UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS
DIPROPIONATO DE BECLOMETASONA EM
FORMULAÇÃO LIPOSSOMAL COMO PÓ INALÁVEL
PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS PULMONARES
Autor: Fernando da Cruz Vasconcellos
Orientadora: Profa. Dra. Maria Helena Andrade Santana
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Química
como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em
Engenharia Química.
Campinas - São Paulo
Julho 2007
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP
V441d
Vasconcellos, Fernando da Cruz
Dipropionato de beclometasona em formulação
lipossomal como pó inalável para o tratamento de doenças pulmonares / Fernando da Cruz Vasconcellos.--Campinas, SP: [s.n.], 2007.
Orientador: Maria Helena Andrade Santana
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
1. Lipossomos. 2. Asma. 3. Surfactante pulmonar. 4. Medicamentos. 5. Drogas sintéticas. 6. Biotecnologia farmacêutica. 7. Tecnologia farmacêutica. I. Santana, Maria Helena Andrade. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
Aos meus pais e meu irmão
Com carinho
Agradeço...
à Professora Dra. Maria Helena Andrade Santana, pela sugestão do tema da dissertação de Mestrado, pela orientação e pela amizade durante esses dois anos.
à Professora Dra. Íris Torriani, pela amizade e pela oportunidade de trabalhar e aprender técnicas de SAXS no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). ao Professor Dr. Marco Chaud, pelo auxílio em testes farmacotécnicos, discussões, e sugestões para o aprimoramento do trabalho.
à Patrícia (Maxia), pelo amor, amizade e apoio em todos os momentos.
ao Gilson Barbosa Maia Jr., pelo suporte técnico no Laboratório de Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos (LDPB) da Faculdade de Engenharia Química (FEQ), UNICAMP.
aos meus colegas de trabalho: André, Amós, Giuliana, Amaro, Lucimara, Pablo, Ivanildo, Reinaldo, Thaís, Luciana, Beatriz, Humberto, Amanda, pelo companheirismo e apoio.
ao Felipe, Júlio, José Fernando, Tomás pelo auxílio nos experimentos de SAXS.
à professora Dra. Eneida de Paula, por ter disponibilizado seu laboratório de Biomembranas, no Instituto de Biologia (IB), UNICAMP.
ao Márcio pelo apoio técnico no laboratório de Biomembranas, do IB, UNICAMP.
à Andréa do Laboratório de Uso Comum, LUC, da FEQ, UNICAMP. à equipe técnica do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron.
ao Professor Dr. César Costapinto Santana, por ter disponibilizado seu laboratório para os testes de HPLC e espalhamento dinâmico de luz laser.
para os testes de absorção no infravermelho, Instituto de Química (IQ), UNICAMP.
ao Professor Dr. Kléber Gomes Franchini por ter disponibilizado seu laboratório para testes de separação, do Laboratório de Fisiopatologia Cardiovascular da Faculdade de Ciências Médicas (FCM),UNICAMP.
aos meus professores do programa de Mestrado e a todos os funcionários da Faculdade de Engenharia Química; secretarias; biblioteca e a UNICAMP em geral, que de alguma forma me auxiliaram
à CAPES e à FAPESP pela concessão das bolsas e pelo apoio ao trabalho, sem os quais os objetivos almejados não teriam sido alcançados.
E em especial à minha mãe Elza, meu irmão Bernardo, e ao meu pai José Inácio pelo apoio incondicional, pelo amor, e incentivo durante toda minha vida.
xi
A encapsulação de fármacos para aplicações médicas é atualmente considerada o meio mais eficiente de assegurar liberação controlada, direcionamento específico, redução da toxicidade e estabilidade na estocagem e transporte. Os lipossomas, têm sido estudados extensivamente para a veiculação de fármacos e administração pelas diversas vias. O objetivo do presente trabalho, é o desenvolvimento de uma formulação do corticóide Dipropionato de Beclometasona (DBec), veiculado em lipossomas, em forma de pó seco inalável para o tratamento da asma e de outras doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC). Formulações lipossomais com DBec foram preparadas com os lipídios comerciais Lipoid E80 e Epikuron 200SH, visando o aumento de escala do processo. As dispersões lipossomais foram produzidas através da hidratação do filme seco, composto de lipídio e DBec, utilizando os métodos de Bangham, Liofilização-Hidratação e de Sistema Multitubular. As preparações lipossomais foram caracterizadas em termos do diâmetro hidrodinâmico médio e polidispersidade, teor de fosfato, eficiência de encapsulação do DBec, e nível de peroxidação lipídica. O método de espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) foi utilizado para determinar a espessura da bicamada lipossomal, o efeito do DBec na temperatura da transição de fase principal do sistema lipídeo/água e a capacidade da bicamada lipídica para ancoramento do DBec. Os excipientes lactose monohidrata, estearato de magnésio, L-leucina, trealose, e α-tocoferol foram adicionados às dispersões lipossomais, que foram posteriormente liofilizadas para produzir o pó inalável. A caracterização da fluxibilidade do pó foi realizada com o método de índice de compactação de Carr e com medidas de ângulo de repouso. Os resultados mostraram que a melhor eficiência de encapsulação do DBec foi obtida com o método de Liofilização-Hidratação, entretanto, todos os métodos produziram lipossomas com DBec com diâmetros adequados à administração pulmonar (<6μm), a uma razão máxima de encapsulação 0,4 DBec/lipídio.
xiii
The liposomal drug encapsulation for medical applications is in many instances the most efficient way to ensure good storage, transport, targeting, and controlled release of the drug, thus reducing toxicity. Liposomes have been extensively studied as vehicles for efficient drug delivery. The objective of the present work is to develop a formulation of the corticosteroid Beclomethasone Dipropionate (BecD) encapsulated in liposomes to be used in the form of an inhalable dry powder for the treatment of asthma and other chronic obstructive pulmonary diseases (COPD). Liposomal formulations with incorporated BecD were prepared with Lipoid E80 and Epikuron 200SH phospholipids. The liposomal dispersions were produced by the hydration of dry films composed of lipids and DBec by using the Bangham, Lyophilization-Hydration, and Multitubular System methods. The obtained liposomal dispersions were characterized as to their mean hydrodynamic diameter and polydispersity, their phosphate content, the BecD encapsulation efficiency, and the level of lipid peroxidation. The small angle X-ray scattering (SAXS) method was utilized to determine the liposome bilayer thickness and the effect of BecD in the lipid/water system main phase transition temperature. The excipients lactose monohydrate, magnesium stearate, L-leucine, trehalose, and α-tocopherol were added to the liposomal dispersions, which were further lyophilized to produce the inhalable powder. The characterization of the inhalable powder fluidity was performed through Carr’s compressibility index method, and angle of repose measurements. The best efficiency for the encapsulation of BecD was obtained with the Lyophilization-Hydration method, however, all methods were able to produce BecD encapsulated liposomes with diameters adequate for pulmonary administration (< 6 µm). As to easy operation and scale-up potential, the Multitubular System method showed to be very promising for the production of liposomal formulations with BecD.
