Andréia Ferreira da Silva
Manobra de recrutamento progressivo melhora a mecânica
pulmonar e a oxigenação limitando os danos ao epitélio
alveolar em modelo experimental de lesão pulmonar aguda
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro
Departamento de Clínica Médica
Pós-graduação (nível mestrado)- Setor Clínica Médica - Área de
concentração: Ciências Pneumológicas
Orientadores
Profa. Patricia Rieken Macedo Rocco
Prof. Marcus Barreto Conde
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
1. Mecânica Respiratória . 2. Síndrome do Desconforto Respiratório do Adulto - fisiopatologia. 3. Complacência pulmonar. 4. Microscopia eletrônica . 5. Apoptose. 6. Ratos Wistar. 7. Ciências Pneumonológicas – Tese. I. Rocco, Patricia Rieken Macedo. II. Conde, Marcus Barreto. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina,
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica. IV. Título.
Silva, Andréia Ferreira
Manobra de recrutamento progressivo melhora a mecânica pulmonar e a oxigenação limitando os danos ao epitélio alveolar em modelo experimental de lesão pulmonar aguda / Andréia Ferreira da Silva. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2008.
xii, 80 f. : il. ; 31 cm.
Orientadores: Patricia Rieken Macedo Rocco e Marcus Barreto Conde Dissertação (mestrado) – UFRJ/Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, 2008.
MANOBRA DE RECRUTAMENTO PROGRESSIVO MELHORA A
MECÂNICA PULMONAR E OXIGENAÇÃO LIMITANDO OS DANOS AO
EPITÉLIO ALVEOLAR EM MODELO
EXPERIMENTAL DE LESÃO
PULMONAR AGUDA
ANDRÉIA FERREIRA DA SILVA
ORIENTADORES: PATRICIA RIEKEN MACEDO ROCCO MARCUS BARRETO CONDE
Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro visando à obtenção do grau de Mestre em Ciências: Clínica Médica
APROVADA POR:
Prof. Neio Boechat Prof. Adjunto UFRJ
Prof. Hugo Castro Faria Neto Prof. Adjunto Fiocruz
Profa. Fernanda Mello Prof. Adjunto UFRJ
Rio de Janeiro Março 2008
O presente estudo foi realizado no Laboratório de Investigação Pulmonar do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico (CNPq) e Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX-FAPERJ).
Dedicatória
Ao meu marido, Alexandre, pelo amor incondicional dedicado ao longo desses anos, compreensão, palavras de consolo na hora certa, incentivo nos momentos difíceis, quando tudo parecia impossível.
Aos meus pais, pelo exemplo de serenidade e coragem.
A minha querida sobrinha Giovanna e minha irmã Elaine, pelo sorriso na hora certa, pelos gestos de amor.
A minha querida sogra Laís, pelos seus ensinamentos, força e amor.
Agradecimentos
Ao longo dos últimos anos durante a elaboração deste trabalho, pude conviver e conhecer pessoas que foram fundamentais, tanto na elaboração dessa dissertação de mestrado como na minha vida pessoal. Gostaria de expressar meu sincero agradecimento.
- À Professora Patricia Rocco, pelo seu brilhantismo, competência, orientação e atenção a mim dispensada. Pelo exemplo de pesquisadora dedicada, incansável e responsável, acima de tudo, por ter me ensinado o que é ser um pesquisador.
- Ao Professor Marcus Conde, por sua competência. Obrigada pela disponibilidade, atenção e por acreditar em mim, o que possibilitou que eu percorresse esse caminho.
- Aos Professores Vera Capellozi e. Marcelo Moralles pela colaboração na realização das análises histológicas e moleculares.
- Às pessoas que tornaram esse sonho uma realidade: Raquel Santos, Viviane Santiago, Gisele Oliveira e Débora Ornellas, por tornar agradável cada etapa da realização do projeto.
- Às amigas e conselheiras de todos os momentos: 1) Thaís Escorsim, que com sua alegria e disponibilidade me ajudou, amparou e acolheu, 2) Liliane Nardelli, que com seu dinamismo e positivismo me mostrou novos horizontes, 3) Mariana Genuíno e Gisele Oliveira, por suas palavras de incentivo e coragem em qualquer momento e pela certeza de que, ao final, tudo vai acabar bem e 4) Débora Xisto que aprendi a admirar e confiar.
- As amigas Caroline Pássaro, Cristiane Nascimento e Alba Fermades, por me introduzirem no mundo da pesquisa, me ensinar uma, duas, três... vezes, sempre prontas para ajudar.
- Obrigada por fazerem parte desta longa jornada, por estarem ao meu lado, pelo carinho, afeto e gesto de amor. São anos que ficaram marcados na minha vida e, jamais esquecerei. O meu muito obrigado preenchido com muito amor.
Resumo
MANOBRA DE RECRUTAMENTO PROGRESSIVO MELHORA A MECÂNICA PULMONAR E OXIGENAÇÃO, LIMITANDO OS DANOS AO EPITÉLIO ALVEOLAR EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO PULMONAR AGUDA.
Andréia Ferreira da Silva. Orientadores: Patricia Rieken Macêdo Rocco e Marcus Barreto Conde. Resumo da dissertação de mestrado submetido à Faculdade de Medicina - Departamento de Clínica Médica - Pós-graduação - Setor Clínica Médica - Área de concentração: Ciências Pneumológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências.
INTRODUÇÃO: As manobras do recrutamento (MRs) vêm sendo propostas na
Lesão Pulmonar Aguda (LPA)/Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo(SDRA) para abrir as unidades alveolares colapsadas, melhorando a troca gasosa e a mecânica pulmonar. Entretanto, essas manobras podem acarretar estresse mecânico ao parênquima pulmonar. OBJETIVO: Comparar a MR realizada com insuflação contínua (CPAP) com uma nova estratégia onde se insufla o pulmão progressivamente (STEP). MÉTODOS: Trinta e seis ratos Wistar (250-300 g) foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos (n=36). No grupo do controle (C) injetou-se salina (0,1 mL) intraperitonealmente (i.p.) e no grupo LPA, injetou-injetou-se paraquat (15 mg/kg, i.p.). Após 24 horas, os ratos foram sedados, anestesiados e paralisados. A MR foi realizada com CPAP 40 cmH2O por 40s ou “STEP” (aumento progressivo de 5 cmH2O de pressão inspiratória a cada 2 minutos, de 25 a 45 cmH2O, com PEEP fixo de 15 cmH2O). Os animais foram ventilados por 1 hora com VT = 6 mL/kg e PEEP = 5 cmH2O. A mecânica e a histologia pulmonares, a pressão parcial arterial de oxigênio (PaO2), a apoptose de células do pulmão, rim, fígado e intestino e a expressão do RNAm para procolágeno do tipo III (PCIII) foram analisados.
RESULTADOS: A elastância estática do pulmão foi reduzida no grupo LPA após
ambas MR, sendo mais significativa após “STEP” (p<0,001) A PaO2 se elevou mais após “STEP” do que CPAP (p<0,05). A fração de área de colapso foi menor no grupo recrutado por “STEP” em comparação com CPAP no grupo LPA (p<0,05). O grupo de CPAP apresentou extensa lesão do epitélio alveolar e do endotélio capilar, aumento do número de células apoptóticas no rim, fígado, intestino e pulmão e incremento na expressão do RNAm para procolágeno do tipo III. CONCLUSÃO: A MR por “STEP” em comparação com CPAP melhorou a mecânica pulmonar e oxigenação, reduziu o número de células apoptóticas no pulmão e em órgãos a distância e a expressão RNAm para PCIII.
Palavras chaves: elastância, morfometria, apoptose, microscopia eletrônica.
Rio de Janeiro Março de 2008
Abstract
STEPWISE RECRUITMENT MANEUVER IMPROVES LUNG MECHANICS AND OXYGENATION, WITH LIMITED DAMAGE TO ALVEOLAR EPITHELIUM EXPERIMENTAL MODEL IN ACUTE LUNG INJURY. Andréia Ferreira da Silva. Orientadores: Patricia Rieken Macêdo Rocco e Marcus Barreto Conde. Resumo da dissertação de mestrado submetido à Faculdade de Medicina - Departamento de Clínica Médica - Pós-graduação - Setor Clínica Médica - Área de concentração: Ciências Pneumológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências.
