Pesquisas sobre o isolamento e preparação de antocianinas se intensificou nos últimos anos por causa das exigências de análises quantitativas de bioativos. Entretanto, métodos simples e eficazes para a purificação em escala de antocianinas de produtos naturais são raramente relatados. Neste estudo, a mistura de antocianinas foi isolada a partir da borra do vinho tinto utilizando uma combinação de extração líquido-líquido e cromatografia em coluna aberta (CCA) estabelecendo um sistema de eluição eficaz para separar as antocianinas. Os resultados deste estudo podem ajudar a promover a purificação de antocianinas da maioria das variedades de uva, bem como de outros materiais vegetais. 4.1 - Introdução
Os baixos percentuais de extração, a instabilidade das antocianinas e as dificuldades na obtenção de padrões dificultam a exploração potencial sobre a bioatividade das antocianinas.
A maioria das pesquisas se limita ao uso de extratos de antocianinas brutos de legumes ou frutas. No entanto, a presença de compostos fenólicos não antociânicos e as impurezas inevitavelmente interferem na avaliação das atividades biológicas dos extratos de antocianinas brutos. Considerando estas questões, o isolamento e preparação de padrões de antocianinas puros de origem vegetal são necessários para quantificações mais precisas. Diversos autores já investigaram as propriedades benéficas das antocianinas. Apesar de seu significativo potencial ativo, no entanto, as antocianinas não têm sido amplamente utilizadas pela indústria alimentícia. (WANG et al., 2014)
Antocianinas são produtos de alto valor agregado (por exemplo, extratos de antocianinas de alta pureza) mas ainda não estão disponíveis no mercado. Assim a preparação de antocianinas puras é um desafio promissor. A purificação das antocianinas foi estudada utilizando uma combinação sistemática de extração líquido-líquido e cromatografia em coluna (CCA).
De um modo geral, pode-se dizer que, a cromatografia líquida e a cromatografia em coluna aberta são as técnicas mais aplicadas, quando os compostos em estudo são moléculas complexas e susceptíveis a degradação por outros procedimentos que envolvam processos de aquecimento (OLIVEIRA, 2005).
A cromatografia em coluna aberta (CCA) tem sido amplamente utilizada para isolar flavonoides, taninos, antocianinas. No entanto, a maior parte dos processos de extração envolvem solventes orgânicos tóxicos, incluindo metanol, acetona, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético (TFA) e acetonitrila. O presente estudo foi realizado em resposta a questões referentes aos benefícios nutricionais e de saúde dos produtos ricos em compostos bioativos como os da produção vinícola (WANG et al., 2014).
4.1.1 – Objetivo Geral
O objetivo deste estudo foi desenvolver um método natural e de baixo custo para a purificação de antocianinas usando as técnicas de cromatografia em coluna aberta e extração líquido-líquido.
4.2 - Purificação de antocianinas
Frequentemente, os aspectos qualitativos e quantitativos na análise de antocianinas são complicados devido à presença de outros compostos. A purificação de antocianinas é necessária porque os solventes utilizados para extração não são específicos para as antocianinas e quantidades consideráveis de outros compostos podem ser extraídas e concentradas nos extratos coloridos influenciando a estabilidade e/ou análise destes pigmentos (JACKMAN e SMITH, 1992).
A variedade e a quantidade de outros compostos dependerão do solvente e das metodologias utilizadas para a sua extração. Portanto, é necessário um pré-fracionamento destes extratos. Quando quantidades apreciáveis de lipídios, clorofilas, ou polifenois indesejados são suspeitos de estarem presentes nos extratos, estes materiais podem ser removidos por lavagem com éter de petróleo, éter etílico ou acetato de etila (JACKMAN e SMITH, 1992).
4.2.2 – Purificação em duas etapas extração líquido-líquido (ELL) e cromatografia em coluna aberta (CCA)
A extração líquido-líquido é uma operação de transferência de massa, em que uma solução líquida (“feed”) inicialmente contendo um ou mais solutos é completamente misturada com um líquido imiscível ou quase imiscível (solvente). O solvente apresenta afinidade
preferencial ou seletividade com um ou mais componentes do alimento (IGNAT et al., 2011).
Normalmente, esse método procede com um fluxo contínuo da fase móvel, que permanece até que todos os componentes da mistura em análise tenham saído da coluna e tenham sido detectados. A Figura 4.1 mostra esquematicamente como duas substâncias A e B podem ser separadas numa coluna por eluição.
Figura 4.1 Representação esquemática mostrando a separação de uma mistura
de componentes A e B através de uma coluna cromatográfica, por eluição.
Fonte: See e Hawkes, 1983.
A eluição envolve o transporte das espécies através da coluna pela adição contínua de fase móvel fresca (fluido de arraste). No instante inicial da análise (t = t0), uma pequena quantidade da amostra, que pode
inclusive estar diluída na fase móvel, é introduzida na coluna, no menor intervalo de tempo possível. Conforme são transportados pela fase móvel, que entra de forma contínua na coluna, os componentes A e B da mistura vão se distribuindo ao longo das duas fases, e começa a se acentuar a separação entre os componentes ao longo das fases estacionária e móvel. Com o decorrer do tempo que implica na adição de maiores quantidades de fase móvel, o componente que interage mais fracamente com a fase estacionária vai sendo preferencialmente arrastado pela fase móvel. Isso ocorre porque a velocidade de arraste de
um componente ao longo da coluna depende da fração de tempo que esse componente passa em cada fase: um componente que interage fracamente com a fase fixa, passa pouco tempo ligado à ela, permanecendo a maior parte do tempo na fase móvel. Idealmente, as diferenças entre velocidades de arraste leva à separação dos componentes da mistura em análise em bandas ou zonas da coluna. Com a continuação da passagem de fase móvel, as diferentes bandas vão se movendo ao longo da coluna, até atingir o seu final, onde são coletadas e/ou detectadas (HAWKES, 1983).