Reação em cadeia da polimerase (RCP, polymerase chain

O DNAc, obtido na etapa anterior, foi utilizado como molde nas reações de PCR. Para estes experimentos, foram sintetizados oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para os genes do prócolágeno III e do gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase (GAPDH), utilizado como controle positivo em todas as reações. Estes oligonucleotídeos possuem entre 18 a 30 nucleotídeos e composição de G-C entre 50-60%, sendo confeccionados com base na seqüência dos genes em estudo

já publicados no GeneBank (BATHESDA, MD USA), como pode ser observado na tabela 2. Para evitar a amplificação inespecífica, os primers sintetizados foram posicionados em diferentes exons. Desta forma, foi possível distinguir, por tamanho, os produtos de PCR derivados da amplificação do DNAc dos derivados da contaminação de DNA genômico. As reações de PCR foram realizadas em um termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer – Norwalk, EUA).

O Quadro 5 mostra a seqüência e localização dos primers, bem como, o tamanho dos produtos de amplificação obtidos a partir da reação de RT-PCR.

Quadro 5 – Primers utilizados nas reações de RT-PCR.

A posição do primer e o tamanho esperado dos produtos de amplificação são dados com base na seqüência de DNAc do gene já clonado para rato.

MOLÉCULA SEQÜÊNCIA DO PRIMER POSIÇÃO TAMANHO GAPDH

Sense Antisense

5’ GTC TTC ACC ACC ATG GAG 3’

5’ CGA TGC CAA AGT TGT CAT 3’

325 - 342

517 - 535

GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase; PCII: procolágeno III; pb: pares de base.

Após a transcrição reversa todo o DNAc foi utilizado nas reações de PCR contendo diferentes pares de primers. Para a amplificação, foram utilizados 25 pmoles de cada oligonucleotídeo, 1,25 mM dNTP (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), 50mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 9.0, 0.1% Triton X-100 (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) e 2,5 U de Taq DNA

643 pb 211 pb 211 pb Sense Antisense 5’ CTG CCA TTG CTG GAG TTG 3’

5’ GAC GCC ATC CTC TAG AAC 3’

903 - 101

1529 - 1546

643 pb Procolágeno III

Polimerase (Gibco BRL - Life Technologies, Rockville, MD, EUA), em um volume total de 25 μL de reação. O programa utilizado consiste de desnaturação a 94°C, por 45 segundos, anelamento a 54°C tanto para prócolágeno III, quanto para GAPDH, por 45 segundos, e extensão a 72°C, por 1 minuto, por 36 ciclos. (Quadro 6).

Quadro 6 – Descrição das condições das reações de RT-PCR.

CONDIÇÕES

Nº DE CICLOS

Desnaturação Tempo Ligação Tempo Extensão Tempo

Procolágeno

III (rato) 94ºC 45 seg 54ºC 45 seg 72ºC 60 seg 36

GAPDH (rato)

94ºC 45 seg 54ºC 45 seg 72ºC 60 seg 36 As temperaturas e tempos, assim como, o número ideal de ciclos utilizados nas várias etapas da reação de RT-PCR para amplificação dos diferentes genes pode ser observado.

Para excluir a possibilidade de contaminação, foram realizados controles negativos para cada reação. Nestes tubos foi adicionada água ao invés de DNAc.

Após a reação de PCR, 25 µL de cada amostra, correspondente aos vários grupos experimentais de animais, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5 %. Os produtos de amplificação foram identificados de acordo com o peso molecular esperado.

O gene do GAPDH, que por ser um gene abundantemente expresso em todas as células sem sofrer variação da sua expressão com os diferentes tratamentos realizados neste trabalho, serviu como controle interno de todos os experimentos de RT-PCR. Pares de oligonucleotídeos correspondentes ao GAPDH foram amplificados juntamente com o gene em estudo para todas as reações de PCR realizadas.

5.0 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas pelo programa Sigma Stat 3.1 (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). A normalidade dos dados (teste de Kolmogorov-Smirnov com correção de Lilliefors) e a homogeneidade das variâncias foram testadas (teste de Levene). Para avaliar a diferença entre os dados da mecânica, morfometria pulmonares e oxigenação dos diferentes grupos foi utilizada a análise bi-variada, considerando os seguintes fatores: 1) presença ou não de lesão pulmonar aguda e 2) realização ou não de manobra de recrutamento.

Para avaliar a diferença de células epiteliais de rim, fígado, intestino e pulmão e microscopia eletrônica foi utilizado Anova on ranks.