INTRODUCTION: Recruitment maneuvers (RMs) have been proposed as an adjunct
therapy for mechanical ventilation in Acute Lung Injury/Acute Respiratory Distress Syndrome patients. RMs opened the collapsed alveoli improving oxygenation and lung mechanics. However, RMs may include alveolar stress. AIM: To compare RM with CPAP with new strategy with progressive lung inflation. METHODS: Thirty-six Wistar rats (250-300 g) were randomly divided into two groups (n=36). In control (C) group, saline (0,1 mL) was intraperitoneally injected, while ALI animals received paraquat (15 mg/kg, i.p.). Twenty-four hours after the injection, rats were sedated, anesthetized, and paralyzed. Recruitment was done by using 40 cmH2O CPAP for 40 s or by the stepwise maneuver (STEP, Inspiratory pressure levels progressively increasing in 2-minutes steps of 5 cmH2O from 25 to 45 cmH2O, with a fixed PEEP of 15 cm H2O). Rats were then ventilated with tidal volume of 6 mL/kg and PEEP = 5 cm H2O for 1 hour. RESULTS: Lung static elastance improved after CPAP and STEP in ALI group but reduced more after STEP than CPAP (p<0.001) PaO2 increased more after STEP (than CPAP (p<0.05).In addition, the fraction of area of alveolar collapse was lower after STEP compared to CPAP (p<0.05). After RM, CPAP group showed extensive injury of alveolar epithelium, capillary endothelium, increased level of apoptosis in lung, kidney, villi and liver, and mRNA expression of PC III.
CONCLUSION: Stepwise in compare to CPAP improved lung mechanics and
oxygenation reduced the rate of apoptosis in distal organs and the expression of PC III in lung tissue.
Keywords: Elastance; Morphometry; apoptosis, electron microscopy
Rio de Janeiro Março 2008
ÍNDICE
Folha de rosto ... i
Folha de aprovação ... ii
Ficha catalográfica ... ii
Agências financiadoras ... iii
Dedicatória ... iv Agradecimentos ... v Resumo ... vi Abstract ... vii Sumário ... viii Índice de figuras ... ix
Índice de tabelas e quadros... x
Abreviaturas ... xi
1. Introdução ... 1
1.1 Ventilação mecânica ... 1.2 Barotrauma... 1.3 Volutrauma... 1.4 Estratégia ventilatória protetora... 1.5 Manobra de recrutamento alveolar... 1.5.1 Manobra de recrutamento alveolar (Estudo experimentais)... 1.5.2 Manobra de recrutamento alveolar (Estudos clínicos)... 3 5 7 9 12 13 15 2. Justificativa... 21 3. Objetivos... 22 3.1 Objetivo geral... 22 3.2 Objetivo específico... 22 4. Materiais e eétodos... 23 4.1 Metodologia de estudo... 23 4.2 Amostra do estudo... 23 4.3 Protocolo de estudo... 25
4.4 Preparo dos animais... 26
4.5 Estudo da mecânica pulmonar... 30
4.6 Gasometria arterial... 34
4.7 Microscopia óptica... 35
4.7.1 Fixação e preparo das lâminas... 35
4.7.2 Análise histológica e morfométrica... 4.8 Microscopia eletrônica de transmissão... 4.9 Detecção e quantificação de célula apoptóticas... 4.10 Quantificação da expressão de RNAm para procolágeno tipo III... 4.10.1 Extração de RNAtotal de tecido pulmonar... 4.10.2 Transcrição reversa (RT)... 4.10.3 Reação em cadeia da polimerase (RCP, polymerase chain reaction PCR)... 36 36 38 40 40 41 42 5.0 Análise Estatística... 45 6 Resultados ... 46 6.1 Mecânica pulmonar... 46 6.2 Análise histologica e morfometrica do parênquima pulmonar...
6.3 Pressão parcial de O2 no sangue arterial... 6.4 Microscopia eletrônica
50 52 52
6.5 Análise da apoptose de órgãos
6.6 RNAm para procolágeno Tipo III...
55 58 7. Discussão ... 59 8.Conclusões... 67 9. Referências bibliográficas... 68
FIGURAS
Figura1. Representação esquemática do diâmetro das unidades alveolares 11 Figura 2. Manobra de recrutamento com CPAP 15 Figura 3. Manobra de recrutamento com PEEP progressiva 18 Figura 4. Representação esquemática das manobras de recrutamento
com CPAP e STEP 24
Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Protocolo experimental
Posicionamento do cateter esofagiano
Manobra de oclusão para posicionamento do cateter esofagiano
Método de oclusão ao final da inspiração
Representação esquemática da montagem experimental
Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para quantificação dos parâmetros morfométricos
Mecânica pulmonar: elastância estática
Mecânica pulmonar: pressões resistivas e viscoelástica
25 27 28 33 36 48 49 Figura 13. Morfometria do Parênquima pulmonar 50 Figura 14. Fotomicrografias do parênquima pulmonar 51 Figura 15. Fotomicrografias eletrônica do parênquima pulmonar 51 Figura 16. Fotomicrografias representativa do parênquima pulmonar para
quantificação de células apoptóticas
63 Figura 17. Fotomicrografias representativa do intestino, fígado e rim: para
quantificação de células apoptóticas
58 Figura 18. Expressão de RNAm para procolágeno tipo III 58
Quadros e Tabelas
Quadro 1. Critérios clínicos para definição de Lesão Pulmonar Aguda (LPA) e Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA)
2 Quadro 2. Estudos clínicos avaliando estratégias ventilatórias protetoras
em SDRA/LPA. 10
Quadro 3. Manobras de recrutamento alveolar (Estudos experimentais) 13 Quadro 4. Manobras de recrutamento alveolar (Estudos clínicos) 14 Quadro 5. Primers utilizados nas reações de RT-PCR 43 Quadro 6. Descrição das condições das reações de RT-PCR 44 Tabela 1. Valores de fluxo aéreo, volume corrente, pressões de pico e
platô nos grupos controle e lesão pulmonar aguda. 47 Tabela 2. Pressão parcial arterial de oxigênio 52 Tabela 3. Análise semi-quantitativa da microscopia eletrônica 53 Tabela 4. Análise semi-quantitativa do índice de apoptose celular 55
Abreviaturas
CPAP: continuous positive airway pressure CL: Complacência do Pulmão
CXC: Quimiocinas
CXCR2: Receptores de Quimiocinas
SMOS: Síndrome da Disfunção de Múltiplos Órgãos FC: Freqüência cardíaca
FiO2: Fração Inspirada de Oxigênio
FMOS: Falência de múltiplos órgãos e sistemas FR: Freqüência Respiratória
GAPDH : Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase IRPM: Incursões Respiratórias por Minuto
IL: Interleucina
IL-1ra: Receptores Agonistas de Interleucina-1
IRV: Ventilação Mecânica com Relação Inspiração: Expiração Invertida LPA: Lesão Pulmonar Aguda
MR: Manobra de Recrutamento MEC: Matriz Extracelular
NF-κβ: Fator de Transcrição Nuclear PII: Pneumócito do tipo II
PAF: Fator de Ativação Plaquetária
PaO2: Pressão Parcial Arterial de Oxigênio PCIII: Procolágeno tipo III
PCV: Ventilação Controlada a Pressão
PEEP: positive expiratory end pressure (pressão positiva expiratória final)
PIC: Pressão Intracraniana PIP: Pressão de Pico Inspiratório Pplat: Pressao de Platô
R/D: Recrutamento/Desrecrutamento
RT-PCR: Transcrição Reversa e Reação em Cadeia da Polimerase SDRA: Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo
STEP: Pressurização Progressiva TNF-α: Fator de Necrose Tumoral α
VILI: Lesão Pulmonar Induzida pelo Ventilador VM: Ventilação Mecânica
VT: Volume Corrente
1. Introdução
As primeiras descrições de síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) foram relatadas em 12 pacientes com falência respiratória aguda, cianose refratária à administração de oxigênio, redução da complacência pulmonar e infiltrado pulmonar bilateral observado na radiografia de tórax (Ashbaugh e cols., 1967). Desde então, várias investigações vêm sendo desenvolvidas acerca da patogênese da lesão pulmonar aguda e da terapia adequada para a SDRA, porém a mortalidade perdura alta (40% a 60 %) a despeito dos grandes avanços técnico-científicos (Suchyta e cols., 1992; Zilberberg & Epstein, 1998; Rubenfeld, 2003; Rocco & Zin, 2005, Villar e cols., 2007). A SDRA é uma síndrome de etiologia multifatorial causada por agressão direta ao epitélio alveolar ou indireta ao endotélio capilar (Bernard e cols., 1994) e se caracteriza histologicamente pela presença de dano alveolar difuso (DAD) (Mendez & Hubmayr, 2005).
Na conferência de consenso entre as Sociedades Americana e Européia de Pneumologia e Terapia Intensiva foram estabelecidos critérios clínicos, radiológicos e fisiológicos para o diagnóstico de SDRA (Bernard e cols., 1994), com base nos seguintes critérios:
1. Quadro de insuficiência respiratória de instalação aguda; 2. Infiltrado pulmonar bilateral à radiografia de tórax;
3. Relação pressão parcial arterial de oxigênio (PaO2)/fração inspirada de oxigênio (FiO2) menor ou igual do que 200, independentemente do nível de PEEP utilizado;
4. Pressão capilar pulmonar ≤18 mmHg. Os quadros mais leves, caracterizados por uma relação PaO2/FiO2 entre 200 e 300, seriam denominados de lesão pulmonar aguda (Quadro 1).
Quadro 1-Critérios clínicos para definição de lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA).