Keywords: liposome, beclomethasone, BecD, pulmonary diseases, inhalable powder
xv
RESUMO ...XI
ABSTRACT ... XIII
SUMÁRIO ... XVI
LISTA DE FIGURAS ... XXI
LISTA DE TABELAS ... XXVII
NOMECLATURA ... XXXI
1.0 INTRODUÇÃO E OBJETIVO
... 12.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
... 52.1 Lipossomas- Fundamentos ... 5
2.2 Métodos de Preparação de Lipossomas ... 8
2.2.1 Hidratação de Filme Lipídico Seco ... 9
2.2.2 Injeção de Solventes ... 10
2.2.3 Demulsificação ... 10
2.2.4 Secagem por Atomização (“Spray Drying”) ... 11
2.2.5 Liofilização-Hidratação ... 11
2.2.6 Sistema Multitubular ... 13
2.3 Métodos de Redução de Tamanho dos Lipossomas ... 14
2.3.1 Extrusão ... 14
2.3.2 Sonicação ... 15
2.3.3 Prensa Francesa ... 16
2.3.4 Microfluidização ... 16
2.4 Formação dos Lipossomas ... 17
2.4.1 Princípios Termodinâmicos de Auto-Agregação ... 17
2.4.2 Condições Necessárias para a Formação de Agregados ... 18
2.4.3 Estrutura de Agregados Anfifílicos ... 20
2.4.4 Mecanismos de Formação dos Lipossomas ... 22
2.5 Lipossomas como Carreadores de Fármacos ... 25
2.6 Formulações Lipossomais para Liberação Pulmonar ... 26
xvi
2.7 Corticóides para o Tratamento da Asma ... 31
2.7.1 O Corticóide Dipropionato de Beclometasona ... 32
2.8 Formulações Lipossomais com DBec ... 33
2.9 Produção Escalonável de Lipossomas ... 39
2.10 Espalhamento de raios X a baixo ângulo(SAXS) ... 39
2.11 Espalhamento dinâmico de luz ... 40
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS
... 433.1 Materiais ... 43
3.2 Métodos ... 44
3.2.1 Preparação de Lipossomas através do método de hidratação de filme lipídico seco... 45
3.2.1.1 Método de Bangham ... 45
3.2.1.2 Método de Liofilização-Hidratação ... 47
3.2.1.2.1 Agitação mecânica com impelidor de pá dentada ... 48
3.2.1.3 Sistema Multitubular ... 48
3.2.1.3.1 Cinética da Formação ... 52
3.2.1.3.2Adsorção dos Lipídeos em Tubos de Vidro ... 52
3.2.1.3.2.1 Adsorção dos Lipídeos ... 53
3.2.1.3.3 Medida da Espessura do Filme Lipídico em Substratos de Vidro através de MEV ... 54
3.2.2 Redução e Homogeneização dos Tamanhos dos Lipossomas ... 54
3.2.2.1 Extrusão ... 54
3.2.2.2 Sonicação ... 55
3.2.3 Preparação de Multicamadas Lipídicas Desidratadas ... 56
3.2.4 Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) ... 57
3.2.4.1 Determinação de espessura da bicamada (SAXS) ... 59 3.2.4.2 Determinação da temperatura de transição
xvii
3.2.5 Quantificação de fosfoslipídeos ... 61
3.2.6 Rendimento da Preparação ... 62
3.2.7 Determinação do Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas ... 62
3.2.8Separação do DBec não incorporado ... 63
3.2.8.1 Separação com a Ultracentrifugação com Ficoll® ... 63
3.2.8.2 Separação do DBec do Ficoll® ... 64
3.2.9 Quantificação de DBec incorporado ... 65
3.2.9.1 Espectrofotômetro ... 65
3.2.9.2 Cromatografia de Alta Performance (HPLC) ... 65
3.2.9.2.1 Curva de Calibração ... 67
3.2.9.2.2 Validação do Método de HPLC... 68
3.2.10 Preparação do pó seco lipossomal inalável... 69
3.2.11 Análise com a técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 70
3.2.12 Análise do nível de peroxidação dos lipossomas ... 71
3.2.13 Crioprotetores ... 73
3.2.14 Medida do ângulo de repouso ... 73
3.2.15 Índice de compactação do pó ... 74
3.2.16 Identificação do Fármaco DBec ... 75
3.2.16.1 Absorção no infravermelho ... 75
3.2.16.2 Teste de ponto de fusão ... 76
3.2.16.3 Difração de raios X do fármaco DBec ... 76
3.2.17 Modelagem da Formação de Lipossomas a Partir da Hidratação de um Filme Lipídico Seco depositado sobre Superfície de Vidro ... 76
3.2.17.1 Modelo de Formação de Lipossomas com a Hidratação de Filme Lipídico Seco ... 81
xviii
4.1 Preparação de Lipossomas ... 85
4.1.1 Método de Bangham ... 85
4.1.2 Método de Liofilização-Hidratação ... 87
4.1.3 Método do Sistema Multitubular ... 90
4.1.4 Tamanho e polidispersidade dos lipossomas ... 90
4.1.4.1 Lipossomas preparados pelo método de Bangham ... 91
4.1.4.2 Lipossomas preparados pelo método de Liofilização-Hidratação ... 97
4.1.4.2.1 Lipossomas preparados pela agitação mecânica com impelidor de pá dentada ... 101
4.1.4.3 Lipossomas preparados pelo método do Sistema Multitubular ... 103
4.1.5 Adsorção dos Fosfolipídeos no Sistema Multitubular ... 106
4.1.6 Cinética da Formação dos Lipossomas no Sistema Multitubular ... 108
4.2 Redução de Tamanho e Homogeneização dos Lipossomas ... 114
4.2.1 Extrusão ... 114
4.2.2 Sonicação ... 116
4.3 Análises de SAXS ... 117
4.3.1 Dispersões Lipossomais de Epikuron 200SH, Lipoid E80, e DPPC ... 118
4.3.1.1 Temperatura de Transição de Fases ... 118
4.3.2 Multicamadas lipídicas secas de Lipoid E 80, Epikuron 200SH, e DPPC ... 125
4.4 Rendimentos das preparações lipossomais ... 131
4.5 Separação do DBec não incorporado dos lipossomas ... 131
xix
4.6 Quantificação do DBec incorporado ... 135
4.7 Rendimento em Fosfolipídeos após a separação ... 138
4.8 Quantificação de DBec através de HPLC ... 139
4.8.1 Validação do método cromatográfico ... 140
4.8.2 Quantificação do DBec e Eficiência de Encapsulação ... 140
4.9 Comparação dos métodos de encapsulação ... 142
4.10 Análise do nível de Peroxidação dos Lipossomas ... 142
4.11 Análise de Crioproteção dos Lipossomas ... 144
4.12 Análise por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 145
4.12.1 Estruturas Lipídicas Liofilizadas ... 146
4.12.2 Estruturas lipídicas liofilizadas após a hidratação ... 148
4.12.3 Filmes Lipídicos Secos Depositados em Tubos de Vidro do Sistema Multitubular ... 152
4.12.4 MEV do Pó Puro do fármaco DBec ... 154
4.13 Modelagem da Formação de Lipossomas no Sistema Multitubular ... 155
4.14 Preparação do Pó Inalável com DBec ... 160
4.15 Índice de Carr – Teste de compactação de pós ... 160
4.16 Medida de Ângulo de Repouso ... 161
4.17 Identificação do fármaco Dipropionato de Beclometasona ... 163
4.17.1 Teste de absorção no infravermelho ... 163
4.17.2 Difração de raios X do DBec ... 165
4.17.3 Teste de ponto de fusão ... 165
5.0 CONCLUSÕES
... 1676.0 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
... 171xx
ANEXO I- Cálculo da massa molar fosfolipídeo Epikuron 200SH e fichas técnicas do Epikuron 200SH e Lipoid E80 ... 181
ANEXO II- Curva de calibração típica para quantificação
de fosfolipídeos ... 183
ANEXO III- Gráfico da adsorção de Ficoll (200-400 nm) ... 185
ANEXO IV- Espectros de varredura de DBec em
acetonitrila ... 187
ANEXO V- Curva de calibração típica de DBec em solvente
acetonitrila ... 189
ANEXO VI- Curva de calibração de DBec em solvente
acetonitrila [HPLC,Fase Reversa] ... 191
ANEXO V II- Validação do método cromatográfico ... 193
ANEXO VIII- Curva de calibração típica para o teste de
peroxidação de lipídeos ... 197
ANEXO IX- Espectros de Infravermelho do DBec ... 199
xxi
FIGURA PÁGINA
FIGURA 1. Estrutura molecular do lipídeo dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC ... 6
FIGURA 2.Representação esquemática das fases lamelares em sistemas PC/água .... 7
FIGURA 3.Interação de diferentes compostos com o lipossoma ... 8
FIGURA 4.Concentração de monômeros ou agregados em função da concentração total de lipídeos . ... 20
FIGURA 5.Formação de lipossomas a partir da hidratação de filme lipídico seco, e processos de extrusão e sonicação para a redução do tamanho de MLVs para SUVs ou LUVs ... 25
FIGURA 6.Estrutura molecular do dipropionato de beclometasona ... 32
FIGURA 7.Evaporador rotativo inclinado Fisatom Mod 802 ... 46
FIGURA 8.Liofilizador Liobras L101 ... 47
FIGURA 9.Desenho esquemático do sistema para a agitação e formação de lipossomas a partir de pó liofilizado ... 48
FIGURA 10.Desenho esquemático do Sistema Multitubular ... 49
FIGURA 11.Módulo multitubular ... 52
FIGURA 12.Parte do porta amostra de SAXS exibindo a secção cilíndrica de vidro ... 56
FIGURA 13.Desenho esquemático do espalhamento de raios X ... 57
FIGURA 14.Difração de raios X por bicamadas lipídicas de espessura d ... 58
FIGURA 15.Anel de acelerador de partículas (parte superior), e linha SAXS 1 utilizada (parte frontal). LNLS, Campinas, SP ... 59
FIGURA 16.Montagem experimental SAXS para gotas desidratadas ... 60
FIGURA 17.Montagem experimental SAXS para dispersões lipídicas ... 60
FIGURA 18.Separação de lipossomas e DBec livre utilizando Ficoll® ... 64
FIGURA 19.Desenho esquemático do processo de diluição da solução padrão ... 67
FIGURA 20.Representação unidimensional da hidratação e dissolução de um
xxii
espessura do filme penetrada pelo líquido no tempo t ... 82 FIGURA 21.Exemplo do filme lipídico seco (Lipoid E80) aderente à superfície
interna do balão ... 86 FIGURA 22.(a) Congelamento de dispersões de lipídeo e t-butanol em N2 líquido.