Quando múltiplas comparações foram necessárias utilizou-se o Teste Tukey. O valor de significância estabelecido foi um p < 0,05.

6.0 Resultados

6.1 Mecânica pulmonar

Os valores de volume e fluxo utilizados durante o experimento foram similares em todos os grupos (Tabela 1). A pressão de platô se elevou após 1 hora de ventilação mecânica no grupo LPA não recrutado (Tabela 1). No grupo controle, as pressões de pico e de platô reduziram após a manobra de recrutamento com STEP. No grupo LPA a elastância estática, pressões resistivas e viscoelástica reduziram após ambas as MR; sendo a queda das pressões de pico e de platô e elastância significativa no grupo STEP do que CPAP (Figuras 11 e 12).

Tabela 1 - Valores de fluxo, volume, pressões de pico e platô nos grupos controle

(C) e com lesão pulmonar aguda (LPA).

C

LPA

Variáveis NR CPAP STEP NR CPAP STEP

Fluxo (mL/s) 6,01±0,01 6,02±0,02 6,00±0,01 6,02±0,02 6,00±0,04 6,03±0,03 Antes Volume (mL) 1,52±0,02 1,49±0,01 1,48±0,01 1,50±0,01 1,50±0,01 1,50±0,01 Ppico (cmH2O) 4,16±0,72 4,89±0,86 4,95±1,18 7,85±1,31* 7,00±1,03* 8,12±1,47* Pplato (cmH2O) 2,14±0,57 2,47±0,46 2,51±0,99 5,32±1,31* 4,53±0,73* 4,87±1,39*

Variáveis NR CPAP STEP NR CPAP STEP

Fluxo (mL/s) 6,01±0,01 6,00±0,02 6,01±0,01 6,06±0,04 6,01±0,02 6,00±0,04 Após Volume (mL) 1,51±0,02 1,50±0,01 1,50±0,03 1,50±0,02 1,50±0,01 1,51±0,02 Ppico (cmH2O) 4,91±0,65 4,58±0,65 4,14±1,15 8,12±0,94* 5,30±1,09*,** 4,62±0,65**# Pplato (cmH2O) 2,41±0,65 2,39±0,48 2,28±1,07 5,59±0,85* 3,10±1,09*,** 2,34±0,43**#

Os valores correspondem à média de seis animais do grupo controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA) ± erro padrão da média. NR: Não Recrutados; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. Antes: mecânica medida imediatamente antes da manobra de recrutamento. Após: mecânica medida 1 hora após manobra de recrutamento. *Valores significativamente diferente de LPA (p<0,05). **Valores significativamente diferentes do LPA-NR. # Valores significativamente diferentes de LPA-CPAP (p<0,05).

Figura 11 - Mecânica pulmonar: elastância estática

E

st,L

(c

m

H

2

0.

m

l

-1

)

0 1 2 3 4 5 6

C

LPA

NR CPAP STEP NR CPAP STEP

*

**

**

p<0.001 Antes MR 1h após MR

Elastância Estática do Pulmão (Est,L) nos grupos controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA). As barras representam a média de 6 animais + erro padrão da média. Est, L = Elastância estática do pulmão. NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Significativamente diferente de C. **Significativamente diferente do LPA-NR (p<0,05).

Figura 12 - Mecânica pulmonar: pressões resistiva e viscoelástica

ΔP,

L (

cm

H

2

0)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

C

LPA

NR CPAP STEP NR CPAP STEP

*

**

**

ΔP1

ΔP2

Variação de pressão pulmonar (ΔP, L) nos grupos controle (C) e lesão pulmonar aguda (LPA). As barras representam a média de 6 animais + erro padrão da média.

∆P1= pressão resistiva; ∆P2= pressão viscoelástica/inomogênea. NR: Não

Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Significativamente diferente de C. **Significativamente diferente do LPA-NR (p<0,05).

6.2 Análise histológica e morfométrica do parênquima pulmonar

Os animais do grupo lesão pulmonar aguda apresentaram maior fração de área de colapso alveolar em comparação ao grupo controle (Figuras 13 e 14).

As manobras de recrutamento com CPAP e por STEP reduziram a fração de área de colapso alveolar, sendo tal redução mais significativa no grupo que foi recrutado progressivamente (Figuras 13 e 14). Não foi constatada área de hiperinsuflação em nenhum dos grupos estudados.