Início Oxigenação Rx tórax Pressão capilar pulmonar
LPA Agudo PaO2/FiO2 ≤300 Infiltrado bilateral ≤18 mmHg
SDRA Agudo PaO2/FiO2 ≤200 Infiltrado bilateral ≤18 mmHg
Rx: telerradiografia; PaO2; pressão parcial de oxigênio; FiO2: fração inspiratória de oxigênio; mmHg: milímetros de mercúrio
Classicamente, a SDRA é dividida em três fases: (1) fase aguda ou exsudativa, (2) fase proliferativa e (3) fase fibrótica (Meduri, 1991;1995; Udobi e cols., 2003). A fase exsudativa é caracterizada por edema intersticial e alveolar, hemorragia alveolar, deposição de fibrina, infiltração neutrofílica, lesões de células do epitélio alveolar e endotélio capilar, promovendo aumento da permeabilidade alvéolo capilar (Barbas e cols.,1996; Ware & Matthay, 2000; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005). Essas alterações são induzidas por uma interação complexa de mediadores pró e anti-inflamatórios (Meduri e cols., 1991; 1995; Ware & Matthay, 2000; Udobi e cols., 2003; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005). Durante a fase proliferativa há organização do exsudato intra-alveolar e intersticial (Fein & Calang-Colucci, 2000; Souza e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005) e proliferação dos pneumócitos do tipo II (PII) que recobrirão a membrana basal desnuda. Simultaneamente, os fibroblastos e os miofibroblastos migram através dos hiatos da membrana transformando o exsudato intra-alveolar em tecido de granulação denso e fibroso, em função da deposição de colágeno. Desta forma, ocorre o espessamento gradual do septo alveolar (Wallace & Donnelly, 2002; Mendez & Hubmay, 2005). Já na fase fibrótica, é observada deposição de colágeno
nos espaços alveolar e intersticial e desenvolvimento de microcistos (Souza e cols., 2003; Rocco e cols., 2004). Inicialmente, há deposição de colágeno tipo III, que é mais flexível e suscetível à quebra; porém, mais tardiamente, essas fibras são remodeladas, e se transformam em fibras colágenas tipo I, mais grossas e resistentes, tornando o pulmão mais rígido (Dos Santos e cols., 2006; Pelosi e cols., 2007). Deve ser ressaltado que a descrição das três fases é didática, já que a fase exudativa ocorre em paralelo com a fibroproliferativa (Rocco e cols., 2001; 2004; Dos Santos e cols., 2006).
1.1 Ventilação Mecânica
A ventilação mecânica, ao longo dos últimos 40-50 anos, tornou-se uma indispensável modalidade terapêutica na falência respiratória aguda uma vez que a mortalidade, sem esta intervenção terapêutica, se aproxima dos 100%. Os objetivos fundamentais da ventilação mecânica nos pacientes com SDRA são: 1) diminuir a concentração de oxigênio suplementar, procurando evitar a toxicidade pelo oxigênio em altas concentrações, bem como manter uma pressão arterial de oxigênio adequada; 2) evitar volutrauma, 3) minimizar a demanda metabólica da ventilação, enquanto mantém um equilíbrio gasoso adequado (Udobi e cols.,2003) e 4) promover repouso da musculatura respiratória (Slutsky & Tremblay, 1998; Chiumello e cols., 1999; Ranieri e cols.,1999; Frank & Matthay, 2003; Mendez & Hubmayr; 2005, Yilmaz e cols., 2007).
A partir de 1974, foi reconhecido que a ventilação mecânica com altas pressões de insuflação pulmonar poderia ser responsável por danos ultraestruturais pulmonares (Webb & Tierney, 1974). No entanto, nas últimas duas décadas tornou-se evidente que a ventilação mecânica pode exacerbar ou iniciar uma lesão
pulmonar aguda, denominada Lesão Pulmonar Associada à Ventilação Mecânica (LPAV) ou Lesão Pulmonar Induzida pela Ventilação Mecânica (LPIV), respectivamente (Ohta e cols., 1998; Ranieri e cols., 1999; Frank & Matthay, 2003; Pinhu e cols., 2003; Mendez & Hubmayr, 2005, Nardelli e cols., 2007).
Várias investigações com diversas espécies animais têm mostrado que a ventilação mecânica pode produzir lesão pulmonar com características funcionais e histológicas similares àquelas observada na SDRA (Tsuno e cols., 1990; Parker e cols., 1993; Slutsky & Tremblay, 1998; Whitehead & Slutsky, 2002). Pacientes com SDRA freqüentemente apresentam vários fatores de risco que, além de aumentarem a suscetibilidade dos pulmões à lesão pulmonar por ventilação mecânica, também prejudicam a capacidade do pulmão em se reparar. Nesse contexto, Tsuno e colaboradores, em 1990, observaram que quando pulmões de porcos foram ventilados por 22 h com pressão de insuflação pulmonar (PIP) de 40 cmH2O ocorria dano alveolar difuso com membrana hialina, hemorragia alveolar e infiltração neutrofílica; alterações essas similares às observadas na fase precoce da SDRA. Em outro grupo de porcos ventilados mecanicamente de modo convencional durante 03 dias, a avaliação histológica dos pulmões evidenciou colapso alveolar, proliferação de fibroblastos e de pneumócitos tipo II; achados estes compatíveis com os observados nas fases mais avançadas da SDRA (Tsuno e cols.,1990; Dreyfuss & Saumon, 1998). Além disso, a atelectasia das regiões dos pulmões ditas dependentes em relação a força da gravidade e a distribuição não uniforme do edema alveolar ocasionam redução funcional do volume pulmonar (em média 25% do normal) e predispõem o pulmão a um estresse induzido pela hiperdistensão alveolar (estresse tensil) e pelo colapso e abertura cíclicos das unidades alveolares [estresse de cisalhamento (shear stress)] (Dos Santos & Slutsky, 2006). Portanto,
essa distribuição heterogênea da ventilação pulmonar na SDRA pode ser prejudicial e predispor a LPAV/LPIV (Slutsky & Tremblay, 1998; Pugin e cols., 1999; Ranieri e cols., 1999; Gattinoni e cols., 2001; Frank & Matthay, 2003).
1.2 Barotrauma
Durante anos, LPIV foi sinônimo de barotrauma, ou seja, uma lesão induzida pela ventilação mecânica com altas pressões. No entanto, barotrauma se caracteriza apenas por fuga de ar causada por ruptura da parede dos espaços aéreos, com manifestações radiológicas que incluem pneumotórax, pneumomediastino e enfisema cirúrgico. Recentemente, a possibilidade da ocorrência de alterações morfológicas e fisiológicas mais sutis foi reconhecida e os principais determinantes da LPIV foram reconhecidos (Dreyfuss e cols., 1998).
Diversos mecanismos parecem ser responsáveis pela LPIV, incluindo rupturas do epitélio e endotélio alveolares (Dreyfuss e cols., 1998), hiperdistensão alveolar (Dreyfuss e cols., 1998), colapso e reabertura cíclicos dos espaços aéreos (Muscedere e cols., 1994), alterações no surfactante endógeno (John e cols., 1982), processo inflamatório com infiltração neutrofílica (Kawano e cols., 1987), aumento dos níveis de citocinas (Parker e cols., 1993; Tremblay e cols., 1997; Von Bethmann, 1998; Vlahakis e cols., 1999), alterações hemodinâmicas (Parker e cols.,1993) e aumento da expressão de RNAm para proteínas da matriz extracelular (Berg e cols., 1997; Garcia e cols., 2004; Farias e cols., 2005).
O epitélio pulmonar forma uma barreira ao transporte de proteínas entre o interstício pulmonar e os espaços aéreos, porém rupturas epiteliais e edema alveolar podem ocorrer na ventilação mecânica com alta PIP. Outro parâmetro importante quanto à formação do edema alveolar é o tempo de ventilação mecânica associado
ao porte do animal estudado. Enquanto em ratos, a ventilação mecânica com alta PIP por mais de dois minutos é suficiente para induzir formação de edema pulmonar, em animais de maior porte, como coelhos e ovelhas, o tempo necessário para tal alteração é bem maior. Isso tem fundamental importância quando se extrapola os achados dos estudos com animais para os humanos (John e cols., 1980; Kolobow e cols., 1987; Dreyfuss e cols., 1992; Whitehead & Slutsky, 2002).
Webb e Tierney em 1974 observaram que pulmões ventilados com PIP de 14 cmH2O durante 1 hora não apresentavam alterações histológicas, enquanto que aqueles ventilados com 30 cmH2O desenvolviam edema perivascular. Reforçando, os animais ventilados com PIP de 45 cmH2O sem Pressão Positiva ao Final da Expiração (PEEP de positive end expiratory pressure) evoluíam com hipóxia grave, edema perivascular e alveolar e morriam antes do término dos experimentos. (Webb & Tierney, 1974). Ademais, Parker e colaboradores (1984) mostraram aumento imediato do coeficiente de filtração capilar em pulmões isolados de cachorros ventilados com PIP acima de 30 cmH2O. O edema pulmonar foi caracteristicamente protéico, sugerindo, pelo menos em parte, que havia aumento da permeabilidade da barreira alvéolo-capilar (Whitehead & Slutsky, 2002).