(b) Dispersão lipídeo/t-butanol congelada com tampa para
liofilização ... 87 FIGURA 23.Dispersão lipídeo/t-butanol nos primeiros minutos de liofilização ... 88
FIGURA 24.Pó seco de Epikuron 200SH e Lipoid E80 com DBec (D/L =0,04) ... 89
FIGURA 25.Espectros da distribuição de tamanhos de lipossomas preparados
pelo método de Bangham (a) Lipoid E80. (tamanho médio de 1685 nm), (b) de Epikuron 200SH (tamanho médio de 2954 nm) ... 92 FIGURA 26.Espectros da distribuição de tamanhos de lipossomas de Lipoid E80,
5mM, preparados pelo método de Bangham. (a) Ensaio 1 (tamanhos médios de 42 nm, 258 nm, e 1725 nm); (b) Ensaio 2 (tamanhos médios de 209 nm e 1073 nm) ... 94 FIGURA 27.Espectros da distribuição de tamanhos de lipossomas de Lipoid E80,
10mM, com DBec, preparados pelo método de Bangham. (a) Ensaio 1 (tamanhos médios de 294nm e 1422nm); (b) Ensaio 2 (tamanhos
médios de 268nm e 1376nm) ... 95 FIGURA 28.Exemplo do espectro típico da distribuição de tamanhos de
lipossomas de Lipoid E80 com DBec (DBec/Lipídeo = 0,04) preparados pelo método de Bangham; (a) ensaio 1 (tamanhos médios de 435nm e 2015nm); (b) ensaio 2 (tamanhos médios
de 373nm e 1404nm) ... 96 FIGURA 29.Microscopia óptica de lipossomas de Lipoid E80 [5 mM] preparados
pelo método de Liofilização-Hidratação. (a) [100 x], (b) [200x] ... 98 FIGURA 30.Microscopia óptica de lipossomas de Epikuron 200SH [5 mM]
preparados pelo método de Liofilização-Hidratação. (a) [100 x],
xxiii
de Liofilização-Hidratação (a) Lipoid E80 [100 mM], e
(b) Epikuron 200SH [100 mM] [100 x] ... 99 FIGURA 32.Microscopia óptica de lipossomas preparados pelo método
de Liofilização-Hidratação, Epikuron 200SH [100 mM] [200 x] ... 100 FIGURA 33.Absorbância de dispersões lipídicas de Epikuron 200SH em função
do tempo, para as concentrações iniciais de (a) 5 mM, (b) 10 mM, e (c) 60 mM. Sistema Multitubular ... 109 FIGURA 34.Absorbância de dispersões lipídicas de Lipoid E80 em função do
tempo, para as concentrações iniciais de (a) 5 mM, (b) 10 mM.
Sistema Multitubular... 110 FIGURA 35.Diâmetro hidrodinâmico médio dos lipossomas de Epikuron 200SH
em função do tempo, para as concentrações iniciais de (a) 5 mM,
(b) 10 mM, (c) 60 mM. Sistema Multitubular ... 111 FIGURA 36.Diâmetro hidrodinâmico médio dos lipossomas de Lipoid E80
em função do tempo, para as concentrações iniciais de (a) 5 mM,
(b) 10 mM, (c) 60 mM. Sistema Multitubular ... 112 FIGURA 37.Concentração de fosfolipídeos [mM] dos lipossomas de Epikuron
200SH em função do tempo, para as concentrações iniciais de
(a) 5 mM, (b) 10 mM ... 113 FIGURA 38.Concentração de fosfolipídeos [mM] dos lipossomas de Lipoid E80
em função do tempo, para as concentrações iniciais de (a) 5 mM,
(b) 10 mM ... 113 FIGURA 39.Espectros da distribuição de tamanhos de lipossomas submetidos
à extrusão (a) Lipoid E80, (b) de Epikuron 200SH ... 115 FIGURA 40.Dispersão lipossomal antes (a) e após (b) sonicação com ponta sônica
116
FIGURA 41.SAXS. Cinética de transição de fase termotrópica para a amostra de
Epikuron 200SH 12,7mM ... 120 FIGURA 42.SAXS. Cinética de transição de fase termotrópica para a amostra
xxiv
FIGURA 43.SAXS. Cinética de transição de fase termotrópica para a amostra
de DPPC, 12,7mM ... 123
FIGURA 44.SAXS. Cinética de transição de fase termotrópica para a amostra de DPPC (25)/DBec (1), 12,7mM ... 123
FIGURA 45.SAXS. Cinética de transição de fase termotrópica para a amostra de Lipoid E80, 12,7mM ... 124
FIGURA 46.SAXS. Cinética de transição de fase termotrópica para a amostra de Lipoid E80 (25)/DBec (1), 12,7mM ... 125
FIGURA 47.Medidas de difração de raios-X: Multicamadas secas de Lipoid E80 ... 127
FIGURA 48.Medidas de difração de raios-X: Multicamadas secas de DBec/Lipoid E80, (a) razão 0,02 , (b) razão 0,03 , (c) razão 0,04 , (d) razão 0,05 ... 128
FIGURA 49.Medidas de difração de raios-X. Multicamadas secas de (a) Epikuron 200SH puro, de DBec/Epikuron 200SH (b) razão 0,04 ... 129
FIGURA 50.Medidas de difração de raios-X: Multicamadas secas de DPPC ... 130
FIGURA 51.Separação de MLVs de Epikuron 200SH do fármaco DBec, através de gradiente de densidades de soluções de Ficoll ... 132
FIGURA 52.Separação de SMLVs e SUVs do DBec livre com Ficoll® ... 133
FIGURA 53.Separação de SMLVs e SUVs do DBec livre com Ficoll® ... 133
FIGURA 54.Separação de SMLVs e SUVs do DBec livre com Ficoll® ... 133
FIGURA 55.Separação do DBec do Ficoll utilizando-se clorofórmio ... 134
FIGURA 56.Extração da camada inferior contendo clorofórmio e DBec ... 135
FIGURA 57.Filme seco de DBec após evaporação do clorofórmio ... 135
FIGURA 58.Encapsulação do DBec em função da razão fármaco/lipídeo ... 137
FIGURA 59.Razão DBec/ Lipídeo final versus a razão DBec/ Lipídeo inicial ... 139
FIGURA 60.Concentração de TEP [nM] para preparações de lipossomas de Lipoid E80 e Epikuron 200SH com e sem α- tocoferol durante um período de 3 meses ... 143
xxv
rehidratados (a) sem trealose, (b) com trealose (razão de peso
lipídeo/trealose = 0,25). x 200 ... 144 FIGURA 62.Microscopia óptica dos lipossomas de Epikuron 200SH, liofilizados
e rehidratados (a) sem trealose, (b) com trealose (razão de peso
lipídeo/trealose = 0,25). x 200 ... 145 FIGURA 63.Imagens de MEV da estrutura lipídica seca de Lipoid E80 após
liofilização, 500 X ... 146 FIGURA 64.Imagens de MEV da estrutura lipídica seca de Lipoid E80 após
liofilização, 100 X ... 147 FIGURA 65.Imagens de MEV da estrutura lipídica seca de Epikuron 200SH após
liofilização, 1000 X ... 147 FIGURA 66.Imagens de MEV da estrutura lipídica seca de Epikuron 200SH após
liofilização, 200 X ... 148 FIGURA 67.Imagens de MEV dos lipossomas de Lipoid E80 obtidos após
hidratação, 1000 X ... 149 FIGURA 68.Imagens de MEV dos lipossomas de Lipoid E80 obtidos após
hidratação, 2000 X ... 149 FIGURA 69.Imagens de MEV dos lipossomas de Epikuron 200SH obtidos após
hidratação, 500 X ... 150 FIGURA 70.Imagens de MEV dos lipossomas de Epikuron 200SH obtidos após
hidratação, 5000 X ... 151 FIGURA 71.Imagens de MEV dos lipossomas de Epikuron 200SH obtidos após
hidratação, 10000 X ... 151 FIGURA 72. Imagem de MEV de Lipídeos de Epikuron 200SH aderidos à
