Reconhecimento da CD30 pelos nanomateriais sintetizados (imunoprecipitação)

Para avaliar a manutenção da capacidade de reconhecimento seletivo do mAb Ki-1 após a reação de acoplamento na superfície das SiO2NPs, a interação das SiO2-

NH2-Ki-1 com os lisados celulares de L540 e Karpas 299 foi estudada. Esse ensaio

foi realizado baseado no princípio da técnica de imunoprecipitação, muito utilizada para isolar antígenos de interesse de uma mistura complexa de proteínas.193,194

As nanopartículas sem Ki-1 (SiO2-NH2 (75% Zwitt)) foram utilizadas como

controle de interação inespecífica de proteínas provenientes dos lisados. Após a incubação, as nanopartículas foram precipitadas e o sobrenadante foi analisado. As proteínas que presentes no sobrenadante foram separadas por eletroforese em gel (SDS-PAGE) e analisadas por Western Blot, como mostra a Figura 37.

Figura 37. Interação do lisado celular de ambas L540 e Karpas 299 com as SiO2NPs

sintetizadas. Inicialmente os lisados celulares de ambas as células CD30+ foram incubados com as nanopartículas SiO2-NH2 (75% Zwitt) e SiO2-NH2-Ki-1 (75% Zwitt). Após o período de

incubação, as nanopartículas foram precipitadas e o sobrenadante analisado pela técnica de Western Blot. Nota-se a presença da CD30 no sobrenadante de incubação com as nanopartículas sem Ki-1, o que pode estar relacionada com o fato dessa proteína não interagir de maneira inespecífica com as SiO2-NH2 (75% Zwitt). Por outro lado, observa-se a ausência

da banda em 120 kDa no sobrenadante de incubação com as SiO2-NH2-Ki-1 (75% Zwitt), o

que pode-se inferir que o anticorpo Ki-1 manteve sua atividade biológica de reconhecimento e capacidade de ligação com a CD30, removendo a CD30 do sobrenadante por meio da formação do complexo Ki-1-CD30, que foi precipitado junto com as nanopartículas. A proteína β-actina foi utilizada como padrão de carregamento.

Pode-se verificar a presença da banda em 120 kDa referente à CD30 transmembranar mesmo após a incubação dos lisados celulares (L540 e Karpas 299) com as nanopartículas sem Ki-1 (SiO2-NH2 (75% Zwitt)). Isso reforça a propriedade de

prevenção de interações inespecíficas com biomoléculas promovida pela presença do grupo zwitteriônico na superfície das SiO2NPs, como demonstrado nos resultados

apresentados durante a caracterização dessas nanopartículas (Item 5.2).

Assim, a ausência da banda em 120 kDa após a incubação com as SiO2-NH2-

Ki-1 (75% Zwitt), permite inferir que o mAb Ki-1 manteve sua capacidade de reconhecimento seletivo da CD30, mesmo após a reação de acoplamento na superfície das SiO2NPs. Dessa maneira, após a comprovação da manutenção da

capacidade de reconhecimento do Ki-1 presente nos materiais SiO2-NH2-Ki-1 (75%

Zwitt), realizamos os ensaios viabilidade celular nas linhagens de interesse, utilizando a citometria de fluxo e o kit de apoptose/necrose celular (Anexina V-FITC/PI).

A citometria de fluxo foi utilizada para avaliar os possíveis efeitos citotóxicos proveniente dos materiais sintetizados. Essa técnica mede e analisa simultaneamente várias propriedades e características de células em suspensão, a medida que o fluxo passa através de um feixe de luz (laser).195 _{O espalhamento da luz proveniente da}

interação das células com o laser, está diretamente relacionado às propriedades estruturais e morfológicas das mesmas, enquanto a emissão de fluorescência é proporcional à quantidade de sonda fluorescente ligada à célula ou à um componente celular.196,197

No presente estudo, o ensaio de Anexina V-FITC/PI (iodeto de propídeo) foi utilizado para distinguir as células em início de apoptose (eventos PI- (negativo)/Anexina V-FITC+ (positivo)) e em apoptose tardia/necróticas (eventos PI+ (positivo) /Anexina V-FITC + (positivo)).198 _{Este ensaio não permite a distinção entre}

células que sofreram morte apoptótica daquelas que morreram como resultado de uma via necrótica, pois em ambos os casos, elas são coradas com Anexina V-FITC e PI. No entanto, permite inferir a respeito da viabilidade celular das linhagens estudadas.