Em contraste com a evidência do aumento da permeabilidade da membrana alvéolo-capilar, pouco se sabe sobre a contribuição do aumento da pressão hidrostática na formação do edema pulmonar durante a ventilação mecânica. Estudos em gambás mostraram que a ventilação com altos volumes correntes (VC ou VT, de tidal volume) causava discreto aumento na pressão microvascular pulmonar. No entanto, as diferenças regionais de perfusão pulmonar e atelectasias podem gerar altas forças de filtração em algumas áreas. Logo, em pulmões lesados,
pequenos incrementos na pressão transmural podem acarretar formação de edema pulmonar (Whitehead & Slutsky, 2002).
1.3 Volutrauma
As evidências experimentais subseqüentes indicaram que o grau de insuflação pulmonar seria também um fator relacionado a LPIV (Dreyfuss e cols.,1988; Carlton e cols.,1990). O fato dos tocadores de trompete apresentarem pressões nas vias aéreas de até 150 cmH2O sem desenvolverem barotrauma (Bouhuys, 1969), sugeriu que a pressão por si só provavelmente não devia ser um fator determinante de LPIV. A contribuição relativa da pressão nas vias aéreas e do volume corrente na lesão pulmonar, foi avaliada primeiramente em ratos sadios ventilados com limitação do movimento tóraco-abdominal por uma “faixa elástica”. Altas pressões nas vias aéreas (PIP = 45 cmH2O), com volume corrente baixo não produziram lesão pulmonar. No entanto, animais ventilados sem restrições torácicas ou abdominais, com alto volume corrente, atingiram altas pressões positivas desenvolvendo lesão pulmonar grave. Portanto, o termo volutrauma nessa situação seria mais adequado do que barotrauma (Dreyfuss e cols., 1988; Hernandez e cols., 1989; Carlton e cols., 1990; Whitehead & Slutsky, 2002).
Em pulmões com complacência normal, a ventilação mecânica com alta PIP gera grandes variações de volume pulmonar. Estudos revelaram que em pulmões normais e principalmente naqueles com baixa complacência pulmonar, a ventilação com altos volumes correntes pode acarretar hiperdistensão dos espaços aéreos ventilados, acarretando LPIV (Dreyfuss e cols., 1988). Esses achados foram confirmados por Hernandez e colaboradores que estudaram o efeito da ventilação com três pressões de pico diferentes (15, 30 e 45 cmH2O) com e sem restrição do movimento torácico. Eles observaram aumento de 31% no coeficiente de filtração
capilar após ventilação com 30 cmH2O e de 430% após ventilação com 45 cmH2O sem restrição volumétrica. A restrição volumétrica preveniu este aumento no coeficiente de filtração, mesmo na maior PIP (Hernandez e cols., 1989). Esses trabalhos sugeriram que, mesmo em pulmões normais, o VT alto, e não a PIP alta, é fundamental na fisiopatologia do edema induzido pela ventilação mecânica.
O grau de distensão alveolar é determinado pelo gradiente de pressão através da parede alveolar, pela pressão transpulmonar, correspondente à diferença entre a pressão de retração elástica pulmonar (estimada clinicamente pela pressão de platô) e pela pressão pleural. A pressão transpulmonar é aplicada à pleura visceral e deve ser transmitida para todas as regiões pulmonares, através do esqueleto fibroso pulmonar, que consiste em dois componentes: as fibras axiais, ancoradas ao hilo, dispostas ao longo das vias aéreas de maior diâmetro até os ductos alveolares; e o sistema de fibras periféricas, ancoradas à pleura visceral e dispostas centripetamente até os ácinos. Esses dois sistemas são conectados nos alvéolos através dos septos alveolares.
Numa estrutura monodimensional, o estresse pode ser definido como a força por unidade de área que se desenvolve em reação a uma força aplicada externamente de mesma intensidade, mas com sentido oposto. Essa força interna pode ser delimitada por três componentes, um plano (estresse normal) e dois tangenciais (estresse de cisalhamento). A deformação de uma estrutura, em decorrência de uma força externa aplicada sobre a mesma, é denominada de strain, que é a relação entre o comprimento final da estrutura após a deformação e o seu comprimento inicial. Durante a ventilação mecânica, o estresse e o strain são parâmetros em constante variação, determinados pela pressão transpulmonar e pelo VT (Gattinoni e cols., 2003).
1.4 Estratégia ventilatória protetora
Recente consenso enfatiza a importância de limitar a pressão de platô e controlar os fatores responsáveis pelo aumento da distensão alveolar para determinada pressão alveolar, como por exemplo, o volume corrente (Whitehead & Slutsky, 2002). Um determinado volume corrente acarreta diferentes pressões de platô, dependendo da complacência pulmonar (CL). Desse modo, a pressão transpulmonar associa-se tanto ao VT normalizado pelo peso corporal quanto à pressão de platô, cujo limite seguro corresponde a 32 cmH2O (Gattinoni e cols., 2003). Logo, as estratégias ventilatórias protetoras na SDRA ressaltam a importância de se ventilar os pacientes com baixos volumes correntes (Amato e cols., 1998; Brochard e cols., 1998; Stewart e cols., 1998; Brower e cols.,1999, The
Acute Respiratory Distress Syndrome Network, 2000; Schultz e cols., 2007) (Quadro
Quadro 2 – Estudos clínicos avaliando estratégias ventilatórias protetoras na SDRA/LPA
Ventilação n PaO2/FiO2 (mL/kg) VT (cmHPEEP 2O) PIP (cmH2O) Mortalidade (%) Amato Convencional Protetor 24 29 134±67 112±51 12 <6 8,7±0,4 16,4±0,4 36,8±0,9 30,1±0,7 72 38 Stewart Convencional Protetor 60 60 145±72 123±47 10,7±1,4 7,0±0,7 7,2±3,3 11,6±3,0 26,8±6,7 22,3±5,4 47 50 Brochard Convencional Protetor 58 58 155±68 144±61 10,3±2,3 7,1±1,3 10,7±2,3 13,6±2,9 31,7±6,6 25,7±5,0 38 47 Brower Convencional Protetor 26 26 150±69 129±51 10,2±0,1 24,9±0,8 30,6±0,8 11,6±3,0 30,6±0,8 24,9±0,8 46 50 ARDSNET Convencional Protetor 429 432 134±58 138±64 11,8±0,8 6,2±0,9 8,6±3,6 13±3,6 35±8 40±10 40 31
PIP: pressão de pico inspiratória. Adaptado de Kopp, 2003.
Como observado no Quadro 2, os cinco estudos buscaram evitar a hiperdistensão das regiões pulmonares não dependentes, nos grupos das respectivas estratégias protetoras, através da limitação das pressões inspiratórias. Desta forma, as estratégias ventilatórias empregadas nos cinco estudos minimizaram o estiramento excessivo sofrido por essas regiões pulmonares. A limitação das pressões inspiratórias protegeu o pulmão do estiramento excessivo (Figura 1).
Figura 1 - Representação esquemática do diametro das unidades alveolares. Pouco Aerada Inspiração Ventilada Expiração Colapso alveolar
(A) Note a presença de hiperdistensão ao final da inspiração, (B) Presença de unidades aeradas e não aeradas, (C) Região alvéolo-dependente, colapsada que sofre repetida abertura e fechamento cíclicos, induzindo dano tecidual. Adaptado de Lapinsky & Mehta (2005).
1.5 Manobras de recrutamento alveolar
O recrutamento é um processo fisiológico dinâmico que está relacionado à reabertura das unidades alveolares após redução do volume nos alvéolos. Que podem ocorrer nas seguintes situações: modificações na PEEP, no volume corrente e na FiO2, repetidas aspirações traqueais bem, como sedação e paralisia dos músculos respiratórios (Maggiore e cols., 2003).
O uso de manobras de recrutamento na SDRA/LPA é controverso para alguns autores, a manobra de recrutamento não deve ser realizada já que pode acarretar hiperdistensão nas regiões pulmonares não-dependentes, devendo deixar o pulmão “em repouso” (Ware e Matthay, 2000; Gattinoni e cols., 2006). Entretanto, para outros, o recrutamento de unidades alveolares colapsadas, acarreta uma distribuição mais homogênea da pressão aplicada na via aérea, evitando o estresse induzido pelo colapso e reabertura cíclicos dos ductos, alvéolos e vias aéreas distais.
(Lachman e cols.,1982; Kacmareck e cols.,2001; Borges e cols., 2006). Logo, não basta deixar o pulmão “repouso”, é necessário “recrutar pulmão e mantê-lo aberto” (Lachman; 2002)
1.5.1 - Manobras de recrutamento alveolar (estudos experimentais)
Estudos experimentais têm demonstrado que as manobras de recrutamento são capazes aumentar a quantidade tecido recrutado ao final de expiração, favorecendo a ventilação pulmonar total, reduzindo por sua vez, a possibilidade de lesão pulmonar induzida pela da ventilação mecânica.
