DO SISTEMA RETÍCULO-ENDOTELIAL
O estudo experimental da fisiopatologia do sistema de ASCHOFF exige, por vezes, o conhecimento da capacidade fun- cional dos seus elementos. O exame histológico, que obriga ao sacrifício do animal, em virtude da impossibilidade da colheita de fragmentos dos vários órgãos sem provocar pro- fundas alterações do organismo, apenas orienta sobre uma das formas dessa actividade — a granulopéxica — sem mesmo fornecer indicações sobre o sistema no seu conjunto. Impõe-se, portanto, a necessidade de determinar a actividade funcional do S. R. E. por outros meios que, além de poderem eluci- dar-nos de modo mais completo, não tornem indispensável a morte dos animais e sejam ainda de fácil aplicação à patolo- gia humana.
Os primeiros ensaios neste sentido devem-se a SAXL
& DONATH, que se serviram do oleoconiol.
O oleoconiol é uma emulsão com 20 p. 100 de gordura e cujas gotículas, examinadas ao ultramicroscópio, se apresen- tam com maiores dimensões e mais brilhantes que as hemo- conias; aplicado em injecção intravenosa, desaparece rápida-
184 ERNESTO MORAIS
mente do sangue, em virtude da fixação da gordura pelos elementos do sistema retículo-endotelial, especialmente pelas células de KUPFFER.
Partindo-se da hipótese de que estes elementos, carre- gados de granulações, isto é, bloqueados, não são capazes de flocular, pelo menos na quantidade habitual, outras subs- tâncias, compreende-se a dificuldade da fixação do oleoconiol e, por conseguinte, a sua permanência mais demorada no meio sanguíneo. Se, pelo contrário, por qualquer razão, as células exercem uma granulopexia exagerada, aquele produto deixa rapidamente a corrente circulatória. A velocidade com que as gotículas de gordura desaparecem do sangue poderia, assim, indicar a actividade coloidopéxica do sistema retículo- -endotelial.
Baseados neste conceito, SAXL & DONATH injectam, por via intravenosa, 5 c.c. de oleoconiol e determinam o tempo que esta substância leva a deixar o meio sanguíneo. Em condições normais, bastam 6 a 10 minutos. Uma demora mais curta traduziria o exagero de actividade, a permanência mais demorada orientaria no sentido duma deficiência gra- nulopéxica.
No domínio da Patologia humana tem esta prova o inconveniente de provocar um conjunto de perturbações, inerentes à injecção intravenosa duma gordura e que, por vezes, revestem certa gravidade. Além disso, encontraram-se variações tam amplas em indivíduos normais que os resul- tados, fora deste estado, dificilmente se podem interpretar. No entanto, alguns autores a têm aproveitado, quer com fins exclusivamente' experimentais, quer como meio de apreciação clínica, não obstante JAFFÉ & BERMAN, depois das suas expe- riências no Cão, não hesitarem em afirmar: «A fine emulsion
of fat can be used as a liver function test, but not as test of the reticulo-endothelial system».
KAUFFMANN preconiza outro método, que tem o seu nome e consiste no seguinte: ,. .,.,
Segundo o autor, a actividade do sistema retículo-endo- telial está em relação com a abundância de elementos.rnono- citários na serosidade de flictenas produzidas pela aplicação
SISTEMA RETÍCULO-ENDOTELIAL 185
de ceroto de cantáridas sobre a pele (porção inferior da coxa ou parte inferior da região dorsal). A grande abundância de monócitos na referida serosidade corresponderia intensa acti- vidade do sistema, e vice-versa.
Este método, duma simplicidade notável, tem sido obje- cto de justa crítica: demonstrou-se, de facto, que os elementos mononucleados do líquido flictenular não são apenas monó- citos; neles se compreendem também células endoteliais, provenientes da ruptura dos capilares dérmicos, e histiócitos deslocados do tecido subepidérmico pela acção irritante das cantáridas (CASABONA).
ADLER & REIMANN, quási contemporaneamente a SAXL & Do- NATH e baseando-se no mesmo princípio que guiou estes
autores, propuzeram, com a mesma finalidade, o uso dum
soluto de vermelho do Congo a 1 p. 100. Nesta prova, a actividade funcional do sistema retículo-endotelial é avaliada pela rapidez de desaparição do corante da corrente circula- tória.
O vermelho do Congo (diparadiaminodifenildiazobinafto- nato sódico) é uma substância obtida pela combinação das moléculas de ácido naftónico e de benzidina diazotada e tem a seguinte fórmula de constituição (ROFFO <& CALCAGNO) :
H NH2 H H H H NH2 H
H H H H
S03Na 503Na
Diluído a l p . 100 é completamente inócuo, afirmam to- dos os autores que o têm usado; há até quem, modernamente, o prescreva como agente terapêutico em determinadas afec- ções (ZOLEZZI e ROSSAK).
