoptótico induzido por EROs no músculo gastrocnêmio vermelho, e relacioná-lo a inibição da autofagia na musculatura esquelética dos animais NFOR em comparação aos animais do grupo FOR.
Objetivos específicos
Analisar a capacidade oxidativa do músculo gastrocnêmio vermelho dos grupos de animais controle, FOR e NFOR através da atividade enzimática da enzima citrato sintase.
Analisar amostras de lisado total e as frações citosólica, mitocondrial e nuclear do músculo gastrocnêmio vermelho dos grupos de animais controle, FOR e NFOR para as seguintes proteínas:
LC3I e LC3II total. Razão LC3II/I. Caspase-3.
JNK1/2 fosforilada na treonina 183 e tirosina 185. p53.
MATERIAIS E MÉTODOS
As amostras para este trabalho foram adquiridas em colaboração científica entre o Laboratório de Fisiologia do Exercício Equino e Farmacologia (LAFEQ) – DMFA/FCAV/UNESP – Jaboticabal, coordenado pelo Prof. Dr. Guilherme de Campos Ferraz e o Laboratório de Bioquímica do Exercício (LABEX) – UNICAMP, coordenado pela Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo sob certificação do comitê de ética no uso de animais da UNICAMP (CEUA/UNICAMP) (Anexo I). O protocolo de OT foi realizado no LAFEQ. As preparações das amostras de lisado total e das frações citosólica, mitocondrial e nuclear, a determinação da atividade enzimática da citrato sintase e os western blots foram feitas no LABEX.
Animais
Cem ratos machos jovens da raça Wistar de 2 meses de idade com massa corporal entre 150g e 200g foram mantidos em ambiente com a temperatura controlada na média de 23ºC, fotoperíodo de 12 horas com ciclo de luz claro-escuro invertido e alimentados com ração e água ad libitum.
Protocolo de Treinamento
O protocolo de treinamento foi realizado conforme proposto por Hohl et al.8, modificado no sentido de conter uma semana a mais (12ª semana com 4
sessões de treinos diários com 2h de descanso entre elas). Inicialmente os animais foram submetidos a 3 semanas de adaptação a esteira composta por 10 minutos a uma velocidade de 12 m/min, 1 vez ao dia, por 5 dias/semana para posteriormente serem submetidos ao protocolo de treinamento. Após as 3 semanas adaptativas, o protocolo teve duração de 12 semanas de exercício contínuo. As sessões de treinamento ocorreram durante o ciclo escuro, que corresponde ao período de atividade dos animais. O protocolo está descrito na Tabela 1.
Tabela 1. Protocolo de treinamento (Hohl et al.8) com 2 semanas de treinamento
4x/dia.
Fases do Protocolo Semana Teste de desempenho (Tmáx) Velocidade (m/min) Tempo (min) Frequência de sessões diárias Recuperação (horas) Adaptação a Esteira 1 2 3 Tmáx-1 12 12 12 10 10 10 1x 1x 1x 24 24 24 Fase 1 Treinamento Adaptativo (TA1) 1a 2a 3a 4a Tmáx-2 15 20 23 25 20 30 45 60 1x 1x 1x 1x 24 24 24 24 Fase 2 Treinamento Adaptativo 2 (TA2) 5a 6a 7a 8a Tmáx-3 25 25 25 25 60 60 60 60 1x 1x 1x 1x 24 24 24 24 Fase 3 Treinamento 2x/dia (T2x) 9 a Tmáx-4 25 60 2x 4 Fase 4 Treinamento 3x/dia (T3x) 10 a Tmáx-5 25 60 3x 3 Fase 5 Treinamento 4x/dia (T4x) 11a 12a Tmáx-6 Tmáx-7 25 25 60 60 4x 4x 2 2 Teste de Desempenho
Todos os testes de desempenho (Tmáx) foram aplicados 60 horas após a última sessão de treino da respectiva fase, com retorno das atividades 48 horas após o teste. Após a fase 5 (Tmáx-7) os animais foram sacrificados imediatamente após o teste de exaustão. Os animais foram pesados antes do início dos testes. O teste iniciou com os animais correndo em esteira sem inclinação e com velocidade inicial de 12 m/min, com incremento de 1 m/min a cada 2 minutos, até atingir a velocidade de 20 m/min. A partir daí o incremento da esteira passou a ser de 2 m/min a cada 3 minutos, até que o animal atingisse a exaustão, definida a partir do momento em que os animais tocaram a parte de trás da grade da esteira cinco vezes em um minuto8, ou permaneceram na grade
por um período maior que 10 segundos. No momento da exaustão o teste foi encerrado.