Figura13 - Morfometria do parênquima pulmonar

0 20 40 60 80 100 NR CPAP STEP NV ** NR CPAP STEP NV

C

LPA*

# ¶ ** ** #

M

or

fom

et

ria Pul

m

onar

(

%

)

Normal Colapsado

Fração de área de alvéolos normais e colapsados. As barras corresponde à média de 6 animais + erro padrão da média. Animais controle (C) e lesão pulmonar aguda

(LPA). NV: Não Ventilado; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua

na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes entre os grupos C versus LPA. **Valores significativamente diferentes do NV. #Valores significativamente diferentes área colapsada do grupo NR. ¶Valores significativamente diferentes área colapsada do grupo LPA-CPAP versus LPA-STEP (p<0,05).

Figura 14 - Fotomicrografias do parênquima pulmonar 100 mm C-NR LPA-CPAP C-CPAP C-STEP CNV LPA-NV LPA-NR 100 mm 100 mm 100 mm 100 mm 100 mm 100 mm 100 mm LPA-STEP

Fotomicrografia de parênquima pulmonar (aumento de 200x) corado em H&E de animais controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NV: Não Ventilado; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. Note na ponta da seta áreas de colapso alveolar (seta).

6.3 Análise da pressão parcial de oxigênio no sangue arterial

Os animais do grupo lesão pulmonar aguda apresentaram aumento da PaO2 após a ventilação mecânica independentemente do grupo estudado. Entretanto, esse aumento foi maior no grupo LPA-STEP quando comparado com LPA-CPAP .

Tabela 2 – Pressão parcial arterial de oxigênio

Grupos PaO2 mmHg

Antes PaODepois 2 mmHg

LPA-NR 72 ±0,5 113 ±4,0

LPA-CPAP 64±21 115 ±14*

LPA-STEP 70 ±0,8 314 ±38*,**

Os valores correspondem à média de 3 animais + erro padrão da média. Lesão Pulmonar Aguda (LPA); NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes do grupo LPA-NR. **Valores significativamente diferentes do grupo LPA-CPAP (p<0,05).

6.4 Análise da microscopia eletrônica

A microscopia eletrônica evidenciou pnemócitos tipo I e II, endotélio e epitélio alveolar preservados no grupo controle, mantendo-se a integridade capilar e da menbrana basal. Após a indução da lesão pulmonar aguda constatou-se apoptose do pneumocitos do tipo II, desacoplamento da membrana basal e deterioração dos corpos lamelares. Entretanto, a manobra de recrutamento prgressivo (STEP) induziu menor número de células apoptóticas e lesão endotelial, e maior preservação da membrana alvélo-capilar em comparação aos animais recrutados com CPAP ou não recrutados (Tabela 3 e Figura 15).

Tabela 3 – Análise semiquantitativa da microscopia eletrônica no grupo LPA

Variáveis LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP

Apoptose 3,0 (2-4) 1,5 (1-2)* 0,5 (0-1) *# Necrose PI 3,0 (3-4) 1,5 (1-3)* 1,0 (0-2) *# Necrose PII _{3,5 (2-4) 2,5 (2-3) 1,0 (1-2) *}# Membrana Basal Desnudada 3,0 (2-4) 2,5 (2-3) * 1,0 (1-2) *# Colapso Alveolar 4,0 (3-4) 1,5 (1-3) * 1,0 (0-2) *# Lesão Endotelial 2,5 (2-3) 2,0 (2-3) * 1,0 (0-2) *# Membrana Hialina 2,0 (2-3) 2,0 (1-2) 1,5 (1-2) *# Valores correspondem à mediana (Min-Max) de 4 animais por grupo. Escore de apoptose no pulmão. LPA: Lesão Pulmonar Aguda; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. * Valores significativamente diferentes do LPA-NR (p<0,05). #_Valores significativamente diferentes de LPA-CPAP (p<0.05).

Figure 15 - Fotomicrografia eletrônicas do parênquima pulmonar.

PII

PII

_PII C LPA-NR LPA-CPAP A A My 500 nm 1000nm 1000nm A CA LPA-STEP 500 nm A

PII

PII

Microscopia eletrônica de animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NR: Não-recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea;

STEP: Pressurização Progressiva. Note lesão epitelial nos grupos LPA PII e

6.5 Análise da apoptose de órgãos

Os animais do grupo lesão pulmonar aguda apresentaram aumento na apoptose das células epiteliais do pulmão, rim, fígado e intestino. A manobra de recrutamento com CPAP e STEP reduziu o número de células apoptóticas no fígado, rim e pulmão sendo essa queda mais significativa no grupo LPA-STEP (Tabela 4 e Figuras 16 e 17).

