Provas bioquímicas para a identificação de Staphylococcus aureus

As colônias típicas e atípicas isoladas das amostras de leite in natura, de cada placa selecionada, foram transferidas, com auxílio de agulha de platina, no mínimo, cinco colônias típicas e igual número de atípicas, para tubos de ensaio contendo 0,5ml de caldo infusão de cérebro e coração (BHI, MERCK), seguido de incubação a 35oC ou 37oC, por 24 h. Em seguida as culturas foram estridas na superfície de tubos contendo agar tripticase de soja (TSA, MARCA). A partir do agar TSA as linhagens isoladas foram submetidas aos seguintes testes: coloração pelo método de Gram, produção de coagulase, termonuclease (Tnase), fermentação da glicose (anaerobiose), fermentação do manitol (aerobiose e anaerobiose) e produção de hemólise em agar sangue de carneiro (KLOOS, 1990).

Nos tubos contendo culturas crescidas por 24 horas em caldo infusão de cérebro e coração foram pipetados 0,3 mL de plasma de coelho. Os tubos foram incubados a 37o_{C por 24 horas sendo realizada uma leitura preliminar após 6} horas de incubação. Foram utilizados controles positivo (cepa padrão coagulase positiva) e negativo (caldo infusão de cérebro coração mais plasma) para a realização deste teste. Em seguida foi feita a leitura dos resultados comparando- os com o padrão utilizado.

4.3.2.2 - Produção de enterotoxina

Do total de 299 cepas de Staphylococcus spp. isoladas, aquelas que apresentaram um mesmo perfil bioquímico-fisiológico e eram procedentes de uma mesma amostra foram agrupadas, formando um total de 75 “pools”. Os “pools” foram crescidos em 5,0 ml de caldo BHI por 24 horas a 370 C. Para testar a enterotoxigenicidade das culturas, foi utilizado o método de plaqueamento em membrana de diálise sobre ágar. Placas de Petri preparadas com 20 mL de ágar infuso de cérebro e coração (BHI) acrescido de 1% de extrato de levedura e 0,1% de fosfato dibásico de potássio, foram cobertas com disco de membrana de diálise Spectra/6000 – 8000 – 100mm, esterelizadas pelo calor (OLSON et al., 1970). Após a acomodação cuidadosa da membrana sobre o ágar, 0,5 mL do inóculo do “pool” foi espalhado com auxilio de uma alça de Drigalski, em seguida a placa foi incubada a 37°C por 24 horas. Após este procedimento o crescimento bacteriano foi lavado da superfície da membrana com 2,5 mL de tampão PBS (Na2HPO4 0,02M, pH 7.4), em duas etapas, usando-se 1,5 mL e 1,0 mL do mesmo. Em seguida, o material assim obtido, foi centrifugado a 10.000g por dez minutos a 4ºC. O sobrenadante obtido foi transferido para um frasco de vidro com tampa e acrescido de 20μl de timerosol como conservante e, posteriormente, utilizado no teste para detecção de enterotoxina (CARMO, 1997; CARMO, 2001).

Para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas foi utilizado o método Sensibilidade Ótima em Placa (OSP) (ROBBINS et al. 1974). Neste método, 3mL de ágar preparado com 1,2% de ágar nobre em tampão PBS 0,02M, pH 7.4 foi distribuído em placas de Petri 50mm x 12 mm. Após a solidificação, foram feitos 5 orifícios de 8,3 mm e 2 medindo 6,7 mm, conforme molde mostrado na figura 1. Nos dois orifícios menores foram colocados 4μg/mL de uma toxina padrão e o orifício central foi preechido com um anti-soro de título conhecido, de forma que as linhas de precipitina formadas pela reação antigeno/anticorpo, se situassem na metade das distâncias entre este e cada um dos orifícios menores. Os outros orifícios restantes foram preechidos com os sobrenadantes das culturas testes, obtidas na etapa anterior. Assim, diferentes placas foram utilizadas para cada enterotoxina a ser testada (SEA, SEB, SEC, SED e toxina TSST-1). Após a inoculação, as placas foram incubadas em câmara úmida a 37°C por 24 horas. Foram consideradas positivas as placas que apresentaram uma linha de precipitina entre o sobrenadante e os anti-soros testados (CARMO, 1997; CARMO, 2001). As toxinas-padrão e os anti-soros específicos utilizados neste estudo foram gentilmente cedidos pelo Dr. Luiz Simeão do Carmo (Laboratório de Enterotoxinas da FUNED).