Antes de utilizado por ADLER & REIMANN para o estudo do
sistema retículo-endotelial, serviu a GRIESBACH e outros inves-
186 ERNESTO MORAIS
nismo, e a BENNHOLD para corar vitalmente a substância
amilóide.
O vermelho do Congo, que reveste forma coloidal em meio aquoso, com micelas de carga electro-negativa, está em condições de flocular nas células do sistema retículo-endotelial, — dizem-no, além dos autores do método, PASCHKIS, SCHLAMPFER, NlKOLAEFF & TlCHOMIROFF e OUtl"OS.
No mesmo sentido parecem depor as observações clínicas de WELTMANN & DEUTICKE e de SCHÕNIG, em cujos trabalhos se
refere que, em certas afecções, a deminuição da velocidade de eliminação do corante está relacionada com o grau lesio- nai do sistema de ASCHOFF.
Embora tenha de fazer oportunamente referência aos trabalhos de BENNHOLD, não devo deixar de acentuar, desde já,
que este autor, pondo de parte o sistema retículo-endotelial para explicar a permanência, mais ou menos demorada, do vermelho do Congo na corrente circulatória, liga importância preponderante ao papel adsorvente desempenhado pelas al- buminas plasmáticas.
Das provas funcionais que acabo de mencionar, ensaiei apenas a de ADLER & REIMANN. A S minhas experiências, reali-
zadas exclusivamente no Coelho, representam uma contri- buição para o estudo do mecanismo da prova do vermelho do Congo e da sua importância na determinação da activi- dade funcional do sistema retículo-histiocitário.
Técnica. — Na preparação do soluto de vermelho do Congo segui a técnica aconselhada por MOGENS e minuciosa-
mente descrita num trabalho de STHURRAT, dispensando pe-
quenos pormenores, porque o corante se destinava a ser injectado em Coelhos e não no Homem.
Em tubo de ensaio esterilizado pesa-se um decigrama de vermelho do Congo Grilbler retirado do respectivo frasco com uma espátula de vidro passada à chama. Adicionam-se- -lhe 10 c.c. de água bidestilada estéril e agita-se até se con- seguir a limpidez e transparência perfeitas do soluto, que, depois de filtrado, se submete à temperatura de 90 graus du- rante 15 minutos.
SISTEMA RETÍCULO-ENDOTELIAL 187
O corante assim obtido utilizava-o sempre no próprio dia da preparação e na quantidade de 0,8 c.c. por quilograma de peso vivo.
Por punção cardíaca retiram-se 6 c.c. de sangue, que se lançam imediatamente num tubo de centrífuga com oxalato de potássio em pó, e agitam-se muito docemente com uma vareta de vidro para íavorecer a mistura. Procede-se, em se- guida, à injecção da dose conveniente na veia marginal da orelha do animal.
Precisamente 4 e 60 minutos depois desta injecção e com os cuidados já referidos, de novo se colhe sangue, que se centrífuga durante algum tempo, a 2000 rotações por minuto, para separar o plasma. Antes de qualquer ensaio colorimé- trico verifica-se a ausência de hemoglobina no plasma, quer por meio do exame espectroscópico, quer pela adição de ácido azótico ao plasma diluído. No primeiro caso, a hemoglobina revela-se pelas suas faixas características e, no segundo, pelo aparecimento de nuvens negras. Se qualquer destas hipóteses se verifica, deve repetir-se a experiência, porque a dosagem colorimétrica seria falseada pela sobreposição da côr vermelha da hemoglobina à côr do vermelho do Congo.
Havendo o cuidado de utilizar seringas e tubos humede- cidos com soro fisiológico e de agitar docemente o sangue para a mistura com o oxalato de potássio, a hemólise é excepcional ou, pelo menos, tam pouco acentuada que não se revela pelos métodos habituais de pesquisa.
A punção cardíaca constitui um meio simples e seguro de obter, no Coelho, certa quantidade de sangue, em curto prazo de tempo e nas condições necessárias à prova do vermelho do Congo. Na grande maioria das vezes, a punção é perfeita- mente anódina e só em casos raros pode determinar a morte do animal, como na hipótese de a agulha não atingir o ven- trículo esquerdo, mas sim a aurícula ou os grossos vasos da base do coração. Nestas condições, se a agulha fôr bastante fina —como convém, aliás —e a morte não surge rapidamente, o sangue, lentamente extravasado, pode acumular-se no peri- cárdio ou mesmo na pleura, originando uma causa de erro, que é bom conhecer. Para ela chamarei oportunamente a atenção.