Como os materiais foram sintetizados para o encapsulamento de DOX, primeiramente, foi avaliado o efeito da concentração desse fármaco com relação ao tempo de exposição (24, 48 e 72 h) na redução de viabilidade celular de L540 e Karpas 299, como mostra a Figura 38.

Figura 38. Porcentagem de morte celular de (A) L540 e (B) Karpas 299 ocasionada pelo

tratamento com diferentes concentrações de DOX nos tempos de 24, 48 e 72 h. Cisplatina foi utilizada como controle de morte celular199,200 _{(controle negativo), enquanto que as células}

sem tratamento foram determinadas como controle positivo (proliferação celular). Os símbolo * representa as células vivas (0% de morte celular). Os experimentos foram realizados em quadruplicata, simultaneamente. Os resultados estão apresentados como a média±desvio padrão. O teste-t de Student foi utilizado para análise estatística dos dados. As diferenças são consideradas significativas quando P <0.05. Dentro do mesmo grupo, os dados não estatiscamente diferentes são representados pelos símbolos comuns no topo das barras.

Nota-se que ambas as células são susceptíveis à DOX (Figuras 38A e B) de maneira concentração-dependente. Além disso, o efeito citotóxico desse fármaco é intensificado com maiores tempos de tratamento (72 h). A Karpas 299 respondeu de forma diferente ao tratamento com DOX comparada à L540, apresentando resistência relativa à esse fármaco. Enquanto que a L540 atingiu a IC50 com ~1000 nM de DOX,

foi necessária uma concentração pelo menos 10x maior para observamos o mesmo resultado na Karpas 299.201

A DOX é um dos fármacos quimioterápicos mais eficazes, pois apresenta amplo espectro de atividade na aplicação clínica.74 _{O exato mecanismo de ação desse}

fármaco não foi completamente elucidado. No entanto, são propostos duas hipóteses da interação e consequente toxicidade da DOX nas células cancerosas: (1) intercalação na fita de DNA e interrupção do reparo do mesmo mediado pela topoisomerase II e (2) geração de espécies reativas de oxigênio (do inglês reactive oxygen species, ROS), que podem levar à peroxidação lipídica, ocasionado dano à membrana celular, ao DNA, e desencadeando vias apoptóticas da morte celular.202

As Figuras 39A e B apresentam os resultados referentes à avaliação do efeito dos materiais sintetizados na viabilidade celular de L540 e Karpas 299, respectivamente.

Figura 39. Avaliação da ação das nanopartículas sintetizadas na redução de viabilidade

celular de (A) L540 e (B) Karpas 299. As células foram incubadas com as SiO2NPs (0,01; 0,03

e 0,1 mg/mL) por 24, 48 e 72 h. Cisplatina foi utilizada como controle de morte celular199,200

(controle negativo), enquanto que as células sem tratamento foram determinadas como controle positivo (proliferação celular). Os experimentos foram realizados em quadruplicata, simultaneamente. Os resultados estão apresentados como a média±desvio padrão. O teste-t de Student foi utilizado para análise estatística dos dados. As diferenças são consideradas significativas quando P <0.05. Dentro do mesmo grupo, os dados não estatiscamente diferentes são representados pelos símbolos comuns no topo das barras.