superfície de umtubo de vidro. Dispersão lipídica inicial de 10 mM 5000 X ... 153 FIGURA 73. Imagem de MEV de Lipídeos de Lipoid E80 aderidos à
superfície de umtubo de vidro. Dispersão lipídica inicial de 10 mM. 10000 X ... 153
xxvi
beclometasona, 2000 X ... 154 FIGURA 75. Imagem de MEV do pó seco do fármaco dipropionato de
beclometasona, 1000 X ... 154 FIGURA 76.Imagem de MEV do pó seco do fármaco dipropionato de
beclometasona, 100 X ... 155 FIGURA 77.Massa dissolvida de filmes lipídicos de Lipoid E80 em função do
tempo a partir da dispersão lipídica inicial de 5 mM. (modelo e
dados experimentais) ... 158 FIGURA 78.Massa dissolvida de filmes lipídicos de Lipoid E80 em função do
tempo a partir da dispersão lipídica inicial de 10 mM. (modelo e
dados experimentais) ... 158 FIGURA 79.Massa dissolvida de filmes lipídicos de Epikuron 200SH em função
do tempo a partir da dispersão lipídica inicial de 5 mM. (modelo e dados experimentais) ... 159 FIGURA 80.Massa dissolvida de filmes lipídicos de Epikuron 200SH em função
do tempo a partir da dispersão lipídica inicial de 5 mM. (modelo e dados experimentais) ... 159 FIGURA 81.Gráfico de transmitância versus comprimento de onda do fármaco
DBec (pastilhas de DBec e KBr) ... 163 FIGURA 82.Gráfico de transmitância versus comprimento de onda do fármaco
DBec (DBec em óleo mineral) ... 164 FIGURA 83.Transmitância no infravermelho do DBec monohidratado em óleo
mineral ... 164 FIGURA 84.Difração de raios X do fármaco DBec, faixa de 2θ de 5-50 graus ... 165
FIGURA 85.Teste de ponto de fusão, (a) DBec em capilar, (b) aquecimento
xxvii
TABELA PÁGINA
TABELA 1. Modelos de empacotamento geométrico de várias moléculas anfifílicas
em agregados coloidais ... 22 TABELA 2.Eficiência de Encapsulação de DBec ... 38
TABELA 3.Componentes principais do sistema multitubular ... 50
TABELA 4.Descrição do sistema e condições cromatográficas de HPLC ... 66
TABELA 5.Compostos para a formulação do pó lipossomal inalável com DBec ... 70
TABELA 6. Preparação para curva de calibração do método TBA ... 72
TABELA 7. Relação entre fluxibilidade e o percentual de compressibilidade
de um pó ... 75 TABELA 8. Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas (MLVs)
preparados pelo método de Bangham, concentração lipídica
10 mM ... 92 TABELA 9. Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas (MLVs)
preparados pelo método de Bangham, concentração lipídica
5 mM ... 93 TABELA 10. Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas (MLVs)
com DBec preparados pelo método de Bangham,
concentração lipídica de 10mM ... 94 TABELA 11.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas (MLVs)
com DBec preparados pelo método de Bangham,
concentração lipídica de 5 mM ... 96 TABELA 12.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas (MLVs)
preparados pelo método de Liofilização-Hidratação,
para concentrações de 5 mM e 100 mM ... 97 TABELA 13.Diâmetro Médio dos Lipossomas de Lipoid E80 (MLVs)
preparados pelo método de Liofilização-Hidratação, com agitação com impelidor de pá dentada, concentração lipídica
xxviii
TABELA 14.Diâmetro Médio dos Lipossomas de Epikuron 200SH (MLVs)
preparados pelo método de Liofilização-Hidratação, com agitação com impelidor de pá dentada, concentração lipídica
5 mM ... 102 TABELA 15.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas de Lipoid
E80 (MLVs) preparados pelo método de Sistema
Multitubular, concentração lipídica 5 mM... 103 TABELA 16.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas de Lipoid
E80 com DBec (MLVs) preparados pelo método de Sistema
Multitubular, concentração lipídica 10 mM... 104 TABELA 17.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas de Epikuron
200SH com DBec (MLVs) preparados pelo método de Sistema
Multitubular, concentração lipídica 5 mM... 105 TABELA 18.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas de Epikuron
200SH com DBec (MLVs) preparados pelo método de Sistema
Multitubular, concentração lipídica 10 mM... 105 TABELA 19.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas de Epikuron
200SH com DBec (MLVs) preparados pelo método de Sistema
Multitubular, concentração lipídica 60 mM... 106 TABELA 20. Massa adsorvida no Sistema Multitubular, Lipoid E80 e Epikuron
200SH, concentrações 5 e 10 mM ... 107 TABELA 21.Número de Reynolds, escoamento no Sistema Multitubular ... 108
TABELA 22.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas Extrudados
Lipoid E80 e Epikuron 200SH ... 115 TABELA 23.Diâmetro Médio e Polidispersidade dos Lipossomas Sonicados
Lipoid E80 e Epikuron 200SH ... 117 TABELA 24.Estimativa de espessura de bicamadas de Lipoid E80 e sistemas
DBec-L ... 126 TABELA 25.Estimativa de espessura de bicamadas de Epikuron 200SH e
xxix
TABELA 26.Encapsulação e dose do DBec em função da razão
DBec/Lipídeo (D/L) ... 136 TABELA 27.Rendimento da recuperação dos fosfolipídeos separados por
gradiente de densidade ... 138 TABELA 28.Análise de eficiência de encapsulação de DBec em Lipossomas de
Lipoid E80 e Epikuron 200SH – Liofilização-Hidratação ... 140 TABELA 29.Análise de eficiência de encapsulação de DBec em Lipossomas de
Lipoid E80 e Epikuron 200SH – Sistema Multitubular ... 142 TABELA 30.Propriedades físico-químicas utilizadas para a simulação e
modelagem da formação de lipossomas de Lipoid E80 e Epikuron 200SH ... 156 TABELA 31.Valores dos parâmetros Kt , Kt’, Kv , Kext calculados pela
simulação a partir do modelo matemático ... 156 TABELA 32.Valores dos parâmetros fixados ( * ) e ajustados( † ) na simulação e
modelagem de formação de lipossomas de Lipoid E80 e Epikuron 200SH ... 157 TABELA 33.Espessura do filme lipídico adsorvido na superfície dos tubos de
vidro do sistema multitubular, calculado através da simulação
e modelagem da formação de lipossomas. ... 160 TABELA 34.Análise do Índice de Carr para formulações com lactose de 37 e
74 μm ... 161 TABELA 35.Análise do ângulo de repouso para formulações com lactose de 37 e
74 μm ... 162 TABELA 36.Análise do ângulo de repouso para formulações com lactose de 37 e
74 μm com estearato de magnésio (C36H70MgO4) ... 162
TABELA 37.Análise do ângulo de repouso para formulações com lactose de 37 e
xxxi
BHT Hidroxitolueno butilado (butylated hydroxytoluene) CMC Concentração micelar crítica