188 ERNESTO MORAIS
No coelho em decúbito dorsal, bem seguro por um ajudante, introduz-se a agulha no espaço intercostal esquerdo corres- pondente ao primeiro mamilo, dando-lhe uma orientação tal como se a quizéssemos fazer sair um centímetro abaixo do lugar simétrico do hemitórax direito; em dado momento, se a introdução da agulha se faz lentamente, notam-se primeiro as pulsações cardíacas transmitidas à mão através da seringa e, pouco depois, vê-se o sangue afluir a esta.
Esta técnica só em casos raros me inutilizou algumas experiências por morte dos animais; quási sempre me per- mitiu fazer várias colheitas (10 nalguns casos) no curto es- paço de duas horas, sem o mínimo inconveniente.
Obtido assim o plasma, procedia ao exame colorimétrico em comparador de HELUGE. Numa das provetas lançava exac- tamente 1 c.c. de plasma colhido 4 minutos depois da injec- ção, noutra todo o obtido na terceira colheita, isto é, após 60 minutos. Diluindo o plasma mais corado com plasma do mesmo animal, mas isento de corante, até igualdade de colo- ração, obtinha-se facilmente a percentagem do vermelho do Congo existente no sangue ao cabo duma hora, partindo do princípio de que aos 4 minutos circulavam 100 p. 100 do co- rante injectado.
O valor assim obtido — índice de retenção — indica a quan- tidade de corante retida no plasma e, portanto, não eliminada nem fixada pelo sistema retículo-endotelial. Este índice, como bem se compreende, varia na razão inversa da actividade do sistema : aos números mais baixos corresponde maior activi- dade, e inversamente.
Nalgumas experiências, a par desta dosagem, avaliava ainda as diferentes concentrações ao fim de 4, 30, 60 e 90 mi- nutos, por meio do colorímetro de WALPOLE e tomando como padrão um soluto de vermelho do Congo.
A prova de ADLER & REIMANN, segundo a técnica por mim seguida, assenta nas seguintes bases:
l.ft — São necessários 4 minutos para que o corante esteja
homogeneamente espalhado por todo o sangue; durante este tempo a eliminação é nula ou insignificante.
SISTEMA RETÍCUL0-END0TEL1AL 189
2.a — O corante desaparece do sangue porque é floculado ou eliminado pelo sistema retículo-endotelial.
A primeira afirmação facilmente se demonstra pela se- guinte experiência:
Obs. CVI1I— Coelho n.° 180-A, $, 1330 gr. de peso.
Após a laparotomia, introduzi cânulas de vidro nos ureteies e no canal colédoco. Logo que a bilis e a urina afloraram ao topo das cânulas, injectei 1,06 c.c. de vermelho do Congo. De 90 em 90 segundos, depois da injecção, colhia sangue numas das veias mesentéricas e recebia uma gota de bilis e outra de urina numa folha de papel de filtro.
Avaliava a concentração do comité no plasma sanguíneo por meio do comparador de WALPOLE; na folha de papel de filtro notava o apare- cimento do corante na bilis e na urina. Os resultados obtidos constam do Quadro XVII.
Q U A D R O X V I I
Concentração do V. C. no plasma, na bilis e na urina durante os primeiros 10 minutos
Tempo decorrido após a injecção Concentração no plasma Eliminação Tempo decorrido após a injecção Concentração no plasma
pela bilis pela urina
1,5 minutos 3 4 5,5 7 8,5 10 '/4000 '/•KW '/4500 '/4500 '/4750 '/5000 '/5750 0 0 0 vestígios ténues vestígios leves vestígios O O O O O O O
Como ali se vê, a eliminação urinária é nula e a biliar quási nula, a concentração do corante no plasma torna-se estacionária entre os 3 e 5,5 minutos, só começando a decres- cer ao cabo de 7 minutos. Assim se confirma que aos 4 mi- nutos o corante está homogeneamente distribuído pelo san- gue, que a eliminação biliar é nula ou de mínima importância
190 ERNESTO MORAIS
e que pela urina não se elimina corante, pelo menos durante o tempo da experiência.
Nos primeiros 4 minutos, pequeníssima quantidade de corante é, certamente, excretada pelas vias biliares. Todavia, se atendermos à quantidade eliminada naquele prazo de tempo (leves vestígios de vermelho do Congo) e a relacio- narmos com a sensibilidade do método colori métrico, verifi- ca-se que essa quantidade de corante é inferior às causas de
erro inerentes à colorimetria.