Bond e colaboradores (1994) observaram melhora na complacência pulmonar e oxigenação durante ventilação com alta freqüência após MRs. Van der Kloot e cols estudaram os efeitos da MRs na oxigenação e volume pulmonar em três modelos de LPA: lavagem com salina, acido oléico e pneumonia. A melhora da oxigenação foi observada após aplicação das MRs somente no grupo com depleção de surfactante. Se por um lado as MRs melhoram a mecânica pulmonar e a troca gasosa, por outro lado podem induzir ou intensificar o estresse pulmonar (Tusman e cols., 1999;2005; Farias e cols., 2005; Suki e cols., 2005). Nesse contexto, os autores constataram aumento da expressão de RNAm para pró-colágeno tipo III após manobra de recrutamento com CPAP 40 cmH2O por 40 segundos em ratos com lesão pulmonar aguda ventilados por 1 hora com ZEEP. Entretanto, a adição da PEEP de 5 cmH2O seguida da MR minimizou o estresse alveolar, provavelmente por reduzir o estresse de cisalhamento (Farias e cols., 2005).
Quadro 3 – Manobras de recrutamento alveolar
Métodos Modelos de LPA Referências
CPAP= 30-60 cmH2O
por 15-60 s
Lavagem com salina, ácido oléico,
pneumonia e paraquat em animais.
Bond e cols., 1994;
Rimensberger e cols., 1999; Van der Kloot e cols.,2000; Cakar e cols., 2000; Farias e cols.,2005 Modo pressão controlada: PIP= 60 cmH2O PEEP= 40 cmH2O por 2 min Lavagem salina em
animais Fujino e cols., 2001; Takeuchi e cols., 2002
Modo volume controlado: FR= 20 irpm
VT= de 20 ml/kg
Animais saudáveis
anestesiados Lu e cols., 2002
PIP: pressão de pico inspiratória; VT: volume corrente; FR: freqüência respiratória; CPAP: pressão positiva contiuna na via aérea; PEEP: pressão positiva ao final da expiração.
Embora ainda não exista um consenso de como, quando e quem recrutar, evidências recentes ainda mostram benefícios em se utilizar as MR na LPA/SDRA. (Lachman e cols.,2002; Amato e cols., 1998; Pelosi e cols., 1999; Kacmareck e cols.,2001; Borges e cols., 2006; Gattinoni 2006; Constantin e cols., 2007; Talmor e cols., 2007)
1.5.2 – Manobra de recrutamento alveolar (estudos clínicos)
Várias manobras de recrutamento vêm sendo usadas em humanos (Quadro 3).
Quadro 4 – Manobras de recrutamento alveolar
Técnica Descrição Autor
Alta pressão sustentada Modo CPAP CPAP= 35-50 cmH2O Tempo= 20-40 segundos Amato e cols., 1998 Lapinsky e cols.,2005 “Suspiros” intermitentes
3 ciclos de “suspiros” por minuto Pplat= 45 cmH2O
Tempo=1 hora Pelosi e cols., 1999
Elevação da pressão inspiratória
Modo pressão controlada/PEEP Manter PEEP e
Aumentar PIP = 40-60 cmH2O Tempo= 30-120 segundos Bein e cols.,2002 Maggiori e cols., 2003 Gattinoni e cols., 2006 Elevação intermitente da PEEP
PEEP a cada 2 minutos
Etapas: 25, 30, 35, 40, 45 cmH2O. Entre cada etapa ventilação com PEEP= 25 cmH2O por 1 minuto ΔPressão=15cmH2O Borges e cols., 2006 Elevação intermitente da PEEP e pressão de pico inspiratória
Fase aumento progressivo = 20 min. PIP/PEEP=10/0,15/5, 20/10, 25/15 e 45/20
Fase redução progressiva = 20 min. PIP/PEEP=25/15, 20/10, 15/5 e 10/0
Maisch e cols., 2008
PIP: pressão de pico inspiratória; ΔPressão (Pplat – PEEP); CPAP: pressão positiva contiuna na via aérea; PEEP: pressão positiva ao final da expiração; Pplat: pressão de platô.
Amato e colaboradores demonstraram que a estratégia ventilatória protetora associada à manobra de recrutamento alveolar com pressão positiva contínua nas vias aéreas CPAP de 35 – 40 cmH2O (Figura 2) por 40 segundos com uso de alto PEEP e volume corrente de 6 mL/kg reduziu a mortalidade (Amato e cols., 1998).
Talmor e cols., em seu estudo, submeteram 26 pacientes com SDRA a MR (CPAP 40 cmH2O por 30 segundos) e observaram melhora na PaO2/FiO2 e nenhuma mudança significativa nos níveis de citocinas (interleucina [IL] - 1, 6,
IL-8, IL-10, TNF-α) medidos em 5 e 60 minutos após a RM em comparação aos níveis da linha de base (Talmor e cols., 2007).
Figura 2 – Manobra de recrutamento com CPAP.
Pressão (cmH2O) 40 30 20 10 5 Tempo (s) 0 10 20 30 40 50 60
Representação esquemática da manobra de recrutamento com pressão positiva contínua na via aérea (CPAP) 40 cmH2O por 40 segundos.
Pelosi e colaboradores observaram que suspiros intermitentes (três suspiros consecutivos por minuto com pressão platô em 45 cmH2O) acarretavam aumento da PaO2/FiO2; no entanto esses efeitos retornaram ao basal 30 minutos após a interrupção do método (Pelosi e cols., 1999).
Maggiore e colaboradores estudaram os efeitos protetores da MR com aumento da Pressão Inspiratória para 40 cmH2O após desconecção do tubo endotraqueal seguido de aspiração traqueal em pacientes com LPA. Eles observaram que o derecrutamento induzido pela aspiração pode ser evitado após a MR (Maggiore e cols., 2003).
Bein e colaboradores analisaram as consequências da MR na medida da com Pressão Intracraniana (PIC).Para tal aumentaram progressivamente a pressão pico até atingir 60 cmH2O por 30 s e constataram uma melhora na oxigenação arterial, porém um aumento significativo da PIC, com deterioração da hemodinâmica cerebral, não recomendando a técnica em pacientes com lesão craniana (Bein e cols., 2002).
Recentemente, surgiram novas formas de manobras de recrutamento, sendo que a maioria dos centros tem dado preferência ao uso de técnicas com pressurizações progressivas, quer por aumento da pressão inspiratória quer por aumento da PEEP (Tusman e cols., 1999; Tusman e col., 2004; Borges e cols.,2006; Sprung e cols., 2006).
Whalen e colaboradores utilizaram MR com aumento progressivo da PEEP (PEEP=10 cmH2O por 3 ciclos respiratórios,15 cmH2O -3 ciclos respiratórios e 20 cmH2O -10 ciclos respiratórios) totalizando 2 minutos de MR, durante cirurgia laparoscópica bariátrica e constataram melhora da oxigenação e da complacência pulmonar, porém após 30 minutos de extubação esses efeitos benéficos não se mantiveram (Whalen e cols., 2006).
Borges e colaboradores descreveram a manobra de recrutamento com pressurização progressiva em pacientes com SDRA, elevando-se progressivamente a PEEP (25, 30, 35, 40 e 45 cmH2O) até que se alcançasse uma pressão de platô em torno de 60 cmH2O (Figura 3). Para tal, inicialmente, os pacientes foram ventilados com PEEP de 10 cmH2O, volume corrente de 6 mL/kg e, a seguir, era iniciada a manobra de recrutamento progressiva até recrutamento total (definido por PaO2 mais PaCO2 ≥ 400 com FiO2 100%). Os níveis de PaO2 + PaCO2 aumentaram de 179 mmHg para 487 mmHg, sendo que, após 6 horas, os níveis de PaO2 + PCO2
se mantiveram em 521 mmHg (Borges e cols., 2002; De Matos e cols., 2004; Barbas e cols., 2005; Borges e cols., 2006), entretanto não foram constatadas queda na taxa de mortalidade destes pacientes.
Gattionini e colaboradores (2006) realizaram estudo prospectivo em pacientes com SDRA submetidos à MR (insuflacão sustentada dos pulmões com pressões elevadas por 2 minutos, PEEP de 5 cmH2O, pressão inspiratória de 45 cmH2O, FR 10 irpm e tempo inspiratório de 3 segundos) e correlacionaram o percentual de pulmão recrutável, avaliado através da análise da tomografia computadorizada com parâmetros fisiológicos e clínicos. Os autores concluíram que a percentagem de unidades alveolares potenciamente recrutáveis variou bastante em função da população estudada, mostrando que dependendo da característica da lesão, o pulmão pode ou não ser recrutado. Porém, esse estudo apresentou uma importante limitação, a aplicação da MR na fase tardia da lesão. Já Borges e colaboradores propuseram uma MR com maior tempo de duração, atingindo Pplatô de 60 cmH2O, sendo a MR aplicada na fase precoce da LPA/SDRA. Essa MR propiciou um efeito benéfico em 90% dos pacientes no que concerne a melhora da troca gasosa (Borges e cols., 2006). Entretanto, perdura controverso o tipo de manobra de recrutamento a ser empregado, assim como o momento em que ela deverá ser aplicada.