Tabela 4 – Índice de apoptose celular

Órgãos LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP Intestino Anti-FasL 3,0 (2-4) 1,5 (1-3)* 1,5 (0-2)* Fígado Anti-FasL 3,0 (2-4) 1,0 (1-2)* 1,0 (0-1)* Rim Anti-FasL 3,5 (3-4) 2,0 (1-2)* 0,5 (0-1)* # Pulmão Anti-FasL 3,0 (2-4) 1,5 (1-2)* 0,5 (0-1)*#

Valores correspondem à mediana (min-max) de 3 animais por grupo. Escore de apoptose no pulmão, intestino, rim e fígado (Sistema Fas/FasL), dos animais do grupo com lesão pulmonar aguda (LPA). NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes do LPA-NR. #Valores significativamente diferentes do

Fotomicrografia representativa do parênquima pulmonar (aumento de x400) nos animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NR = Não Recrutado; CPAP = Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP = manobra de recrutamento com pressurização progressiva. A-D: fixado com técnica de Túnel. E-

F: fixado com hematoxilina-eosina.

C-NR LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP

A B C D E F G H

D

C

B

H

G

E

F

A

200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm

Figure 17 – Fotomicrografia representativa de órgãos distais para análise de células apoptóticas. CLV K H H H H C- NR LPA-NR LPA-CPAP LPA-STEP

Intestino Fígado Rim

200 µm

Fotomicrografia representativa dos animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA). NR = Não Recrutado; CPAP = Pressão Positiva Contínua na Via Aérea; STEP = manobra de recrutamento com pressurização progressiva. Note presença de células epiteliais apoptóticas no intestino, fígado e rim (aumento de x400).

6.6 – Análise da expressão de RNAm para procolágeno do tipo III (RT-PCR)

Observa-se aumento estatisticamente significativo da expressão de RNAm para procolágeno tipo III (PCIII) no grupo LPA em relação ao grupo controle, sendo que no grupo LPA-NR e LPA- CPAP este aumento foi mais significativo quando comparado com o grupo LPA-STEP (Figura 18).

Figura 18 – Expressão de RNAm para procolágeno tipo III

L

P

C

III/G

A

P

D

H

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

*

*

* **

NR CPAPSTEP STEP NR CPAP

___________ C ___________ LPA ← PCIII (643bp) ← GAPDH (211bp)

WM NR CPAP NR CPAP STEP

________________

C LPA

STEP

_______________

Expressão de RNAm para procolágeno tipo III. Os dados estão expressos como média + erro padrão de 4 animais dos grupos controle (C) e com lesão pulmonar aguda (LPA).

NV: Não Ventilado; NR: Não Recrutado; CPAP: Pressão Positiva Contínua na Via

Aérea; STEP: Pressurização Progressiva. *Valores significativamente diferentes do grupo Controle. ** Valores significativamente diferentes do grupo LPA-CPAP.

7.0 Discussão

O uso de modelos animais possibilitou o entendimento da patogênese da LPA/SDRA com etiologias distintas e permitiu avanços importantes no desenvolvimento e no aprimoramento de abordagens terapêuticas (Rocco e cols., 2004). Neste contexto, optamos por utilizar ratos Wistar, já que nossos experimentos exigiam um número considerável de animais, além de ser possível mimetizar as características da LPA/SDRA humana nessa espécie. O modelo experimental em ratos permite uma avaliação adequada dos parâmetros ventilatórios e histológicos pulmonares, sendo que o modelo experimental ideal da LPA/SDRA é aquele que reproduz a etiologia bem como as fases fisiopatológicas que caracterizam a síndrome.

No presente estudo foi utilizado modelo experimental de lesão pulmonar aguda induzido por paraquat. O paraquat é um herbicida que se acumula predominantemente no pulmão induzindo lesão ao epitélio alveolar principalmente o pneumócito do tipo II. Conseqüentemente, o paraquat acarreta edema intersticial e alveolar, hemorragia intra-alveolar, inflamação com recrutamento de neutrófilos, além da formação de membrana hialina (Smith e cols.,1974; Delaval & Cillespie 1985; Rocco e cols., 2001; 2004; Contador e cols., 2003). Portanto, é um modelo experimental de dano alveolar difuso que mimetiza as alterações histológicas presentes na lesão pulmonar aguda. Ademais, o paraquat é fácil de ser administrado, tem efeito rápido e apresenta baixo custo. Nesse trabalho utilizamos paraquat na dose de 15 mg/kg, que é suficiente para induzir lesão pulmonar aguda com 100% de sobrevida nas primeiras 24 horas (Rocco e cols., 2001). Constatamos modificações da mecânica pulmonar (elastância, pressões resistivas e viscoelásticas) no presente modelo de LPA, provavelmente em função da disfunção