Análise de Desempenho
A análise do desempenho (D) dos ratos ao longo do protocolo foi realizada por meio da quantificação de uma variável relacionada ao trabalho mecânico (W) realizado por eles durante os testes. Devido ao protocolo de teste de desempenho prever estágios de intensidades crescentes onde cada qual exige trabalho mecânico (W), a soma do trabalho destes estágios forneceram a quantificação do desempenho do referido teste, e para isto foi levado em
consideração a variação de massa do animal, sendo esta forma a mais indicada para estudos longitudinais72. O desempenho (D) esta exemplificado na seguinte
equação:
D = W = K x m x d
Onde: (W) = proporção do trabalho mecânico realizado pelo animal expressa em Kg.m (quilograma x metro); (K) = constante; (m) = massa do animal; (d) = distância percorrida pelo animal. OBS: (W) não é o trabalho mecânico definido pela física, e sim uma quantificação proporcional a esse trabalho e está referido como desempenho (D).
Grupos de Animais
Somente os ratos que apresentaram valores de desempenho entre 70 e 230 kg.m no teste 1 (Tmáx-1) realizado ao final do período de adaptação a esteira foram selecionados para o estudo (n=49). Deste total, foram selecionados aleatoriamente o grupo controle (C) (n=16). O grupo C realizou os testes de desempenho nos mesmos momentos dos animais treinados. Para isso o grupo C foi submetido a 10 minutos de corrida com velocidade de 12m/min, duas vezes na semana. Os demais ratos (n=33) foram submetidos ao protocolo de treinamento, sendo ao final do último teste (Tmáx-7) classificados de acordo com o desempenho em 2 sub-grupos: NFOR (n=14) e FOR (n=19). Logo após o Tmáx-7, oito animais de cada grupo (C, FOR e NFOR) sofreram eutanásia para retirada dos tecidos, sendo estes os grupos utilizados neste trabalho. A Figura 4 representa um organograma do protocolo.
Figura 4. Organograma representando o protocolo. C= controle; FOR = functional
overreaching; NFOR = non-functional overreaching; Tmáx-1 e 7 = teste de desempenho 1 e 7; TA1 = Treino adaptativo 1; TA2 = Treino adaptativo 2; T2x = Treino 2x/dia; T3x = Treino 3x/dia; T4x = Treino 4x/dia.
Seleção dos Grupos de Animais
Os animais dos grupos FOR e NFOR foram identificados após o teste 7 (Tmáx-7) através de uma reta ajustada por quadrados mínimos considerando os valores de desempenho aferidos nos Tmáx-2 ao Tmáx-7. O ajuste da reta representa a tendência de aumento ou queda de desempenho em relação ao coeficiente angular (α) do grupo C, que apresentou um valor de α = 14,38 ± 15,36 kg.m. O valor determinado para a separação foi então obtido a partir da média do coeficiente angular menos 1 desvio padrão, resultando em αcrítico = - 0,98
kg.m. Assim, os animais que seguiram o protocolo de treinamento que apresentaram um α menor que - 0,98 kg.m após o Tmáx-7 foram classificados como NFOR (n=14) e aqueles que apresentaram um α igual ou maior que - 0,98 kg.m foram classificados como FOR (n=19).
Eutanásia e Amostras
A eutanásia dos animais foi realizada logo após o Tmáx-7, com uma associação anestésica via i.p., contendo ketamina, xilazina e acepromazina nas doses de 5,56, 0,55 e 0,11 mg.kg-1, respectivamente, seguido de punção
vermelha do músculo gastrocnêmio foram dissecadas, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C para posteriores analises.
Lisado Total
Para preparação do lisado total, 50 mg de músculo gastrocnêmio foram pulverizados sob nitrogênio líquido. O músculo em pó foi homogeneizado em 500 µl de tampão de lise (50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% deoxicolato de sódio, 0,1% SDS e inibidor de protease (Sigma-Aldrich)) por sonicação (dez pulsos, 2” cada a 80% da potência com 20” de intervalo) sob banho em fase de gelo e água. Em seguida os homogenatos foram mantidos por 20 minutos sob banho em fase de gelo e água e centrifugados por 10 minutos a 1000 g. O sobrenadante foi resgatado e o conteúdo total de proteínas foi determinado pelo método de Bradford com modificações73.