COPD Chronic Obstructive Pulmonary Diseases
DBec Dipropionato de Beclometasona (Beclomethasone Dipropionate) DBec-L Formulação lipossomal com DBec
DI Diâmetro interno
DLPC Dilaurilfosfatidilcolina (dilauroylphosphatidylcholine) DMPC Dimiristilfosfatidilcolina (dimyristylphosphatidylcholine) DPB Departamento de Processos Biotecnológicos
DPIs Dispositivos de inalação de pós secos (dry powder inhalers)
DPPC L-α-dipalmitoilfosfatidilcolina (L-α–dipalmitoylphosphatidylcoline) DPOC Doenças pulmonares obstrutivas crônicas
DRX Difração de raios-X
D/L DBec/Lipídeo
EPC Fosfatidilcolina de ovo (egg phosphatidylcholine) Epikuron 200SH Fosfatidilcolina de soja hidrogenada comercial FEQ Faculdade de Engenharia Química da Unicamp
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy)
HEPES N-(2-Hidroxietil)piperazina-N´-(2-ácido etanosulfônico) HPLC Cromatografia Líquida de Alta Performance (high performance
liquid chromatrography)
IFGW Instituto de Física Gleb Wataghin da Unicamp
LD Limite de detecção
Lipoid E80 Fosfatidilcolina de ovo comercial
LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncrotron LQ Limite de quantificação
xxxii
MDIs Inaladores dosimetrados (metered dose inhalers) MLVs Vesículas multilamelares (multilamellar vesicles)
PC Fosfatidilcolina
RSD Desvio padrão relativo (relative standard deviation) TBA Ácido tiobarbitúrico (thiobarbituric acid)
TEP 1,1,3,3 tetraetoxypropano
SAXS Espalhamento de raios-X à baixo ângulo (small angle X-ray
scattering)
MEV Microscopia eletrônica de varredura (scanning electron microscopy) SMT Sistema multitubular
SMLVs Vesículas multilamelares pequenas (small multilamellar vesicles) SUVs Vesículas unilamelares pequenas (small unilamellar vesicles) t-butanol Álcool terciário butílico
Tc Temperatura de transição principal de fases
V Vesícula (vesicle)
WAXS Espalhamento de raios-X à alto ângulo (wide angle x-ray
scattering)
Å = Angstrons
a = área da cabeça polar de um lipídeo
ext
C = concentração dos compostos no meio líquido externo
Cs = concentração dos compostos que se dissolvem entre a
camada do líquido junto à superfície do sólido
v
C = concentração de vesículas lipídicas
d = espaçamento interplanar de bicamadas lipídicas
D = fármaco
D = coeficiente de difusão
d = espessura de bicamadas lipídicas
xxxiii
Do = densidade aparente
Df = densidade de compactação
int
D = diâmetro interno do tubo do sistema multitubular
h = altura do cone de pó seco
kB = constante de Boltzmann d
k = coeficiente de transferência de massa
K = constante de penetração int
K = constante de transferência de massa interna
ext
K = constante de transferência de massa externa
t
K = constante de penetração em função do tempo t
v
K = taxa de reação da produção de vesículas lipídicas l = comprimento da cadeia(s) de hidrocarboneto
c
l = comprimento característico para a transferência de massa
L = distância de penetração da água
Lc = fase lamelar (subgel) de sistemas de lipídeos em água d
L = comprimento do filme lipídico dissolvido Lf = representa a massa final de lipídeo
Li = massa inicial de lipídeo p
L = distância de penetração do líquido nos poros do filme
lipídico
L = fase lamelar (líquido cristalino) de sistemas de lipídeos em água
L = fase lamelar (gel: cadeias não inclinadas) de sistemas de lipídeos em água
L ´ = fase lamelar (gel: cadeias inclinadas) de sistemas de lipídeos
em água
m = massa dissolvida
ads
xxxiv
drenada
m = massa lipídica drenada após a adsorção
P = fator de empacotamento
p = um número que depende da forma e dimensionalidade dos agregados
P ´ = fase lamelar (rippled gel) de sistemas de lipídeos em água
q = módulo do vetor de espalhamento de raios X
Q = vazão
r = raio do cone de pó seco
r = raio de uma partícula
Re = número de Reynolds
S = coeficiente angular da curva de calibração
sólido ext
S . = superfície sólida externa do comprimido
Sint(t) = superfície dos poros penetrada pelo líquido em função do
tempo
0
S = superfície externa total de um sólido poroso (sólido +
espaços vazios)
s = estimativa do desvio padrão
so = vetor na direção do feixe de raios X incidente
s = vetor de espalhamento de raios X
Sc = número de Schmidt
Sh = número de Sherwood
T = temperatura do sistema
t = tempo
x = média das áreas dos picos cromatográficos
N
X = a concentração, (mais especificamente a atividade), de
moléculas em agregados de número N
Y = rendimento mássico da preparação
→ →
xxxv
= uma constante positiva que depende da força de interações
intermoleculares
= porosidade de um sólido poroso
= viscosidade do solvente
l = viscosidade do líquido
= ângulo de contato, sólido-líquido
λ = comprimento de onda dos raios X = viscosidade das dispersões lipídicas
f = velocidade do fluido
N = potencial químico médio de uma molécula em um agregado
com o número de agregação N
0
N = potencial químico padrão (energia de interação livre média
por molécula) em agregados com número de agregação N
v = velocidade de escoamento do líquido dentro do tubo
lip
v = volume da molécula lipídica
= densidades das dispersões lipídicas = tensão superficial do líquido
= tortuosidade de um sólido poroso 2θ = ângulo de espalhamento de raios X
________________________________________________________________________
1
1.0 INTRODUÇÃO E OBJETIVO
Os lipossomas, vesículas de fosfolipídeos que mimetizam as membranas celulares, têm sido bastante estudados e utilizados como veículos funcionais na administração eficaz de diversos fármacos. A encapsulação lipossomal de fármacos para a aplicação médica representa, em muitos casos, o meio mais eficiente para armazenamento, transporte, redução de toxicidade, direcionamento específico e liberação controlada.
Dentre os corticóides empregados para o tratamento de doenças pulmonares, o Dipropionato de Beclometasona (DBec) tem sido considerado um dos mais eficazes, levando a um crescente aumento da sua demanda. Os produtos atualmente no mercado compreendem a administração do DBec na sua forma livre, por inalação em spray nasal (Vivabec , da Lexonuk, Beclosol , da GlaxoSmithKline), jato de spray (Clenil , da Farmalab) ou cápsulas de pó inalável (Miflasona , da Novartis, Beclate , da Cipla).
