Quantificação de DBec incorporado

Nesta primeira fase do trabalho o DBec foi quantificado através da absorbância das suas soluções em acetonitrila no comprimento de onda de 239 nm. Para a determinação da concentração de DBec foi construída uma curva de calibração correlacionando absorbância e concentração da amostra. A leitura da absorbância da solução DBec/acetonitrila foi realizada com o espectrofotômetro Hitachi U-2001, em curto intervalo de tempo, de modo a prevenir a evaporação do solvente.

Foram também testados como solventes o clorofórmio e a solução de Ficoll® _{20%, e utilizados os mesmos métodos de quantificação.}

3.2.9.2 Cromatografia de Alta Performance (HPLC)

A quantificação do DBec através de análises de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) foi realizada à temperatura ambiente em um sistema Shimadzu LC-10AD, com uma pré coluna Guard Cartridge ACE 5 C18, e uma coluna de fase reversa Ace 5 C18 (150 mm x 4,0 mm DI (diâmetro interno)). A fase

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móvel utilizada foi a de 60 : 40 (v/v) acetonitrila: água a uma vazão de 1,0 mL/min. A detecção dos picos foi possível através do detector de UV-Vis

Shimadzu SPD-10AV, utilizando-se o comprimento de onda de 239 nm, e a quantificação processada em um integrador Shimadzu C-R6A Chromatopac.

Para a quantificação do DBec, este foi separado do Ficoll® _{como descrito}

em 3.2.8.2. A solubilização do DBec foi realizada utilizando-se acetonitrila de grau HPLC. A solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 μm, e posteriormente 20 μL foram injetados no sistema de HPLC. A quantificação foi realizada através da comparação das áreas de picos obtidas versus a concentração nos gráficos de calibração de DBec em acetonitrila.

O sistema e as condições cromatográficas empregadas nos experimentos estão descritas em detalhe na Tabela 4.

Tabela 4. Descrição do sistema e condições cromatográficas de HPLC.

Item Descrição

Sistema de HPLC Shimadzu LC-10AD

Coluna Cromatográfica Fase Estacionária Ace 5 C18, (150 mm x 4,0 mm DI) Octadecilsílica – C18 Tamanho de Partícula: 5 m Tamanho de Poro: 100 Å

(Advanced Chromatography Technologies)

Pré Coluna Guard Cartridge ACE 5 C18

Detector UV-Vis Shimadzu SPD-10AV

= 239 nm

Integrador Shimadzu C-R6A Chromatopac

Fase Móvel Acetonitrila:Água (60:40, v/v)

Vazão 1,0 mL/min

Temperatura Ambiente

Volume de Injeção 20 L

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67 3.2.9.2.1 Curva de Calibração

A solução padrão estoque de DBec utilizada para realizar a curva de calibração, foi preparada dissolvendo-se o fármaco puro em acetonitrila de grau HPLC em um balão volumétrico, obtendo-se uma concentração final de 0,02 mg/mL. As soluções padrões secundárias foram obtidas pela diluição apropriada em acetonitrila da solução padrão principal, esquematizada na Figura 19. Ao todo,

as soluções preparadas tiveram as seguintes concentrações: 0,02, 0,01, 0,005, 0,0025, 0,001 mg/mL. As análises de HPLC foram realizadas como descritas em 3.2.12.2.

Os gráficos de calibração de DBec em acetonitrila foram construídos traçando as áreas dos picos versus a concentração (mg/mL) injetadas.

Para a validação do método, uma segunda solução padrão estoque de 0,02 mg/mL foi preparada. Foram realizadas novas diluições, obtendo-se as seguintes concentrações: 0,0125, 0,0075, 0,0067, 0,002, 0,0005 mg/mL. Os dados foram incorporados ao gráfico de calibração para avaliar o método de quantificação do fármaco DBec através da utilização da técnica de HPLC.

Figura 19. Desenho esquemático do processo de diluição da solução padrão. (Adaptado de Ribani et. al.69₎

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68 3.2.9.2.2 Validação do Método de HPLC

A validação da metodologia analítica utilizada na determinação do DBec através de HLPC foi realizada para garantir que o método atendesse às exigências analíticas e de confiabilidade dos resultados. Para esse propósito, os parâmetros de validação estudados foram: seletividade, linearidade, faixa de aplicação, precisão limite de detecção, e limite de quantificação. 69, 70

A seletividade de um método de separação é a capacidade de avaliar, de forma inconfundível, um composto em exame na presença de substâncias que podem interferir na sua determinação. A seletividade avalia o grau de interferência de substâncias como impurezas, excipientes, e produtos de degradação. A seletividade garante que o pico de resposta seja unicamente do composto de interesse. 69 _{A seletividade pode ser avaliada comparando a matriz isenta do DBec}

e a matriz adicionada com o DBec (forma padrão), sendo que, nesse caso, nenhum interferente deve eluir no tempo de retenção do DBec, que deve estar bem separado dos demais compostos presentes na amostra. 69

A linearidade de um método analítico corresponde a sua capacidade em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em análise, dentro de uma determinada faixa de aplicação. A linearidade foi determinada através da curva de calibração do DBec em acetonitrila. Utilizando-se a curva de calibração, calculou-se a equação linear descrevendo os dados obtidos através de regressão linear, assim como o coeficiente de regressão R2_{. A faixa linear}

dinâmica é o intervalo de concentrações no qual se pode construir uma curva analítica linear. Este intervalo também foi determinado através da análise da curva de calibração.

A precisão do método representa a dispersão de resultados (área de pico) entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, sob condições definidas. 69,71 _{A precisão foi determinada através da estimativa do desvio padrão}

________________________________________________________________________ 69 100 (%) x s RDS (Eq. 15)

onde s é a estimativa do desvio padrão, e xé a média das áreas dos picos,

correspondente a cada concentração analizada.

O limite de detecção, LD, representa a menor concentração do composto em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando-se um método analítico específico. O limite de quantificação, LQ, é a menor concentração do composto em análise que pode ser medida, utilizando-se um determinado método experimental. 69, 71

O limite de detecção, LD, pode ser expresso como:

S s

LD 3,3 (Eq. 16)

E o limite de quantificação pode ser calculado utilizando-se a equação:

S s

LQ 10 (Eq. 17)

onde s é a estimativa do desvio padrão da resposta e S é o coeficiente angular da curva de calibração. 69