endógena do surfactante que propicia modificações nas propriedades tenso-ativas, colapso alveolar e conseqüente infiltração neutrofílica (John e cols., 1982; Ware & Mathay, 2000; Aird 2003). A grande maioria dos modelos de lesão pulmonar aguda em animais utiliza técnicas de depleção de surfactante através de lavagem salina ou injeção de ácido oléico (Bond e cols., 1994; Rimensberger e cols., 1999; Cakar e cols., 2000; Van der Kloot e cols., 2000) para entender os efeitos benéficos das manobras de recrutamento. Se por um lado esses modelos são fáceis e rápidos de serem desenvolvidos, eles acarretam principalmente colapso alveolar por diminuição do surfactante endógeno, não apresentando características histológicas de dano alveolar difuso. A fisiopatologia da LPA é mais complexa, caracterizada por edema intersticial e alveolar, hemorragia alveolar, deposição de fibrina, infiltração neutrofílica, lesões de células do epitélio alveolar e endotélio capilar, promovendo aumento da permeabilidade alvéolo capilar (Barbas e cols.,1996; Ware & Matthay, 2000; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005). Nesse contexto, a grande maioria dos estudos que analisou a resposta da manobra de recrutamento e utilizou o modelo de lavagem com salina sofreu crítica, já que tal modelo não expressa as características fisiopatológicas da SDRA/LPA humana (Fujino e cols., 2001; Takeuchi e cols., 2002).

A manobra de recrutamento (MR) é um processo fisiológico dinâmico que está relacionado à reabertura das unidades alveolares após redução do volume nos alvéolos, que ocorrem em função de: baixos níveis de PEEP, diminuição do volume corrente, alta FiO2, repetidas aspirações traqueais bem como sedação e paralisia dos músculos respiratórios. As MRs vêm sendo utilizadas com o objetivo de reverter e/ou prevenir o colapso de vias aéreas distais, ductos e/ou unidades alveolares. Atualmente, a MR mais comumente utilizada é o CPAP (pressão positiva continua na

via aérea), com pressão de insuflação que varia entre 30 – 40 cmH2O por 30 – 60 segundos. Essa manobra promove aumento da capacidade residual funcional, elevando a pressão intra-alveolar ao final da expiração, permitindo, assim, melhora nas trocas gasosas sem provocar intensa instabilidade hemodinâmica e depressão circulatória (Bond e cols., 1994; Tusmane cols., 1999; Rimensberger e cols., 1999; Van der Kloot e cols., 2000; Cakar col., 2000; Amato e cols., 1998; Maggiore e cols., 2003; Tusman e cols., 2004; Farias e cols., 2005; Lapinsky e cols., 2005). No presente estudo constatamos melhora dos parâmetros da mecânica pulmonar (Figura 11 e 12) e da oxigenação (Tabela 2), similarmente aos observados em outros modelos experimentais e clínicos (Bond e cols., 1994; Rimensberger e cols., 1999; Van der Kloot e cols., 2000; Cakar e cols., 2000; Amato e cols., 1998; Yi e cols., 2005). Ademais, observamos discreta melhora do colapso alveolar, porém não houve redução no índice de apoptose de células epiteliais no pulmão, rim, fígado e intestino, provavelmente em função do estresse de cisalhamento decorrente do colapso alveolar (Dos Santos & Slutsky, 2006). A MR com CPAP também induziu modificações ultraestruturais no parênquima pulmonar como: deterioração dos corpos lamelares dos pneumócitos tipo II, ruptura da membrana basal e aumento no número de miofibroblastos (Figura 15). Logo, a MR com CPAP além de perpetuar o processo inflamatório acarretou desacoplamento da membrana basal em função do estresse determinado pelas altas pressões de insuflação, mantendo elevada a expressão de procolágeno tipo III (Terragni e cols., 2007), (Figura 18).