A inalação de corticóides livres apresenta diversos efeitos adversos no local de administração como a imunossupressão local, o que pode conduzir a infecções fúngicas como candidíase oral, faringite e laringite. A encapsulação do DBec em lipossomas representa, no âmbito da nanobiotecnologia, uma estratégia inovadora para contornar esses problemas. A formulação lipossomal (DBec-L) deverá amenizar a ação tóxica local e sistêmica dos corticóides inalados e promover a liberação lenta do fármaco nos pulmões. Nessas condições, tanto a dose quanto a freqüência de administração do fármaco são reduzidas, o que deverá trazer grandes benefícios, particularmente para pacientes que requerem altas doses de corticóides.
A apresentação na forma de pó seco tende a contornar problemas de estabilidade físico-química e alterações no tamanho das partículas, problemas estes
________________________________________________________________________
2
que ocorrem na nebulização de suspensões lipossomais, além de propiciar um melhor controle sobre o diâmetro das partículas.
O objetivo deste trabalho é desenvolver uma formulação do corticóide DBec veiculado em lipossomas, para administração por via respiratória na forma de pó inalável e liberação pulmonar com vistas ao tratamento da asma e de outras doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC). A abordagem para o presente trabalho visa contribuir para o desenvolvimento de um processo de produção de uma formulação lipossomal contendo o DBec na forma de pó seco, de modo a garantir a sua reprodutibilidade e estabilidade, assim como estudar problemas relacionados com a ampliação de escala do processo. A formulação proposta representará uma inovação em termos de corticóides inaláveis, visto que tradicionalmente têm-se utilizado nebulizadores e aerossóis para a liberação do fármaco nos pulmões por via respiratória.
A parte experimental incluiu os métodos de preparação e caracterização de lipossomas e do pó lipossomal inalável. As preparações dos lipossomas foram realizadas e avaliadas através dos métodos de hidratação de filme seco de Bangham, Liofilização-Hidratação e Sistema Multitubular. A redução de tamanhos e homogeneização dos lipossomas, através da extrusão e sonicação, foram avaliadas. As preparações foram caracterizadas com ensaios de quantificação de fosfolipídeos, rendimentos, eficiência de encapsulação do DBec, determinação do diâmetro médio e polidispersidade dos lipossomas e morfologia através de imagens de microscopia eletrônica de varredura. Foram também implementados ensaios específicos para esse trabalho, tais como a quantificação do DBec por espectroscopia UV-Vis e HPLC e a separação do DBec não encapsulado dos lipossomas através de processos utilizando gradiente de densidades, devido ao seu caráter hidrofóbico. Experimentos para avaliar a trealose como crioprotetor e o α-tocoferol como antioxidante nas formulações também foram realizados. As
________________________________________________________________________
3
preparações do pó seco inalável foram caracterizadas com ensaios de índice de compactação e medidas de ângulo de repouso.
Adicionalmente, foram feitos estudos sobre a estrutura lamelar, e temperatura das transições de fase das bicamadas lipídicas de DPPC, Epikuron 200SH, e Lipoid E80. Esses estudos foram feitos com e sem o DBec como controle, utilizando técnicas de espalhamento de raios-X à baixo ângulo (SAXS), no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, Campinas, SP. Dois métodos experimentais, com montagens diferentes, foram implementados para estudar os lipossomas: em soluções, e em forma de gotas secas. A capacidade de incorporação do DBec foi determinada para os lipídeos Lipoid E80 e Epikuron 200SH.
A identificação do fármaco DBec utilizado, foi realizada através de ensaios de: absorção no infravermelho, teste de ponto de fusão, e difração de raios X.
Para um melhor detalhamento dos experimentos que foram realizados e analisados, o índice bibliográfico deverá ser consultado. O capítulo 2 contém a Revisão Bibliográfica. O capítulo 3 discute Materiais e Métodos. No capítulo 4, apresentamos os resultados e a discussão dos mesmos. O capítulo 5 apresenta as conclusões. O capítulo 6 trata de Sugestões para Trabalhos Futuros. O capítulo 7 contém a Bibliografia, e o capítulo 8, final, contém anexos.
________________________________________________________________________
5
2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A partir dos trabalhos de Bangham et al. 1,2 na década de 60, nos quais foi
descrita a natureza semi-permeável dos lipossomas, os biofísicos, bioquímicos e biólogos, dentre outros cientistas, tiveram acesso a uma poderosa ferramenta para estudar as características e propriedades das membranas naturais.
Atualmente os lipossomas são utilizados como ferramenta e modelo em estudos de várias disciplinas da ciência e da tecnologia; na matemática e na física teórica (topologia de duas dimensões flutuando em um continuum de três dimensões), na química (catálise, conversão de energia), na biofísica (propriedades de membranas celulares), na biologia (funções celulares, terapia genética), na bioquímica (funções de proteínas em membranas celulares), e em ciência coloidal (termodinâmica de sistemas finitos e estabilidade).3
Os lipossomas são usados em diversos produtos que se utilizam das suas propriedades físico-químicas, coloidais, de microencapsulação e de superfície. A aplicação de lipossomas se dá em uma grande variedade de produtos, desde formulações farmacêuticas (antifúngicos, agentes anticancerígenos, vacinas, agentes terapêuticos, drug delivery) e cosméticas (xampus, produtos de tratamento de pele) até produtos para diagnósticos e para a indústria de alimentos.3
2.1 Lipossomas- Fundamentos
Os lipossomas, ou vesículas lipídicas, são partículas coloidais de estruturas esféricas, formadas por lipídeos que se auto agregam em um meio aquoso. Os lipídeos formam uma ou várias bicamadas concêntricas que encapsulam o meio aquoso no qual eles estão dispersos. Os tamanhos dos lipossomas podem variar desde poucos nanômetros (nm) até dezenas de micra ( m). Os lipossomas são compostos principalmente por uma classe especial de moléculas—as anfifílicas. Estas têm atividade de superfície caracterizada pela composição de sua estrutura que contém partes hidrofílicas (polares) e hidrofóbicas (apolares). Como exemplo
________________________________________________________________________
6
desta estrutura a Figura 1 mostra o lipídeo dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), que é a fosfatidilcolina, naturalmente mais abundante nos pulmões.
Devido às características hidrofóbicas e hidrofílicas dos lipídeos, quando estes são colocados em um meio aquoso, acima de uma certa concentração crítica, tendem a se auto organizar e formar bicamadas lipídicas como resultado de um balanço energético de interações.4
Figura 1. Estrutura molecular do lipídeo dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC.
(adaptado de: www. avantilipids.com, consultado em Junho/2007)
As moléculas anfifílicas nas bicamadas podem estar no estado gel, ou sólido, onde as cadeias hidrocarbônicas exibem um alto nível de empacotamento e baixa mobilidade, ou em um estado líquido-cristalino, ou fluídico, no qual essas cadeias estão mais desordenadas e possuem uma maior mobilidade. A temperatura de transição de fases, Tc, entre a fase gel e a fase líquido-cristalina, é
uma característica física importante da bicamada que, em condições isobáricas, é uma função da composição química das bicamadas, do pH e da força iônica do meio, e da presença de outras moléculas e íons. As fases de pré-transição e transição principal de uma membrana de lipídeos polares em água, estão representadas esquematicamente na Figura 2.5
Parte Hidrofílica Parte Hidrofóbica
________________________________________________________________________
7
Figura 2. Representação esquemática das fases lamelares em sistemas PC/água.
