5.4.1 - Curva de calibração com padrões de antocianidinas
Após a preparação das curvas de calibração dos padrões de cloreto de cianidina e cloreto de malvidina as soluções foram injetadas separadamente no cromatógrafo líquido de alta eficiência sob as condições descritas no item 5.3.1.
As curvas de calibração apresentaram comportamento linear com um coeficiente de determinação R2 de 0,999 e 0,995 para o cloreto de cianidina e cloreto de malvidina, respectivamente (Apêndice A). 5.4.2 - Identificação das antocianidinas por cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE do extrato bruto e das frações obtidas após a etapa de purificação
Os perfis cromatográficos de cada padrão bem como os seus tempos de retenção são apresentados na Figura 5.1. Através do cromatograma, é possível confirmar a pureza dos padrões, uma vez que não foi observada nenhuma alteração em suas bandas
Figura 5.1 - Perfil cromatográfico obtido por CLAE dos padrões de
antocianidina cloreto de cianidina e cloreto de malvidina.
Os tempos de retenção do cloreto de cianidina e cloreto de malvidina são de 8,5 e 13,54 min, respectivamente. Valores muito próximos aos encontrados neste trabalho foram reportados por Kechinski (2011) que foram de 9,56 min para o cloreto de cianidina e 15,28 min para o cloreto de malvidina. Esta diferença no tempo de retenção dos padrões pode ser justificada devido ao fato que derivados de antocianidinas individuais respondem de forma diferente dependendo das condições utilizadas na análise, do grau de acilação, grau de glicosilação, diferentes ácidos, comprimento de absorção máximo e do efeito do solvente. Estes parâmetros podem influenciar no gradiente de eluição promovendo a variação da resposta das antocianidinas individuais (DURST e WROLSTAD, 2005; FRANCIS, 1982; GIUSTI e WROLSTAD, 2005; HONG e WROLSTAD, 1990, LEE, 2008). A Figura 5.2 apresenta o cromatograma do extrato bruto concentrado.
Figura 5.2 - Perfil cromatográfico obtido por CLAE das antocianidinas
presentes no extrato bruto concentrado.
A partir do cromatograma obtido pode-se observar que foram identificadas na amostra do extrato bruto duas antocianidinas: o cloreto de malvidina (tR=13,54 min) e o cloreto de cianidina (tR =8,5 min).
Segundo Takedoa e Dao (2008), a ordem de eluição deve ser do composto mais simples, a pelargonidina que apresenta hidrogênio nos radicais R1 e R2 para o composto mais complexo a malvidina que
apresenta o radical metoxi (OCH3) nas mesmas posições R1 e R2.
De acordo com Lee et al (2008) as amostras de uvas contêm sempre malvidina.
Pesquisas realizadas por Longo e Vasapollo (2005) e por Kallithraka et al. (2005), em uvas mostraram que os picos referentes às antocianinas aciladas foram os últimos a serem eluídos e que os picos referentes aos glicosídeos de delfinidina, cianidina, petunidina e malvidina foram eluídos antes de 13 min, o que está de acordo com o obtido neste estudo que obteve para o cloreto de malvidina um tempo de retenção de 13,54 min.
Os resultados encontrados por POMAR, NOVO e MASA, (2005) estão de acordo com os encontrados neste estudo. Os autores observaram que a malvidina foi a antocianina encontrada em maior proporção ao avaliarem 50 variedades de Vitis vinifera. Da mesma forma, em outro estudo de cultivares de Vitis vinifera, a malvidina representou cerca de 67 % do total de antocianinas, seguida pela peonidina, petunidina e delfinidina, sendo a cianidina a menos abundante. Em nosso estudo as antocianidinas identificadas através de padrões primários no extrato bruto foram: o cloreto de cianidina e cloreto de malvidina. A proporção presente de cloreto de malvidina:cloreto de cianidina foi de 7:1, sendo que o cloreto de malvidina representou 22,6 % do total de antocianidinas presentes no extrato.
As Figuras 5.3, 5.4 e 5.5 apresentam alguns dos perfis cromatográficos mais representativos das 17 frações obtidas após a etapa de purificação por extração líquido-líquido (ELL) e cromatografia em coluna aberta (CCA). O restante destes perfis está anexado ao Apêndice A.
Figura 5.3 - Perfil cromatográfico obtido por CLAE das antocianidinas
presentes na fração purificada (F12) do extrato da borra do vinho. Condições cromatográficas: as mesmas descritas na Tabela 5.1.
A fração F12 obtida após a etapa de purificação descrita no item 4.3.2 apresentou um percentual em área de cloreto de malvidina de 76,47 % e de 10,85 % de cloreto de cianidina. Comparando os cromatogramas, antes da purificação (extrato bruto) e da fração F12, obtida após a purificação, pode-se constatar que, para o extrato em estudo, o tempo utilizado foi efetivo para obter apenas as antocianidinas. Também confirmou-se a presença de pigmentos glicosilados na medida em que os picos presentes nos cromatogramas das antocianinas desapareceram após a purificação.
Figura 5.4 - Perfil cromatográfico obtido por CLAE das antocianidinas
presentes na fração purificada (F6) do extrato da borra do vinho. Condições cromatográficas: As mesmas descritas na Tabela 5.1.