4.3.4 – Contagem de coliformes totais e fecais

A enumeração de coliformes totais e fecais foi baseada na técnica dos tubos múltiplos utilizando-se três séries de três tubos. Para a realização do testte preseuntivo o meio de cultura usado foi o caldo lauril sulfato (LST). A partir das diluições previamente preparadas foi inoculado um ml nos tubos contendo LST. Estes foram incubados por 24-48 horas a 35-37ºC. Os tubos positivos onde houve desenvolvimento de turvação e formação de bolha de gás no interior do tubo de Durhan, foram inoculados em caldo verde brilhante bile 2%, com o auxílio de alça de platina para a realização do teste confirmativo para coliformes totais. A incubação dos tubos foi realizada a 35-37ºC por 24-48 horas. A partir dos tubos

positivos foram inoculados tubos contendo caldo EC, para a confirmação da presença de coliformes fecais. Após o período de incubação de 24 horas a 44,5ºC + 0,5ºC foi realizada a leitura dos tubos positivos.

4.3.5 – Contagem de Bacillus cereus

Para a contagem de Bacillus cereus nas amostras de leite, 0,1ml das diluições 10- 1_{, 10}-2, ₁₀-3 _{foram inoculadas e espalhadas na superfície de placas contendo o} meio de ágar manitol-vermelho de fenol-polimixina e, incubadas a 35-37°C por 24- 48 horas. Após o crescimento, as placas que apresentaram colônias com as seguintes características: cerosas, com coloração rósea indicativa de manitol negativo, circundadas por um halo de precipitação evidenciando-se a produção de lecitinase foram contadas e selecionadas para a realização das provas bioquímicas. Com auxílio de uma alça de níquel-cromo, as colônias selecionadas foram transferidas para tubos contendo ágar nutriente inclinado e incubadas a 35- 37°C por 24 horas. Transcorrido este período, foi realizada a coloração de Gram das amostras e, foram consideradas características as culturas que apresentaram bacilos gram-positivos, com esporos elipsoidais, centrais ou sub-terminais não- deformantes. A partir da cultura em ágar nutriente, foram realizadas as seguinte provas: fermentação de glicose, teste de Voges-Proskauer, hemólise em ágar sangue de carneiro.

4.3.6 - Pesquisa de Salmonella spp.

Para a pesquisa de Salmonella spp., 25 ml de cada amostra de leite foi transferida, assepticamente, para frascos contendo 225ml de água peptonada 1% acrescida de 2ml de solução de verde brilhante 0,25%, para inibir o crescimento de microrganismos Gram positivos. Os frascos foram incubados por 24 horas a 35-370_{C. Nesta fase de pré-enriquecimento, o objetivo foi reparar as células} injuriadas e diluir as substâncias tóxicas que possam estar presentes no alimento. Em seguida, foi realizada a fase de enriquecimento seletivo em caldo selenito

cistina e caldo Rappaport-Vassiliadis para favorecer o crescimento de Salmonella e inibir o crescimento da microbiota acompanhante. Foram transferidos 1ml do subcultivo em água peptonada para tubos contendo 10 ml de caldo selenito cistina e 0,1 ml para tubos contendo 10 ml de caldo Rappaport.-Vassiliadis. Os tubos de caldo selenito cistina foram incubados a 35-37o_{C por 24 horas e os tubos de} Rappaport-Vassiliadis foram incubados a 43o_{C por 24 horas. Após o período de} incubação uma alçada foi semeada por estria em placas contendo os meios Salmonella-Shigella (SS) e Hecktoen entérico (He). As placas foram incubadas por 24 horas a 35-37o_{C. Após este tempo, foi observada a presença de colônias} típicas com as seguintes características: em ágar Hecktoen entérico (He) as colônias de Salmonella são de cor esverdeada, com ou sem centro negro. Algumas cepas podem apresentar colônias com grande centro negro ou totalmente negras e brilhantes; já em ágar Salmonella-Shigella (SS) as colônias de Salmonella são incolores tendendo ao amarelo, excepcionalmente com centro negro. Após a observação das características morfológicas das colônias nos meios semeados foram selacionadas de cada placa duas ou mais colônias consideradas típicas e semeadas no meio de IAL (Instituto Adolfo Lutz). Os tubos foram incubados a 35-37oC por 24 horas e, em seguida realizada a leitura.