Figura 3 – Manobra de Recrutamento Alveolar com PEEP Progressiva
ΔP
P Plat= pressão de platô; PEEP= pressão expiratória positiva final; ΔPressão (Pplat – PEEP) fixo em 15 cmH2O.
Constantin e colaboradores avaliaram o impacto da manobra de recrutamento (PEEP de 10 cmH2O sobre o ponto de inflexão inferior da curva pressão x volume por um período de 15 minutos e Pressão de Pico limitada 50 cmH2O) em pacientes com SDRA na depuração do líquido alveolar. Os autores constataram uma melhora na oxigenação arterial e na depuração do líquido alveolar resultando na resolução do edema (Constantin e cols., 2007).
Maisch e colaboradores em 2008 submeteram 20 pacientes (pulmões saudáveis) a MR com steps de: PiP/PEEP- 10/0,15/5, 20/10, 25/15 e 45/20 por um período de 20 minutos e uma fase redução progressiva com duração de 20 minutos da PiP/PEEP –25/15,20/10,15/5 e 10/0 submetidos à cirurgia maxilofacial e constataram maior complacência e oxigenação e menor espaço morto quando a PEEP adicionada foi em torno de 10 cmH2O (em pulmões saudáveis).
Embora ainda não exista um consenso de como recrutar, evidências recentes ainda mostram uma grande variedade de MRs com os seus prós e contras na LPA/SDRA. (Lachman e cols.,1982; Amato e cols., 1998; Pelosi e cols., 1999; Kacmareck e cols.,2001; Borges e cols., 2006; Gattinoni 2006; Constantin e cols., 2007; Talmor e cols., 2007).
2.0 – Justificativa
Desde a primeira descrição da SDRA, em 1967, e do primeiro relato do tratamento desta síndrome com ventilação mecânica, em 1971, a única intervenção terapêutica que demonstrou redução na taxa de mortalidade na LPA/SDRA foi a estratégia ventilatória protetora, que limita a pressão nas vias aéreas e o volume corrente oferecido aos pulmões, prevenindo o dano alveolar difuso (Amato e cols., 1998; The Acute Respiratory Distress Syndrome Network, 2000). No entanto, apesar da redução do volume corrente diminuir a mortalidade, por outro lado, o conseqüente colapso alveolar acarreta estresse de cisalhamento, induzindo a lesão pulmonar associada à ventilação mecânica (LPAV) (Muscedere e cols.,1994).Com o intuito de minimizar o risco de LPAV, diferentes técnicas de recrutamento alveolar vêm sendo utilizadas (CPAP, suspiro, PEEP progressivo). Entretanto, essas técnicas têm mostrado efeito benéfico transitório (Grasso e cols., 2002), hiperdistensão alveolar (Borges e cols., 2006), aumento do estresse pulmonar e depressão circulatória (Terragni e cols., 2007). Em função disso, a avaliação de novas técnicas de recrutamento alveolar que proporcionem benefícios duradouros e que não estejam associados a elevado estresse celular tem grande relevância.
3.0 Objetivos
3.1 Objetivo geral
Analisar as conseqüências morfo-funcionais e moleculares da manobra de recrutamento alveolar através da elevação progressiva da pressão inspiratória em comparação à manobra convencional de recrutamento alveolar com a utilização de CPAP em modelo experimental de lesão pulmonar aguda.
3.2 Objetivos Específicos
1. Comparar os parâmetros mecânicos, de histologia pulmonar (microscopias óptica e eletrônica) e de oxigenação.
2. Descrever a expressão de células apoptóticas no pulmão, fígado, rim e intestino.
3. Quantificar a expressão de RNAm para pró-colágeno tipo III no tecido pulmonar.
4.0 Materiais e Métodos 4.1. Metodologia de estudo
Estudo experimental laboratorial utilizando ratos Wistar, pesando de 250-300 gramas.
4.2. Amostra de estudo
Ratos Wistar machos (n=36) provenientes do biotério do Laboratório de Investigação Pulmonar do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro foram estudados e ditribuídos nos seguintes grupos experimentais:
Grupo Controle (C) (n =6)
Os animais foram ventilados com VT de 6 mL/kg, freqüência respiratória de 80 irpm e relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio de 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai).
Grupo C-CPAP (n =6)
Os animais foram recrutados com CPAP 40 cmH2O por 40 segundos no Ventilador Inter 3 (Intermed, São Paulo, Brasil) e ventilados com VT 6 mL/kg, freqüência respiratória de 80 irpm, relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio de 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai) , (Figura 4).
Grupo C-STEP (n =6)
Os animais foram recrutados com aumento da pressão de pico inspiratória (PiP). Inicialmente, a pressão inspiratória foi ajustada em 25 cmH2O e a PEEP fixada em 15 cmH2O, permanecendo neste valor por quatro minutos. A seguir, a PiP foi aumentada em 5 cmH2O (PiP=30 cmH2O), mantendo-se nesse nível por dois minutos e retornando para 25 cmH2O, onde foi mantida por mais 2 minutos. A PiP foi elevada progressivamente até 45 cmH2O no repirador Inter 3, (Intermed, São Paulo, Brasil). Posteriormente, os ratos foram ventilados com VT de 6 mL/kg, a freqüência respiratória de 80 irpm e relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio de 0,21 e de PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai), (Figura 4).
Grupo Lesão Pulmonar Aguda (LPA) (n =6)
Para induzir LPA, injetou-se paraquat intraperitonealmente (15 mg/kg). Após 24 horas, os animais foram sedados, anestesiados e ventilados com VT 6 mL/kg, a freqüência respiratória de 80 irpm, relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai).
Grupo LPA-CPAP (n =6)
Os animais com LPA induzida por paraquat (15 mg/kg i.p.) foram recrutados com CPAP 40 cmH2O por 40 segundos no Respirador Inter 3 (Intermed, São Paulo, Brasil) e ventilados com VT 6 mL/kg, freqüência respiratória de 80 irpm, relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio de 0,21 e de PEEP 5 cmH2O por 1 hora no respirador para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai), (Figura 4).
Grupo LPA-STEP (n = 6)
Os animais com LPA induzida por paraquat (15 mg/kg i.p.) foram recrutados com aumento da pressão de pico inspiratória (PiP). Inicialmente a pressão inspiratória foi ajustada em 25 cmH2O e a PEEP fixada em 15 cmH2O, permanecendo neste valor por quatro minutos. A seguir, a PiP foi aumentada em 5 cmH2O (PiP= 30 cmH2O), mantendo-se nesse nível por dois minutos e retornando para 25 cmH2O, onde foi mantida por mais 2 minutos. A PiP foi elevada progressivamente até 45 cmH2O no respirador Inter 3, (Intermed, São Paulo, Brasil). Posteriormente, os ratos foram ventilados com VT de 6 mL/kg, a freqüência respiratória de 80 irpm e relação inspiração-expiração de 1:2, fração inspirada de oxigênio 0,21 e PEEP 5 cmH2O por 1 hora no no respirador para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai), (Figura 4). Foi acrescentado um grupo controle e LPA não ventilado para análise de microscopia óptica.
Figura 4 – Representação esquemática das manobras de recrutamento com CPAP
e por “STEP”.
CPAP: pressão positiva contínua na via áerea; STEP: recrutamento progressivo; PIP: pressão pico inspiratória; PEEP: pressão positiva ao final da expiração.
4.3. Protocolo do Estudo
Figura 5 – Protocolo Experimental
Protocolo Anestesiados, paralisados e ventilados mecanicamente VT = 6 mL/kg, V’ = 6 mL/s, FR = 80 irpm, I:E = 1:2, FiO2 = 0,21 PEEP = 5
Análise dos gases
5 min Mecânica (Basal) Randomizacão Histologia pulmonar. apoptose de células epiteliais do pulmão, rim, fígado, Intestino. 5 min 1 h Mecânica (Posterior) Análise dos gases
Os ratos foram sedados com diazepam (5 mg i.p.), anestesiados com tiopental sódico (20 mg/kg i.p.). Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa cirúrgica, em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados com esparadrapo. Os membros superiores foram mantidos estendidos a 90 graus em relação ao corpo e os membros inferiores abduzidos em diagonal. Após o posicionamento cirúrgico, foi realizada uma pequena incisão longitudinal medial de aproximadamente 2 cm de extensão na face ventral do pescoço dos animais seguida de divulsão dos tecidos até a exposição completa do terço inicial da traquéia. A seguir, pela traqueostomia, uma cânula de polietileno (PE 240, Intramedic®, Clay-Adams Inc., Nova York, EUA) com 1,5 mm diâmetro interno (DI) e 7,5 cm de comprimento foi introduzida na traquéia, sendo esta fixada na porção proximal por meio de fios de algodão.