É possível notar que para ambas as linhagens L540 e Karpas 299 (Figuras 39A e B), as nanopartículas sem Ki-1 (SiO2-NH2 (75% Zwitt) e DOX@SiO2-NH2 (75%

Zwitt)) apresentam efeito tóxico negligenciável, sendo que a viabilidade celular de ambas permaneceu >90%, independente da concentração de nanopartículas (0,01; 0,03 ou 0,1 mg/mL) ou do tempo de incubação utilizado (24, 48 ou 72 h). No entanto, verificamos uma redução de ~30% na viabilidade para ambas as linhagens quando tratadas com as nanopartículas funcionalizadas com o mAb Ki-1 (SiO2-NH2-Ki-1 (75%

Zwitt) e DOX@SiO2-NH2-Ki-1 (75% Zwitt)). Esse efeito foi observado principalmente

na concentração de 0,1 mg/mL de nanopartículas e com tempo de exposição de 48/72 h.

No entanto, nota-se que a redução na viabilidade celular ocorreu independente da presença de DOX nos materiais. Por isso, o perfil cumulativo (%) de liberação de DOX dos materiais sintetizados foi avaliado, como mostra a Figura 40.

Figura 40. Pefil cumulativo de liberação de DOX (%), realizado em PBS (10 mM, pH 7,4). As

misturas foram mantidas a 37 °C, sob agitação constante. Os experimentos foram realizados em triplicata, simultaneamente e a média de cada condição é mostrada, com as barras de erro representando os devios padrão.

Utilizando a porcentagem de DOX encapsulada nas amostras (DOX@SiO2

Nude e DOX@SiO2-NH2-Ki-1 (75% Zwitt)) obtida pela análise de TGA (apresentada

no item 5.2) e as massas dos materiais utilizados no ensaio de liberação, estima-se que a concentração de DOX liberada em 72 h seja ~1 nM. Essa concentração, como observada nas Figuras 38A e B, não ocasiona morte celular em nenhuma das células. Portanto, acredita-se que o efeito de redução da viabilidade celular observada para L540 e Karpas 299, não esteja associado à liberação do fármaco no meio biológico. É possível que apenas a DOX presente na superfície das nanopartículas seja liberada, justificando a baixa concentração de fármaco liberada, mesmo após longos tempos de incubação.

Com isso, foi verificado se o efeito citotóxico observado era proveniente do próprio anticorpo mAb Ki-1. Por isso, as células foram incubadas pelo mesmo período de tempo, com diferentes concentrações de Ki-1, como mostra a Figura 41.

Figura 41. Avaliação da possível redução na viabilidade celular de (A) L540 e (B) Karpas 299

ocasionada pelo tratamento com o mAb Ki-1. As células foram incubadas com o mAb por 24, 48 e 72 h. Cisplatina foi utilizada como controle de morte celular199,200 _{(controle negativo),}

enquanto que as células sem tratamento foram determinadas como controle positivo (proliferação celular). Os experimentos foram realizados em quadruplicata, simultaneamente. Os resultados estão apresentados como a média±desvio padrão. O teste-t de Student foi utilizado para análise estatística dos dados. As diferenças são consideradas significativas quando P <0.05. Dentro do mesmo grupo, os dados não estatiscamente diferentes são representados pelos símbolos comuns no topo das barras.

Estima-se que a quantidade de Ki-1 presente na superfície das SiO2NPs seja

entre 0,7-1 µg/mL. Ensaios de Braford foram utilizados nessa estimativa, porém não foram completamente conclusivos e por isso não serão apresentados aqui. É possível notar que o Ki-1 não ocasiona redução na viabilidade celular de ambas as linhagens, independentemente da concentração ou tempo de exposição avaliados. O mecanismo de ação dos anticorpos anti-CD30 é bastante controverso na literatura, sendo descrito que sua eficácia terapêutica é modesta quando não associado à fármacos ou carreadores de drogas.203

Por isso, acredita-se que a redução da viabilidade celular observada para a L540 e Karpas 299 nas Figuras 39A e B, pode estar relacionada a efeitos citotóxicos ocasionados pelas próprias SiO2NPs. Até o presente momento, estudos100,102,198,204

mecanismos que levam à esse efeito, principalmente devido a grande variabilidade das condições nos ensaios apresentados, dificultando a comparação entre eles.204