DIERYCK, que tanta importância liga a este facto, obtém, nas dosagens efectuadas no plasma, valores levemente supe- riores aos encontrados no soro e afirma ser essa diferença suficientemente pequena para não constituir causa de erro apreciável no estudo comparado da velocidade de desaparição do corante em diversas condições experimentais. Concordo plenamente com esta asserção, mas reconheço também que
a quantidade de vermelho do Congo eliminada pela bílis nos
primeiros 4 minutos ocasiona um erro menor, ou pelo menos igual ao motivado pelas diferenças entre as dosagens efec- tuadas no plasma e no soro sanguíneo.
DIERYCK usa um método diferente do que acabo de expor: compara, no colorímetro de WALPOLE, OS soros colhidos ao fim de 30 e 90 minutos. A quantidade de corante eliminada na- quele espaço de tempo mediria a actividade funcional do sistema e os seus valores variariam na razão directa dessa actividade. Aquele autor justifica o seu procedimento lem- brando que ao cabo de 4 minutos já foi eliminada unia parcela de corante e invoca também a maior regularidade de eliminação entre 30 e 90 minutos.
Quanto ao primeiro argumento, já mostrei a pouca im- portância que se lhe deve ligar; pelo que respeita ao segundo, parece-me que êle contraria o fundamento do método. De facto, se a prova está relacionada com a fixação do corante pelo sistema retículo-endotelial, ^como se pode avaliar essa fixação no prazo compreendido entre 30 e 90 minutos, se ao fim de meia hora já do plasma se eliminou uma quantidade importante ?
SISTEMA RETÍCULO-EKDOTELIAL 191
de todos os meus ensaios foi, como disse, 0,8 c.c. por quilo de peso vivo. O emprego desta dose, cerca de 5 vezes superior à habitualmente utilizada em Clínica, justifica-se pelo rápido desaparecimento, do soro sanguíneo, de pequenas quanti- dades de corante. Este facto, já referido por DIERYCK, pude verificá-lo em dois coelhos (Obs. CIX e CX). Com efeito, 60 minutos depois da injecção de 0,15 c.c. de vermelho do Congo
Fig. 33 - Eliminação do vermelho do Congo num coelho normal. (Obs. cxxn). Em abcissas o tempo em minutos, em ordenadas a concentração do
corante no plasma.
por quilo de peso vivo, o soro sanguíneo não apresentava vestígios do corante.
A eliminação do vermelho do Congo, injectado na dose conveniente para a prova de ADLER & REIMAXN, faz-se, com certa regularidade, entre 100 a 150 minutos; de começo muito rápida, torna-se mais lenta à medida que se afasta o momento da injecção e completa-se no prazo indicado (Fig. 35).
Se a experiência é mal conduzida, pode verificar-se uma excepção a esta regra. Assim aconteceu num animal esplene-
192 ERNESTO MORAIS
ctomizado e injectado com torotraste (Obs. CXI — Coelho n.° 171) em que a regularidade do desaparecimento do corante não se observou (Fig. 34).
Como se vê no gráfico da figura indicada, a concentração de 1/10.000, ao 30.° minuto, desceu a 1/18.000 decorrida uma hora, mas de novo atingiu 1/10.000 ao cabo de mais meia hora. Quere dizer, a concentração aumentou dos 60 aos 90 minutos,
Fig. 34 — Eliminação do vermelho do Congo num coelho esplenectomizado
e injectado com torotraste. (Obs. cxi).
Erro de técnica inerente à colheita de sangue no coração.
ao contrário do que acontece habitualmente. Todavia, passa- das duas horas, a quantidade de vermelho do Congo no plasma era deminuta (1/120.000).
Surpreendido com este resultado, sacrifiquei imediata- mente o animal para procurar, pela autópsia, a explicação do fenómeno. Na cavidade pericárdica havia grande quantidade de sangue ainda incompletamente coagulado e na aurícula esquerda notava-se, aberto, pequeno orifício feito pela agulha empregada na punção.
SISTEMA R E ï l c U L O - E N D O T E U A L 1 9 3
Provavelmente, na colheita realizada ao 30.° minuto, atin- giu-se a aurícula esquerda; o orifício deixado pela agulha
manteve-se aberto, em virtude da fraca espessura do miocár- dio naquele ponto, e deixou sair algum sangue para a cavi- dade pericárdica. A colheita do 60.° minuto fez-se em pleno ventrículo, mas na imediata — aquela em que há discordân- cia — deve ter-se aspirado sangue do pericárdio, portanto sensivelmente igual ao da colheita dos 30 minutos.