A cânula traqueal do animal foi conectada a um pneumotacógrafo para pequenos animais, como descrito por Mortola e Noworaj (1983), para medida de fluxo aéreo (V’). O pneumotacógrafo utilizado consiste de uma cânula metálica com duas saídas laterais com as seguintes características: diâmetro interno = 1,5 mm, comprimento = 4,2 cm e distância entre as saídas laterais = 2,1 cm. O gradiente de pressão através do pneumotacógrafo foi determinado utilizando-se um transdutor diferencial de pressão (UT-PDP, SCIREQ, Montreal, Canadá). Essa forma de medir fluxo aéreo, além de bem simples, é adequada, visto que, em animais de pequeno porte, os fluxos baixos e as dimensões traqueais reduzidas são responsáveis pela existência de fluxo laminar e, portanto, o fluxo aéreo pode ser medido de acordo com a lei de Poiseuille, onde a diferença de pressão entre as saídas laterais do pneumotacógrafo é proporcional ao V’. Através de outra saída lateral, a via aérea foi a um transdutor diferencial de pressão (UT-PDP, SCIREQ, Montreal, Canada) para
medida da pressão traqueal (Ptr). A inexistência de mudanças abruptas no diâmetro do circuito (da traquéia até a extremidade da tubulação) evitou erros de medida de resistência ao fluxo (Loring e cols. 1979; Chang & Mortola, 1981). O volume (VT) mobilizado foi obtido por integração digital do sinal de fluxo.
No esôfago dos animais foi introduzido um cateter de polietileno (PE 240) de 20 cm de comprimento e 1,7 mm de diâmetro interno, com pequenos orifícios em sua extremidade distal, preenchido com água deionizada. O cateter foi introduzido até o estômago e retrocedido lentamente até atingir o terço inferior do esôfago (Figura 6).
Figure 6 - Posicionamento do cateter esofagiano.
Esôfago Posição do Cateter
1/3 Inferior Coração Mediastino
Sua extremidade proximal foi então conectada a um transdutor diferencial de pressão (UT-PDP, SCIREQ, Montreal, Canada) para medida da pressão esofagiana (Pes), já que as variações da pressão no terço inferior do esôfago refletem as variações da pressão intrapleural (Ppl) e, portanto, da pressão da parede torácica (Pw) (Millic-Emili e cols., 1964a, 1964b). A medida da pressão esofagiana foi realizada para decompor o sistema respiratório em pulmão e parede torácica. O
correto posicionamento do cateter esofagiano foi determinado pela “manobra de oclusão” conforme proposto por Baydur e colaboradores, em 1982 (Baydur e cols., 1982). A “manobra de oclusão” consiste na oclusão das vias aéreas ao término de uma expiração espontânea, as quais são mantidas fechadas por um ciclo respiratório, registrando-se e comparando-se as variações das pressões traqueal e esofagiana durante o esforço inspiratório subseqüente. Nessas condições, a diferença entre as variações da pressão traqueal (ΔPtr) e da pressão esofagiana (ΔPes) não deve exceder 5%. O cateter esofagiano foi lavado periodicamente com água deionizada, para evitar que a presença de secreções na luz do cateter (Figura 7).
Figura 7 – Manbra de oclusão para posicionamento do cateter esofagiano.
Traçados de volume (V), pressão transpulmonar (PL), pressão esofagiana (Pes) e pressão traqueal (Ptr) durante a “Manobra de oclusão”. A variação de Pes não deve ser superior a 5% da Ptr.
A calibração dos transdutores de pressão foi realizada com o auxílio de um tubo em "U" contendo água destilada. A aferição foi realizada antes de cada experimento para assegurar a confiabilidade do registro.
O espaço morto da montagem foi de 0,2 mL. Para computá-lo, pesou-se o conjunto de equipamentos utilizados entre a via aérea do animal e o ventilador
(cânula traqueal, tubo em “T”, pneumotacógrafo e conexões de borracha) vazio e cheio de água. A diferença de peso permitiu saber o volume de água e, portanto, o volume do espaço morto do sistema. Para fechar as saídas do conjunto e enchê-lo de água foi usada massa de modelar, que foi também pesada, junto com os demais equipamentos.
4.5 Estudo da mecânica respiratória
Para este estudo, os animais tiveram sua musculatura paralisada após a administração de brometo de pancurônio (2 mg/kg i.v.) e a ventilação artificial foi instituída por um ventilador mecânico para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai) acoplado à outra extremidade do pneumotacógrafo. Os animais foram ventilados com volume corrente de 6 ml/kg, fluxo aéreo de 6 mL/s e freqüência respiratória de 80 irpm.
A mecânica respiratória foi avaliada pelo método de oclusão ao final da inspiração após insuflação com fluxo constante (Bates e cols., 1985, 1988, 1989; Kochi e cols., 1988a, 1988b), que permite analisar separadamente os componentes elástico, viscoso e viscoelástico e/ou inomogêneo do sistema respiratório, pulmão e parede torácica (Figura 8).
Figura 8 – Método de oclusão ao final da inspiração
Representação esquemática dos traçados de fluxo, volume, pressão traqueal e pressão esofagiana em função do tempo, obtidos a partir da oclusão da via aérea ao final da inspiração. Pmáx = pressão máxima alcançada; Pi = ponto de inflexão; Pel = pressão de retração elástica e VT = volume corrente.
Após a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, ocorre queda súbita da pressão traqueal (Ptr) até um ponto (ponto de inflexão, Pi) a partir do qual o decaimento da pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua porção terminal. Esta fase de platô corresponde à pressão de retração elástica do sistema respiratório (Pel) (Figura 8). A diferença de pressão (ΔP1) que caracteriza a queda rápida inicial, representada pela diferença entre a pressão máxima inicial (Pmáx) ou pressão de pico (Ppico) e o ponto a partir do qual a queda se torna mais lenta (Pi), corresponde ao componente viscoso do sistema respiratório, ou seja, reflete a pressão necessária para vencer a combinação das resistências da parede torácica e pulmões em animais normais (Bates e cols., 1988, 1989; Kochi e cols., 1988a, 1988b). A segunda variação de pressão (ΔP2), representada pela queda lenta, do Pi ao platô [pressão de retração elástica (Pel) ou pressão de platô (Pplat)], reflete a pressão dissipada para vencer o componente viscoelástico (“stress relaxation”) e/ou inomogêneo (“pendelluft”) do tecido pulmonar e parede torácica (Bates e cols., 1988; D’Angelo e cols., 1989 e Kochi e cols., 1988a, 1988b). As
pressões transpulmonares (ΔP1,L; ΔP2,L e Pel,L) foram calculadas a partir da diferença entre os valores da parede torácica e do sistema respiratório. A soma de ΔP1 e ΔP2 fornece a variação total de pressão (ΔPtot,L). As elastâncias estáticas do sistema respiratório, pulmões e parede torácica (Est,L) foi calculada dividindo-se Pel,L , pelo volume corrente (VT).
Para a realização da oclusão, o aparelho utiliza uma válvula com tempo de fechamento definido (10 ms). Como este fechamento não é absolutamente instantâneo, o volume nunca cai a zero imediatamente após a oclusão, propiciando, assim, a existência de um pequeno fluxo. Este fluxo foi responsável pelo aumento do volume pulmonar e, conseqüentemente, de Pi e Pel. Por isso, foi feita correção de acordo com Kochi e colaboradores (Kocki e cols., 1988a).
As seguintes fórmulas foram utilizadas na análise da mecânica respiratória: ΔP1 = Pmax-Pi
ΔP2= Pi-Pel ΔPtot=ΔP1+ΔP2
Est = Pel/V
onde:
ΔP1 = variação de pressão relativa ao componente viscoso
ΔP2 = variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo ΔPtot = variação de pressão total; Pmáx = pressão máxima atingida.
Pi = pressão no ponto de inflexão; Pel = pressão de retração elástica. Est = elastância estática; VT = volume corrente;
Foram registrados 15 ciclos pelo método de oclusão ao final da inspiração (Bates e cols., 1985, 1988, 1989; Kochi e cols., 1988a, 1988b), em cada animal. As respostas de freqüências dos sistemas de registro da Ptr e Pes foram estáveis até 20 Hz. Em seguida, os sinais foram condicionados no SCIREQ com freqüência de corte estabelecida de 100 Hz, convertidos os sinais digitais por um conversor
analógico-digital de 12-bitz (DT-2801A, Data Translation, Malboro, EUA), e amostrados a uma freqüência de 200 Hz. Os sinais foram armazenados em microcomputador, utilizando-se o software LABDAT (RHT-InfoData, Montreal, Canadá) e gravados em disquetes magnéticos para posterior análise (off line), que foi realizada pelo programa ANADAT (RHT-InfoData, Montreal, Canadá) (Figura 9).