(adaptado de: Koynova & Caffrey5)
As interações dos lipossomas com o meio aquoso e outras moléculas são diversas. Os lipossomas podem ser categorizados, segundo suas interações, em três tipos gerais. Primeiro, como sendo lipossomas convencionais, onde a sua reação com o ambiente no qual se encontram não é específica. Outra classe de lipossomas são os estabilizados estericamente, que são praticamente inertes e portanto sem nenhuma reação com o ambiente. A terceira categoria inclui os lipossomas polimórficos, que exibem uma reação expressiva com certos agentes, como é o caso dos lipossomas catiônicos que mudam sua estrutura quando interagem com ácidos nucléicos. A morfologia dos lipossomas é mais dependente do modo de seu preparo do que da sua composição, o que mostra a influência da cinética das reações nas suas propriedades e características. Já a composição dos lipossomas é mais responsável pela sua funcionalidade.4
Os lipossomas são caracterizados pela sua composição lipídica, número de bicamadas, variedade dos tamanhos das partículas, e natureza do meio aquoso, características estas que determinam a sua estabilidade e propriedades de interação com outras moléculas. As vesículas lipossomais (vesicles : V) podem ser categorizadas, conforme a sua morfologia , como sendo vesículas grandes (large : L), pequenas (small : S), unilamelares (U), oligo (O), e multilamelares (ML). Existem casos em que os lipossomas podem ser compostos por mais de uma
Lc L L ´ P ´ L
subgel gel gel rippled gel líquido-cristalino
(a) (b) (c) (d) Tc (e) Temperatura
________________________________________________________________________
8
vesícula, onde lipossomas pequenos estão incorporados dentro de lipossomas maiores.4
A versatilidade estrutural dos lipossomas permite encapsular compostos hidrofóbicos nas bicamadas lipídicas, compostos hidrofílicos dentro dos compartimentos aquosos envolvidos pelas bicamadas, e compostos anfipáticos
Figura 3. Interação de diferentes compostos com o lipossoma.
(adaptado de: www.avantilipids.com, consulto em Junho/2007)
parcialmente localizados na bicamada e parcialmente no meio aquoso, como mostra a Figura 3. Dependendo do composto a ser incorporado ao lipossoma, o método de preparo é de extrema importância.
2.2 Métodos de Preparação de Lipossomas
Existe uma variedade muito grande de métodos de preparação de lipossomas. Os métodos clássicos, porém, são: (1) métodos de hidratação do filme lipídico seco, (2) métodos de injeção de solventes, e (3) métodos de demulsificação. Além destes, os principais métodos recentes e escalonáveis de preparação de lipossomas são: (1) secagem por atomização (spray drying), (2) liofilização-hidratação, e (3) expansão de estruturas lipídicas. Os métodos acima mencionados, são descritos nos itens a seguir.
________________________________________________________________________
9 2.2.1 Hidratação do Filme Lipídico Seco
O método clássico de hidratação do filme lipídico seco, também chamado de método de Bangham, envolve as etapas fundamentais descritas a seguir:
(1) dissolução dos lipídeos em solvente orgânico (2) evaporação do solvente orgânico
(3) hidratação do filme lipídico seco (4) agitação e homogeneização
Inicialmente, os lipídeos ou mistura de lipídeos são dissolvidos em um solvente orgânico, normalmente o clorofórmio. Logo após é feita a evaporação a vácuo, do solvente orgânico. Após a evaporação do solvente orgânico, o filme lipídico que se forma na parede do recipiente de vidro, ou em suportes inertes, é hidratado com uma solução aquosa. A solução aquosa é adicionada a uma temperatura acima da temperatura de transição principal de fases (Tc) dos lipídeos
utilizados na formulação com o objetivo de auxiliar no descolamento do filme da parede do recipiente de vidro, quebrar grandes agregados, e inibir defeitos no ordenamento dos lipossomas. A hidratação resulta na formação de uma população heterogênea e dispersa de vesículas multilamelares (MLVs). Para obter-se tamanhos de vesículas menores e uma distribuição mais estreita de tamanhos, os MLVs formados podem ser submetidos à sonicação ou extrusão através de membranas, normalmente de policarbonato com diâmetro de poro bem definido. As vantagens do método de hidratação do filme seco são a simplicidade e a rapidez na formação de MLVs. Uma das desvantagens deste método, quando comparado a outros métodos que produzem um filme mais amorfo, é que o filme lipídico seco, assim produzido, possui um grau de cristalinidade que dificulta e limita a sua capacidade de hidratação. Outras desvantagens incluem: a sua baixa eficiência de encapsulação, a formação dispersa e heterogênea de MLVs, e sua incapacidade de ser adaptável à escala industrial.4,6
________________________________________________________________________
10
Existem muitas variações do método de hidratação de filme seco, com a utilização de diferentes solventes, métodos de evaporação e hidratação, discutidos extensivamente por Gregoriadis7,8 e New9.
2.2.2 Injeção de Solventes
Neste grupo de métodos, os lipídeos são dissolvidos em um solvente orgânico, normalmente etanol ou éter, e injetados em uma fase aquosa. Na interface entre as fases aquosa e orgânica, os lipídeos se agrupam e formam uma monocamada, que forma a base da metade das bicamadas dos lipossomas. O método produz SUVs diretamente, obtendo-se vesículas de tamanho variável, dependendo da concentração inicial de lipídeos e do modo de injeção.10,11,12 As
vantagens do método são: a simplicidade, a ausência de tratamentos químicos e físicos que podem prejudicar a formulação, a homogeneidade da suspensão com a formação direta de SUVs, e a sua capacidade de ser adaptada em processos de escala industrial. As desvantagens incluem a necessidade de uma etapa adicional para remoção do solvente orgânico e a baixa concentração de vesículas produzida.4
2.2.3 Demulsificação
Nos métodos de demulsificação, os lipídeos são dissolvidos em solventes orgânicos e adicionados à uma fase aquosa. A fase orgânica é miscível com a água, e emulsões de água-em-óleo ou em alguns casos de água-óleo-água são formadas. As moléculas lipídicas, nestas emulsões, se orientam em monocamadas em torno de gotas d´água, e durante a remoção da fase orgânica essas micelas invertidas coalescem, formando lipossomas. Dependendo do modo de preparo e de variações da técnica, esse método pode produzir vesículas unilamelares grandes (LUVs), MLVs, além de outras variedades como os lipossomas multivesiculares. As vantagens deste método incluem a alta eficiência de encapsulação e o grande número de diferentes tipos de lipossomas que podem ser produzidos. A grande desvantagem deste método é o trabalho requerido nas longas etapas dos procedimentos de preparação.4
________________________________________________________________________
11
2.2.4 Secagem por Atomização (“Spray Drying”)
A preparação de lipossomas através do método de spray drying é feita segundo as etapas descritas a seguir. Primeiro, os lipídeos são dissolvidos em um solvente orgânico volátil. A dispersão lipossomal é em seguida atomizada em forma de um spray de gotículas pequenas, em câmara fechada, onde um fluxo de ar quente suspende as gotas e evapora o solvente, formando partículas lipídicas secas que são coletadas através de um ciclone. As partículas secas apresentam grande estabilidade físico-química quando armazenadas adequadamente, e também uma grande área superficial que permite uma alta eficiência de hidratação. Quando as partículas são hidratadas, MLVs são formadas. As vantagens desse método incluem: boa reprodutibilidade, versatilidade de formação de lipossomas de diversas composições, alta eficiência de encapsulação, boa produtividade, alta pureza do produto, fácil operação e manutenção do equipamento, baixo custo, e capacidade de ser utilizado na escala industrial.4,13
Neste método é comum adicionar-se compostos, tais como a trealose ou lactose, na dispersão lipídica pré-secagem. Esses compostos protegem as partículas lipídicas durante a secagem e estocagem, e auxiliam na formação de partículas com caráter mais amorfo, o que é de interesse para garantir uma hidratação eficiente.4,14
2.2.5 Liofilização-Hidratação
O método de liofilização-hidratação envolve primeiro a dissolução dos lipídeos em um solvente orgânico, normalmente t-butanol. A escolha do solvente orgânico é determinada levando-se em conta sua temperatura de congelamento, que necessita estar acima da temperatura do condensador do liofilizador, e sua não reatividade quando em contato com os selantes de borracha que fazem parte do liofilizador. O t-butanol apresenta estas características além de ter uma alta pressão de vapor (26,8 mmHg à 20 oC), descongelar a uma temperatura de
t-________________________________________________________________________
12
butanol forma cristais na forma de agulhas, estas com grande área superficial e baixa resistência de superfície. A sublimação do t-butanol permite que a temperatura baixa do produto lipídico seja mantida, o que evita que este atinja temperaturas próximas à temperatura de colapso. A temperatura de colapso é aquela na qual a viscosidade da mistura soluto/solvente retém sua forma e estrutura durante o processo de sublimação.16 Todas essas propriedades propiciam
uma aceleração da taxa de sublimação e formação de um pó seco com alta porosidade.17
Após a dissolução no solvente orgânico, a dispersão lipídica é transferida para recipientes e rapidamente congelada, colocando-se os recipientes em contato com um bloco de gelo seco, ou em um banho de gelo seco de acetona ou nitrogênio líquido. As soluções congeladas são liofilizadas sob vácuo até secarem completamente, formando filmes lipídicos secos com características amorfas, que favorecem a incorporação de compostos, especialmente os de caráter hidrofóbico, nas bicamadas lipossomais. Os lipídeos liofilizados são hidratados com uma solução aquosa a uma temperatura acima da transição de fases principal dos lipídeos. Ao serem hidratados, os filmes formam MLVs. As grandes vantagens deste método incluem: o uso do solvente t-butanol ao invés de solventes mais tóxicos, como o clorofórmio ou o metanol, e sua alta eficiência de encapsulação de compostos, em particular compostos hidrofóbicos. O método não é agressivo, e é adequado para moléculas sensíveis e de alto valor agregado. As desvantagens do método envolvem os altos custos dos equipamentos e do processo em si, resultante em grande parte de sua baixa eficiência na conservação de energia, e à necessidade de utilizar crioprotetores na liofilização, como o ácido hialurônico18, a trealose, ou a
lactose, para ajudar a manter a estabilidade física da dispersão lipídica no processo.