Na Figura 5.4 foi uma das primeiras a ser eluída (F6) pode-se constatar um maior percentual em área do cloreto de cianidina 56,5 % e de 31,7 % de cloreto de malvidina, confirmando que a ordem de eluição das antocianidinas que é primeiramente a delfinidina, seguida de cianidina, petunidina, pelargonidina, peonidina e malvidina.
Figura 5.5 - Perfil cromatográfico obtido por CLAE das antocianidinas
presentes na fração purificada (F7) do extrato da borra do vinho. Condições cromatográficas: As mesmas descritas na Tabela 5.1
Na Figura 5.5 pode-se perceber que o pico referente ao cloreto de cianidina começa a desaparecer e o pico do cloreto de malvidina começa a se tornar mais acentuado.
De acordo com o cromatograma do extrato bruto (Figura 5.2) e das frações obtidas após a etapa de purificação pode-se perceber que a extração líquido-líquido seguida da purificação por cromatografia em coluna aberta contribuiu para a obtenção de frações com um teor de pureza satisfatório.
A separação das antocianidinas nas frações obtidas poderia ser melhorada se fossem efetuadas modificações na coluna cromatográfica aberta, utilizada na etapa de purificação, como: aumento da altura do leito, tempo de análise maior, e se as frações obtidas na primeira eluição com água acidificada 0,02 % de HCl tivessem sido coletadas e repassadas na coluna com etanol acidificado 0,02 %. Na Tabela 5.2 são apresentadas as concentrações em mg/L do cloreto de cianidina e cloreto de malvidina presentes no extrato concentrado e nas frações obtidas após a etapa de purificação.
Tabela 5.2 - Concentração de antocianinas no extrato bruto e nas frações
obtidas após a etapa de purificação.
Amostra Concentração em mg/L de cloreto de cianidina Concentração em mg/L de cloreto de malvidina Extrato concentrado 0,0015 2,165 F5 0,0001 0,0013 F6 0,0003 0,0041 F7 0,0001 0,0049 F8 0,0001 0,011 F9 0,0001 0,0255 F10 0,0001 0,0614 F11 0,0001 0,2471 F12 0,0005 0,4923 F13 0,0008 0,488 F14 0,0004 0,2941 F15 0,0002 0,1506 F16 0,0001 0,0642 F17 0,0001 0,0298
Pode-se perceber que no extrato bruto e no extrato purificado (Tabela 5.2) foram identificadas quantidades de antocianidinas sendo que a que se apresenta em maior quantidade é o cloreto de malvidina. De acordo com Cabrita et al. (2003), as antocianinas do gênero Vitis são a cianidina, a delfinidina, a peonidina, a petunidina e a malvidina. As suas quantidades relativas variam com a casta, mas a malvidina é sempre majoritária o que é corroborado pelos resultados obtidos.
De acordo com os resultados obtidos (Tabela 5.2) o extrato bruto apresenta 2,165 mg/L de cloreto de malvidina e a fração F12, a concentração de cloreto de malvidina foi de 0,492 mg/L (que corresponde a aproximadamente 22,78 % do total encontrado no extrato bruto) comparando estes resultados com o custo de 1 mg do padrão primário cloreto de malvidina (R$ 567,00; Nota Fiscal: 8202142833) o extrato da borra do vinho tinto é uma fonte promissora na exploração de compostos bioativos como as antocianidinas. Também se pode concluir que a etapa de purificação auxiliou na obtenção de compostos com elevado grau de pureza.
5.5 – CONCLUSÕES
Neste trabalho foi utilizado um método analítico para a caracterização do extrato etanólico rico em antocianidinas obtido a partir da borra do vinho tinto.
A metodologia analítica proposta para a separação e identificação das antocianidinas por CLAE juntamente com a prévia purificação do extrato por extração líquido-líquido e cromatografia em coluna aberta mostrou-se sensível e precisa na faixa de concentrações estudada, sendo adequada para a avaliação de antocianidinas em extratos vegetais.
Além disto as condições de extração utilizadas promoveram a hidrólise ácida das antocianinas reduzindo assim o número de compostos a serem identificados para apenas seis (antocianidinas), facilitando assim a caracterização do extrato.
Os picos referentes às agliconas testadas apresentaram-se bem definidos, separados, e com um tempo de análise relativamente curto (25 min) sendo que a ordem de eluição encontrada foi cloreto de cianidina e cloreto de malvidina.
No geral, observa-se que uma das maiores dificuldades na identificação das antocianinas individuais é a falta de padrões e que a escolha do método a ser utilizado depende do objetivo da análise. Para a detecção da presença de antocianinas em um vegetal, um simples teste utilizando-se cromatografia em papel pode ser suficiente. Métodos ópticos como UV-Vis são ferramentas complementares muito úteis para a caracterização de antocianinas. Identificações de antocianinas individuais exigem métodos mais avançados como espectroscopia RMN e espectrometria de massas. A combinação destas técnicas pode trazer informações suficientes para a completa elucidação da estrutura de uma antocianina.
CAPÍTULO 6 – MICROPARTÍCULAS EM ANTOCIANINAS