A resistência total do equipamento (Req), incluindo a cânula traqueal, foi aferida previamente através da aplicação de diferentes fluxos de ar ao sistema (até fluxos de 26 mL/s; bem acima da faixa de fluxo utilizada no presente experimento), com concomitante registro das variações de pressão (ΔP). Uma vez que Req = ΔP/V’, a resistência do equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva ΔPxV’. A pressão resistiva do equipamento (= Req.V’) foi subtraída das pressões resistivas do sistema respiratório e pulmões de tal forma que os resultados representam as propriedades mecânicas intrínsecas. A Req encontrada nos experimentos, constante na faixa de fluxos usados, foi de 0,12 cmH2O. mL-1.s.
Figura 9 - Representação esquemática da montagem do experimento 11 12 13 1 – Cilindro de ar comprimido; 2 – Rotâmero de agulha;
3 – Ventilador controlado a volume com fluxo inspiratório constante com duas
válvulas solenóides;
4 – Pneumotacógrafo;
5 – Peça T para medida de pressão nas vias aéreas; 6 – Cânula traqueal;
7 – Mesa Cirúrgica;
8 – Transdutor de pressão esofagiana; 9 – Transdutor de pressão traqueal;
10 – Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo; 11 – Placa analógico-digital de 12 bits;
12 – Microcomputador;
4.6 Gasometria arterial
A artéria femoral direita dos animais foi puncionada com uma seringa de insulina (BD 1cc com agulha curta), coletando-se 0,1 mL de sangue, após um período de 5 minutos de ventilação mecânica no modo ventilatório inicial , isto é, com VT de 6 mL/Kg, V= 6 mL/s, FR: 80 irpm, relação I:E= 1:2 e FiO2 de 0,21 (antes).
Adicionalmente, outra coleta de sangue foi realizada ao término do experimento, ou seja, 1 hora após as diferentes manobras de recrutamento (depois).
O sangue arterial coletado foi depositado em cartucho especifico (Biosensor
EG7+®, Abbot Laboratories), que foram introduzidos no analisador de gases
i-STAT® [Abbott Point-of-care (POC), Illinois, EUA], para determinação dos parâmetros da gasometrial arterial.
4.7. Microscopia óptica
4.7.1 Fixação e preparo das lâminas
Os pulmões foram ocluídos ao final da expiração com linha de algodão. O pulmão direito foi congelado através de imersão em nitrogênio líquido, por aproximadamente 3 minutos e, posteriormente, mantidos em solução Carnoy (etanol 60%, clorofórmio 30% e ácido acético 10%, por volume) a –70o C por 24 h. Após este período, o material foi desidratado progressivamente através de imersão em soluções com concentração crescente de etanol, como discriminado abaixo:
• MC-1: Etanol 70%, clorofórmio 22,5% e ácido acético 7,5%, a – 20o C durante 1 h;
• MC-2: Etanol 80%, clorofórmio 15% e ácido acético 5%, a – 20o C durante 1 h;
• MC-3: Etanol 90%, clorofórmio 7,5% e ácido acético 2,5%, a – 20o C durante 1 h;
• Etanol 100%, sendo mantidos a – 20o C por 1 h.
Posteriormente, os pulmões foram mantidos a – 4o C por 24 h. Após a fixação, o material foi embebido em parafina, sendo realizados cortes histológicos com 3 μm de espessura. As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas com hematoxilina e eosina (HE).
4.7.2 Análise histológica e morfométrica
As lâminas contendo os cortes pulmonares foram analisadas por microscopia óptica (Olympus BX51; Tóquio, Japão) segundo seus aspectos qualitativos e quantitativos. Para a análise descritiva, toda a superfície da lâmina foi observada em aumento de 100 e 400x.
A análise quantitativa foi realizada através da técnica convencional de contagem de pontos (“point-couting”) (Gundersen e cols.,1988), utilizando um retículo acoplado a ocular do microscópio contendo um sistema de referência de 100 pontos e 50 linhas dispostos em paralelo (Figura 10). Em um aumento de 200x foram avaliados dez campos aleatórios e não coincidentes por lâmina. Quantificou-se a fração de área ocupada por alvéolos normais, colapsados e hiperinsuflados (Weibel, 1990).
Figura 10 - Representação esquemática do retículo com 100 pontos e 50 linhas.
4.8 Microscopia eletrônica de transmissão
Para a análise da microscopia eletrônica foram retirados três fragmentos do parênquima pulmonar do pulmão esquerdo (2x2x2mm). Os fragmentos foram colocados em glutaraldeído com tampão fosfato preparado a 2%, por 2 h, sendo posteriormente colocados em sacarose. Os fragmentos permaneceram em solução de sacarose até o processamento, constituída de 4,5 g de NaCl e 8,9 g de sacarose diluídos em 500 mL de água destilada. A seguir, os fragmentos foram imersos em solução de tetróxido de ósmio (0,405 a 1% de água, contendo 106 ou 133 mg de sacarose por mL) por 2 h. Após a lavagem em água bidestilada, as preparações foram colocadas na geladeira em solução aquosa 0,5% de acetato de uranila contendo 106 a 133 mg de sacarose, por um tempo médio que variou de 2 a 24 h. O processo é continuado, efetuando-se a desidratação em concentrações crescentes de álcool etílico, progredindo gradativamente até álcool absoluto, sendo então passado em óxido de propileno por 15 minutos (2 vezes). Iniciando a fase de embebição, as amostras foram colocadas em misturas de partes iguais de óxido de propileno e resina. Os frascos contendo os fragmentos foram colocados para girar (1
rotação a cada 4 minutos, por 1 hora). Posteriormente, as peças foram colocadas por 16 h em resina, com a seguinte composição: 10 mL de araldite (Cy-205), 8 mL de endurecedor DDSA (anidrido de ácido doxecenil succínico), 0,5 mL de acelerador (N-benzil dimetilamina) e 0,1 mL de plastificante (dibutilftaltato). Ao término de 16 h, as amostras foram colocadas em moldes de silicone com nova resina, para polimerização em estufa a 60o C, por 5 dias. Concluída a polimerização, os espécimes foram aparados e cortes semifinos foram obtidos com o ultramicrótomo Porter Blum MT2. Tais cortes, com 0,5 μm de espessura foram montados em lâminas de vidro e corados com uma mistura de azul de metileno a 1% e azur II, em partes iguais e a quente. Nesses cortes, foram selecionadas áreas representativas das lesões. Para o estudo ultraestrutural, cortes ultrafinos com espessura em torno de 90 milimicrômetros foram contrastadas pelo acetato de uranila a 2% durante 30 minutos e, finalmente, por citrato de chumbo por 10 minutos. A observação dos cortes e as eletromicrografias foram realizadas em microscópio eletrônicas JEOL (Jeol 1010, Japão).
Um escore semi-quantitativo de gravidade foi usado para mensuração da apoptose, necrose PI, necrose PII, membrana basa desnudada, colapso alveolar, lesão epitelial e presença de membrana hialina. Utilizando-se zero quando não foi contado nenhuma alteração, 1 (0-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) e 4 (76-100%) em 10 campos microscópicos não-coincidentes.
4.9 – Dectecção e quantificação de células apoptóticas
Pequenos fragmentos (2x2x2mm) foram cortados do pulmão esquerdo, fígado, rim e do intestino e armazenados em formalina à 10%. Os blocos foram cortados longitudinalmente 4-μm (pulmão e rim) ou 2-μm (fígado) com micrótomo e corados com hematoxilina-eosina.
A expressão de Fas-L foi avaliada por coloração imunohistoquímica utilizando-se a técnica do complexo imunoperoxidase avidina-biotina, usando anticorpo policlonal anti-Fas-L (Clone FSL01; same as 5D1) (Neo Markers, Westinghouse, CA); diluição 1:20 que reconhece a região N-terminal intracelular do Fas-L humano. A coloração citoplasmática acastanhada caracterizou a expressão Fas-L.
Para detecção in situ de apoptose, ao nível de uma única célula, foi usado o método TUNEL (terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick
end-labeling method) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). Este método
envolve a adição de trifosfato de deoxiuridina (dUTP) marcado com fluorescência nos fragmentos terminais do DNA por ação catalítica do TdT (Gavrieli e cols. 1992; Wijsman e cols., 1993). Todos os experimentos foram realizados várias vezes de modo que, os resultados para várias amostras de tecidos, incluindo a próstata do rato, pudessem ser padronizados. Cortes histológicos feitos a partir de blocos de parafina (4 a 6 μm) foram depositados em lâminas. A seguir, os cortes foram desparafinados em solução xilol e rehidratados com diluições decrescentes de etanol em água. Os cortes foram lavados quatro vezes com água destilada por 2 minutos e imersos em tampão TdT (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). Então, TdT (0,3 U por microlitro) e marcação fluorescente dUTP em tampão TdT foram adicionados aos cortes e as amostras foram incubadas em atmosfera úmida a