________________________________________________________________________
13 2.2.6 Sistema Multitubular
A preparação de lipossomas através do Sistema Multitubular foi introduzida na patente de Tournier et al.19 Neste método são produzidas
estruturas lipídicas secas, as quais são precursoras dos lipossomas. O aparato utilizado para a formação de tais estruturas e lipossomas consiste principalmente em uma coluna preenchida com um conjunto de tubos paralelamente dispostos, ou outros materiais inertes de empacotamento, que servem como matrizes para a deposição da estrutura lipídica seca produzida neste método. 19
A geometria e o número de tubos paralelamente dispostos na coluna, constituindo o sistema multitubular, devem ser escolhidos de modo a garantir uma relação área por volume, máxima. O sistema é em geral operado alimentando-se a dispersão lipídica em solvente na parte interna dos tubos. Isso permite controlar a temperatura da parte externa destes, utilizando-se um fluxo circulante de água aquecida ou gelada, ou outros líquidos apropriados para o mesmo fim.
Para o empacotamento os tubos neste sistema também podem ser preenchidos com esferas de vidro ou com outros tipos de preenchimento inertes, com diversos tamanhos, o que propicia uma área superfícial maior disponível para a formação das estruturas lipídicas. São utilizados preferencialmente tubos com dimensões de diâmetro interno entre 0,5 mm e 5 mm, e com espessuras de parede entre 0,5 e 2mm.19
A dispersão lipídica é recirculada promovendo a adsorção dos lipídeos no Sistema Multitubular, e seca a vácuo, formando um filme lipídico seco. Após a secagem, a estrutura lipídica é hidratada com uma fase aquosa a uma temperatura acima da temperatura de transição principal de fase dos lipídeos. Os tamanhos dos lipossomas MLVs produzidos após a fase de hidratação dependem da vazão e do tempo de circulação da solução aquosa.20 Estudos por Carneiro et al.20, também
demonstraram que o Sistema Multitubular foi capaz de produzir MLVs com encapsulamento do fármaco pirazinamida.
________________________________________________________________________
14
Uma das principais vantagens da utilização deste método é a característica de ter uma alta razão de área superficial por volume para a deposição da estrutura lipídica, o que também permite uma hidratação muito eficiente. A alta razão de área superficial por volume também melhora o tempo de processamento dos reatores, o que é de grande importância nos processos industriais. O método também propicia a produção de lipossomas com facilidade de controle e escalonamento. Outras vantagens são que a técnica permite a utilização de materiais de construção de baixo custo e a utilização de um único sistema para as diversas etapas do processo, isto é, deposição, evaporação do solvente, hidratação da estrutura lipídica expandida, além de possibilitar a consecução destas etapas em condições estéreis. 19,20
2.3 Métodos de Redução de Tamanho dos Lipossomas
Existem vários métodos para se obter a redução dos tamanhos dos lipossomas. Os métodos mais comuns são: (1) extrusão, (2) sonicação, (3) prensa francesa, e (4) microfluidização, que estão descritos a seguir.
2.3.1 Extrusão
O método mais eficiente para obter-se uma redução homogênea e com boa estabilidade física dos tamanhos dos lipossomas é o que utiliza uma extrusora. A extrusão é geralmente feita utilizando-se membranas de policarbonato de 400-100 nm sob pressão de nitrogênio, e à temperatura acima da temperatura de transição de fases, Tc, dos lipídeos de modo a obter-se a formação de vesículas
multilamelares pequenas (SMLVs), ou vesículas unilamelares pequenas (SUVs). A pressão requerida para fazer as extrusões é normalmente aplicada com um fluxo de gás nitrogênio, a uma pressão que pode atingir até 1,34E+8 Pa. A preparação lipídica é submetida a um número de extrusões, até que o tamanho e a homogeneidade desejados sejam alcançados. Ao final do processo, as vesículas obtidas apresentam um faixa estreita na distribuição de tamanhos, e seus
________________________________________________________________________
15
diâmetros estão na faixa dos tamanhos dos poros das membranas. Outras vantagens incluem a alta reprodutibilidade e aplicabilidade do método a uma grande variedade de tamanhos de lipídeos que ao final do processo podem ser reduzidos a tamanhos específicos desejados. Uma desvantagem do método é que em alguns casos a suspensão lipossomal necessita ser submetida a extrusões sucessivas, até obter-se os lipossomas desejados. 4,9
2.3.2 Sonicação
A sonicação é o método mecânico que requer o maior gasto de energia dentre os métodos disponíveis para redução de tamanho, e tem a característica de poder ser aplicado diretamente ou indiretamente a uma dispersão de MLVs. A aplicação direta é feita utilizando-se um equipamento de ponta sônica ou ultra-sônica (ultra-sonic tip), onde a ponta é submersa na dispersão lipossomal.4
A aplicação indireta é feita colocando-se a dispersão em um recipiente dentro de um banho sônico ou ultra-sônico. A vantagem de se utilizar o banho sônico ao invés da ponta sônica é que os lipossomas não entram em contato direto com a fonte de ondas ultra-sônicas, porém a densidade de energia da maioria do banhos sônicos é baixa demais para obter-se SUVs com uma população homogênea. Normalmente, durante a aplicação indireta para a redução dos tamanhos dos lipossomas, não há como regular a potência do banho sônico. Em certos casos, o banho sônico pode ser utilizado para ajudar a desprender o filme seco durante e hidratação, e ao mesmo tempo reduzir os tamanhos dos lipossomas presentes na solução. Caso estes necessitem redução adicional de tamanho, outro método mais eficiente pode ser utilizado para esse fim.4
A aplicação direta, utilizando a ponta sônica, é o processo de sonicação mais utilizado para a preparação de SUVs, na escala laboratorial. Porém, a dissipação da energia no sistema pode aquecer demasiadamente a dispersão, podendo causar a degradação dos lipídeos. Por essa razão, a dispersão pode ser resfriada durante a sonicação. O tamanho dos lipossomas produzidos irá depender