Se a verificação da irregularidade da curva não foi difícil neste caso, dado o grande número de dosagens a tempos diferentes, o mesmo nâo aconteceria se fizesse apenas as duas que são necessárias para a determinação da prova de ADLER & REIMANN, segundo a técnica de DIERYCK.
Resultados. — No Homem, o índice de retenção do ver- melho do Congo, quando a prova de ADLER & REIMANN se efectua para determinar a actividade funcional do S. R. E., varia entre 50 e 70, segundo UEDA & HARADA. Para BURBI, os valores normais estariam compreendidos entre 55 e 65.
Alguns autores verificaram, no estudo da amilose por meio desta mesma prova, um desperdício normal do corante injectado, o qual, em meu entender, se pode relacionar,
a priori, com a actividade do sistema histiocitário. Tal
desperdício é avaliado por GRAVANO em 23 p. 100 e por BENNHOLD e STHURRAT em 28 p. 100, isto é, os índices de retenção seriam, respectivamente, 77 e 78.
A prova efectuada no Coelho dá valores mais baixos, o que facilmente se explica pela rapidez com que o corante se elimina do soro sanguíneo deste animal.
DIERYCK concluiu, do estudo da prova em 100 coelhos
normais, que o índice de retenção variava fisiologicamente entre 20 e 30, em 28 p. 100 dos casos; o índice médio era
de 28
(').
(t) Deve notar-se que os valores encontrados por DIERYCK são, respectivamente, 80, 70 e 72, mas eles exprimem o quociente de eliminação, que varia no sentido inverso do indice de retenção de ADLER & REIMANN —isto é, um quociente de eliminação de 80 corres- ponde a um índice de retenção de 20, o quociente de 70 ao índice de 30, etc.
194 ERNESTO MORAIS
Antes de apreciar as variações do resultado da prova em coelhos injectados com diferentes substâncias coloidais e no intuito de obter um termo de comparação normal, fiz a prova do vermelho do Congo em 20 coelhos adultos, apa- rentemente normais e submetidos ao mesmo regime e habitat (Obs. CXII a CXXXI).
QUADRO XVIII
Resultados da prova do V. C. em coelhos normais
Observação índice de retenção Observação Índice de retenção CXII CX1V CXV CXVI CXVIl CXVIII CXIX CXX CXXI 59 55,5 48 55 47 43 40 39 41 41 CXXII CXXIII CXXIV CXXV CXXVI CXXVII CXXVIII CXXIX
cxxx
CXXXI 32,5 37,5 35 47,5 43,5 36 43 47 46 45No Quadro XVIII indico os respectivos índices de reten- ção. Como se pode ver, os seus valores estão compreendi- dos entre limites muito amplos: 32,5 e 59. A média aritmé- tica é de 43, número que se afasta bastante do obtido por
D l E R Y C K .
Como disse, o método empregado por este autor—a que chamarei método de DIERYCK — é um pouco diferente daquele que segui nas minhas pesquisas e que pode considerar-se clássico.
SISTEMA RETÍCULO-ENDOTEUAL 195
Para comparar os resultados fornecidos por um e outro, efectuei a prova do vermelho do Congo, pelos 2 métodos, em 8 coelhos, dos quais 2 normais, 1 esplenectomizado e 5 injectados com lítio-carmim.
Os números indicados no Quadro XIX permitem-me concluir que o método clássico dá um índice médio de retenção superior em 16 unidades ao de DIERYCK.
Por conseguinte, os meus valores e os deste autor são QUADRO XIX
Comparação dos resultados da prova do V. C. pelos métodos clássico e de Dieryck
Observação Condições do animal em experiência
índices de ret. pelos métodos
Diferenças Observação Condições do animal
em experiência Clássico DIERYCK Diferenças CXVIII CXIX CXXXIV CXXXVl CXLI CXL1I CXLIII CXLIV Normal . . . . Esplenectomizado . Inj. com carmim
» » a . a » » , , 0 J» >: » » » , , 40 39 45,5 37 15 33,5 25 38 18 27,5 42,5 28,5 0 18,5 4,5 7 22 11,5 3 8,5 15 15 20,5 31 Média aritmética . . . . 34,1 18,3 15,8
quási iguais, pois se juntar ao índice encontrado por DIERYCK (28) a diferença de 16 unidades, obtenho o valor do índice médio do resultado das minhas experiências (44).
Todavia, analisando minuciosamente o quadro em questão, verifica-se que ao lado de valores pouco diferentes por um e outro método —45,5 e 42,5 na Obs. CXXXIV — outros há muito afastados —38 e 7 na Obs. CXLIV. Pelo exame dos