Fracionamento subcelular
O protocolo de fracionamento subcelular está descrito em detalhes no capítulo 2 da presente dissertação. O conteúdo total de proteínas de cada uma das frações subcelulares foi determinado pelo ensaio de Bradford com modificações73. As frações foram discriminadas através do western blot para
proteínas marcadoras de cada fração: alfa tubulina, Tom20 e histona H3 para as frações citosólica, mitocondrial e nuclear, respectivamente.
Atividade enzimática da Citrato Sintase
A atividade da enzima citrato sintase foi determinada conforme proposto por Srere74 com modificação para microplaca. Utilizamos 20 µg de proteína
diluída em 140 µl de 100 mM Tris-Cl pH 8,3, adicionamos 20 µl de 1 mM DTNB [5,5’dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)] (Sigma-Aldrich), 20 ul de 3 mM de Acetil-Coa (Sigma-Aldrich) e realizamos 13 leituras da absorbância a 412 nm a cada 15 segundos num intervalo de 3 minutos. Após a leitura inicial adicionamos 20 µl de 5 mM de Oxaloacetato (Sigma-Aldrich) para iniciar a reação e a releitura da absorbância nos mesmos padrões anteriores. A atividade da citrato sintase foi expressa em nmol.min-1.μg de proteína-1.
Western Blot
As amostras de lisado total (30 µg de proteína) e as frações subcelulares (10 ug de proteína) foram resolvidas em gel de SDS-PAGE, transferidas para membrana de PVDF de 0.22 μm (Bio-Rad), bloqueadas com 3% de BSA (Bovine Serum Albumin) por 1 hora a temperatura ambiente e incubadas overnight com anticorpo primário para GAPDH (Santa Cruz,1:1000), alfa-tubulina (ABCAM, 1:1000), Tom20 (Santa Cruz, 1:1000), histona H3 (ABCAM, 1:1000), p53 (ABCAM,1:1000), JNK1/2 fosforilada na treonina 183 e tirosina 185 (ABCAM,1:1000), caspase-3 fragmento p12 (ABCAM,1:1000) e LC3 (ABCAM, 1:1000). Após as lavagens as membranas foram incubadas por 1 h a temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado a HRP (CST, 1:5000) e reveladas utilizando ECL (Thermo Fisher) no fotodocumentador (UV Tech). A intensidade das bandas foi quantificada pelo software imageJ.
Análise Estatística
Os dados de western blot passaram pela análise de variância (ANOVA) com pós teste T pareado, sendo considerados significativo valores de p<0,05.
RESULTADOS
Desempenho dos animais ao longo do protocolo
Os dados de desempenho foram obtidos da parceria entre o Labex e o grupo do Prof. Guilherme (Unesp-Jaboticabal) e fizeram parte da tese de mestrado da aluna Henriette Moranza75.
A Figura 5 apresenta o comportamento do desempenho dos animais nos testes realizados ao longo do protocolo.
Figura 5. Desempenho dos grupos controle, "functional overreaching" (FOR) e
"non-functional overreaching" (NFOR) nos Tmáxs. De Tmáx-1 a 7: C, n = 16; FOR, n = 19; NFOR, n = 14. * indica aumento de desempenho intragrupo em relação ao Tmáx-1 (P < 0,05). α indica redução de desempenho em relação ao Tmáx-6 (P < 0.05). Letras diferentes indicam diferença entre os grupos (P < 0,05). Figura adaptada de Moranza et al., 2017 – tese de mestrado75.
Não houve diferença no desempenho entre os grupos no Tmáx-1 (p<0.651). O desempenho dos grupos FOR e NFOR foram superiores ao desempenho do grupo C a partir do Tmáx-2 (p<0.001). Em comparação ao grupo C, o desempenho do grupo FOR permaneceu superior até o Tmáx7 (p<0.001) e do grupo NFOR até o Tmáx-6 (p<0.001). Não houve diferença no desempenho entre o grupo C e NFOR no Tmáx-7. Os grupos FOR e NFOR se diferenciaram a partir do Tmáx-4 (p<0.001) permanecendo esta diferença até Tmáx-7 (p<0.024). Os animais do grupo NFOR apresentaram queda de desempenho no Tmáx-7 (p<0.001).