4.3.7- Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes.

Para a determinação de Listeria monocytogenes, 25 ml de cada uma das amostras, foram pipetados assepeticamente, e adicionados de 225ml de caldo para enriquecimento de Listeria (LEB1). A mistura foi homogeneizada e incubada por 24-48horas a 300_{C (SILVA et al., 1998). Após a incubação, uma alíquota de} 0,1 ml foi transferida para 10ml de caldo para enriquecimento de Listeria (LEB2) para o enriquecimento secundário e, incubada por 24-48 horas a 300_C (FURLANETTO et al., 1996). Transcorrido este tempo, uma alçada do cultivo do caldo LEB2 foi semeada na superfície dos meios: ágar PALCAM e ágar Oxford. As placas foram incubadas a 300_{C por 24-48 horas. Em seguida, as colônias} características de Listeria foram semeadas em ágar tripticase de soja-extrato de

levedura (TSA-TE) e incubadas a 300C por 24-48 horas. Após a incubação, as colônias foram submetidas às provas de coloração de Gram, motilidade em tubo, reação da catalase (FURLANETTO et al., 1996).

4.3.8 – Pesquisa de Campylobacter spp.

Para determinação da presença de Campylobacter spp., as amostras de leite foram homogeneizadas e em seguida, uma aliquota de 30 mL centrifugada a 15000 rpm por 20 minutos (4ºC). Descartado o sobrenadante, 0,1mL do pelete formado foi transferido para Caldo Brucela suplementado com solução redutora F.B.P.(Sulfato Ferroso 0,25g/L, Metasulfito de Sódio 0,25g/L e Piruvato 0,25g/L), 5mL para 100mL de meio, solução antibiótica I (vancomicina 15mg, Trimrtoprim 7,5mg e Polimixina B 8mg em 10 mL de água destilada estéril), 1mL para cada 100ml de meio. Os tubos foram incubados por 48 horas a 43±0,20 _{C em atmosfera} de microaerofilia (Anaérocult C-MERCK). Em seguida, as amostras foram plaqueadas por esgotamento (plaqueamento em T) em uma base rica (ágar brucella, BHI etc.) suplementado com F.B.P e solução antibiótica II (Trimetoprim 10mg, Polimixina B 8mg, Actidione 100mg e Cefalotina 10mg em 10 mL de água destilada estéril), nas mesmas proporções, e carvão a 5g%. As placas foram incubadas por 48 horas a 43±0,20 _{C em atmosfera de microaerofilia (Anaérocult C-} MERCK). As colônias suspeitas selecionadas (colônias com brilho molhado, convexas e às vezes espalhadas ao longo da estria), foram submetidas à coloração de Gram apenas com cristal violeta para a observação da morfologia típica do gênero (bastonetes finos e curtos em forma de “S” ou espiral),

CONCLUSÕES

- Todas as amostras de água encontram-se fora dos padrões de potabilidade estabelecidos pela Legislação vigente (Portaria 1469 MS, 2000).

- As amostras de leite in natura das fazendas 2, 3, 6, 7 e 8 estavam dentro dos níveis de tolerância microbiológica estabelecidos para leite pasteurizado (Resolução RDC 12 MS, 2001). No entanto nas demais amostras o leite apresentou elevada contaminação por microrganismos indicadores de condições higiênico-sanitárias deficientes

- As amostras de “pingo” apresentaram elevado índice de contaminação por indicadores higiênico-sanitários, sendo, portanto uma importante fonte de contaminação para o produto final.

- A amostra de queijo Canastra da fazenda 8 foi a única que estava dentro dos padrões microbiológicos estabelecidos para queijos de leite pasteurizado (Resolução RDC 12, MS/2001).

- As enterotoxinas mais freqüentemente produzidas pelas cepas de Staphylococcus sp. isoladas das amostras foram a SEB e SEC. As cepas de S. aureus foram produtoras de enterotoxinas A, B, C e D e toxina TSST-1, enquanto que as cepas de Staphylococcus coagulase-negativa produziram as enterotoxinas B, C, D e toxina TSST-1.