Com intuito de propiciar uma abertura de unidades alveolares mais homogênea, sem induzir hiperdistensão e colapso alveolar, e, concomitantemente, melhorar a oxigenação e a mecânica pulmonar (Terragni e cols., 2007; Pelosi e cols., 1999; Borges e cols., 2006; Maisch e cols., 2008) idealizamos a manobra de

recrutamento com aumento progressivo da pressão inspiratória (STEP). Acreditamos que esse aumento paulatino da pressão inspiratória até 45 cmH2O durante a MR permitiria com que alvéolos colapsados se abrissem sem induzir imediata hiperdistensão e conseqüente estresse tensil nas unidades alveolares de alta complacência e grande constante de tempo. Ademais, o STEP durante 20 minutos propiciaria com que os alvéolos com menor complacência se abrissem lentamente. Um nível de PEEP em 15 cmH2O foi associada a MR com STEP com o intuito de evitar o desrecrutamento promovendo estabilização das unidades alveolares (Albaiceta e cols., 2005; Erlandsson e cols., 2006), reduzindo o estresse de cisalhamento associado ao colapso. Esse nível de PEEP foi previamente estudado em outros estudos experimentais (Marini e cols.,2007; Carvalhos e cols., 2007; Rouby e cols., 2007) e clínicos. Nesse contexto, o ARDSNET constatou que o nível médio de PEEP utilizado para obter uma boa oxigenação nos pacientes com SDRA foi de 15 cmH2O (ARDSNET 2000; Kallet e cols., 2005). Malboisson e colaboradores também constataram através de análise com tomografia computadorizada, que a aplicação de PEEP de 15 cmH2O em pacientes com SDRA, acarretava aumento na CRF, da PaO2 e redução do shunt intrapulmonar (Malboisson e cols.,2005). Poucos artigos analisaram as conseqüências de altos níveis de PEEP (entre 20 e 50 cmH2O) e, apesar de terem constatado recrutamento efetivo, altos níveis de PEEP acarretam efeitos prejudiciais tais como: hiperdistensão, podendo ocasionar até barotrauma, e distúrbios hemodinâmicos com queda do débito cardíaco (sendo necessário o uso de drogas vasoativas e reposição de fluidos (Borges e cols., 2006; Toh e cols., 2007).

A MR com STEP acarretou melhora na elastância, pressões resistivas e viscoelásticas pulmonares (Tabela 1 e Figuras 11 e 12) quando comparados com o

grupo LPA-NR e CPAP (p<0,001). Esse efeito benéfico pode ser atribuído a redução das áreas de colapso após MR com STEP (Figuras 13 e 14). Complementarmente, não foi observado desacoplamento ou ruptura da membrana alvéolo-capilar quando o recrutamento foi realizado com STEP, sugerindo que o aumento paulatino da pressão inspiratória propicia redução da atelectasia e preservação da membrana alvéolo-capilar (Figura 15). Logo, a MR por STEP acarretou melhora dos parâmetros morfo-funcionais sem conseqüências deletérias locais e sistêmicas.

Após MR com CPAP ou STEP utilizou-se estratégia ventilatória protetora (VT = 6 ml/kg) e PEEP de 5 cmH2O. Esse nível de PEEP foi previamente estudado por Farias e colaboradores que constataram que a manobra de CPAP seguida de ZEEP induzia aumento da expressão de procolágeno tipo III, e quando mantido a PEEP de 5 cmH2O não mostrou modificação do PCIII. Entretanto, não podemos descartar se o efeito na melhora histológica seria maior caso a PEEP utilizada fosse mais elevada.

Interessante ressaltar que além das modificações respiratórias foi constatado aumento no índice de apoptose de células epiteliais de pulmão, rim, fígado e intestino tanto no grupo LPA como LPA-CPAP. Essas alterações podem ser atribuídas: 1) dano alveolar difuso acarretando lesão pulmonar e em órgãos a distância, 2) o grupo LPA foi ventilado com 6 ml/kg que induz colapso alveolar induzindo estresse de cisalhamento (Hammerschmidt e cols., 2004), 3) a MR com CPAP acarreta estresse tensil em função do rápido aumento da pressão num tempo curto e estresse de cisalhamento por não abrir todas as unidades alveolares perpetuando áreas de colapso alveolar. Logo, a associação de estresses tensil e/ou de cisalhamento induziria reação inflamatória e conseqüente indução de apoptose em células epiteliais do pulmão e de órgãos a distância (Tremblay & Slutsky, 1998; Dos Santos e cols., 2006). Nesse contexto, estudos clínicos e experimentais

demonstraram que estratégias ventilatórias lesivas podem iniciar ou perpetuar uma

No documento Andréia Ferreira da Silva (páginas 55-96)