No entanto, é bastante discutido que o estresse oxidativo mediado por ROS é um efeito chave para a toxicidade das SiO2NPs.100,198,204 A geração de ROS induz

danos na membrana celular, que subsequentemente pode alterar as vias de sinalização celular, ocasionando a ativação da apoptose e consequente morte da célula.100 _{O excesso de produção de ROS também pode ocasionar danos nas}

mitocôndrias, que são fundamentais em diversos processos celulares e é uma das organelas mais sensíveis a compostos exógenos.198 _{Dessa maneira, estudos mostram}

a localização das SiO2NPs nas mitocôndrias, corroborando com a hipótese de indução

de danos celulares através do estresse oxidativo.198,205,206

Além disso, a concentração de SiO2NPs desempenha um fator chave no seu

efeito citotóxico.100,198,204 _{Chen et. al.}100_{, por exemplo, demonstraram que a partir de}

0,1 mg/mL as SiO2NPs apresentam efeitos citotóxicos consideráveis para células de

linfócitos. O tempo de exposição, tipo de rota sintética, a forma e tamanho das SiO2NPs, bem como a linhagem celular devem ser levadas em consideração na

avaliação da sua citotoxicidade.100,198,204

Apesar disso, esses efeitos são apenas observados após a internalização celular das SiO2NPs.100 Existem várias vias de internalização pelas quais as

nanopartículas podem entrar nas células. Em geral, nanopartículas funcionalizadas com anticorpos (que reconheçam receptores da membrana celular), são mais facilmente internalizadas, devido a mecanismos de indução de internalização mediada pela interação do anticorpo com os receptores celulares.158

Assim, como foi observado efeito de redução de viabilidade celular apenas para as nanopartículas funcionalizadas com Ki-1 (Figuras 39A e B), acredita-se que a interação desse mAb com a CD30 presente na membrana celular pode favorecer a internalização e, consequente indução de efeitos citotóxicos pelas SiO2NPs

(dependente da concentração utilizada), levando à morte celular. Para comprovar que a toxicidade das nanopartículas sintetizadas está associada à sua internalização via interação Ki-1 com a CD30, ensaio de viabilidade celular com Jurkat (CD30-) foi realizado, como mostra a Figura 42.

Figura 42. Avaliação da possível redução na viabilidade celular de Jurkat ocasionada pelo

tratamento com as nanopartículas funcionalizadas com Ki-1 (SiO2-NH2-Ki-1 e DOX@SiO2-

NH2-Ki-1). As células foram incubadas com as SiO2NPs (0,01; 0,03 e 0,1 mg/mL) por 24, 48

e 72 h. Cisplatina foi utilizada como controle de morte celular199,200 _{(controle negativo),}

enquanto que as células sem tratamento foram determinadas como controle positivo (proliferação celular). Os experimentos foram realizados em quadruplicata, simultaneamente. Os resultados estão apresentados como a média±desvio padrão. O teste-t de Student foi utilizado para análise estatística dos dados. As diferenças são consideradas significativas quando P <0.05. Dentro do mesmo grupo, os dados não estatiscamente diferentes são representados pelos símbolos comuns no topo das barras.

Como previsto, os materiais não ocasionaram o mesmo efeito de redução na viabilidade celular da Jurkat (Figura 42) como observado para as células L540 e Karpas 299 (Figuras 39A e B). Esse resultado é um forte indicativo que a internalização das SiO2NPs ocorre possivelmente mediada pela interação entre a

CD30 e o mAb Ki-1 (presente na superfície das nanopartículas).

Assim, microscopia confocal foi utilizada para avaliar a hipótese da internalização mediada das SiO2NPs, melhorando a compreensão dos resultados

obtidos nos ensaios de viabilidade celular. As estruturas de L540 e Karpas 299 foram identificadas através de marcação específica de organelas subcelulares. A Figura 43 mostra imagens das células L540 (Figura 43A) e Karpas 299 (Figura 43B) na ausência

(amostra controle) e na presença de nanopartículas sem (SiO2-NH2 (75% Zwitt)) e

com Ki-1 (SiO2-NH2-Ki-1 (75% Zwitt)). As nanopartículas utilizadas apresentam

Rodamina em sua estrutura, o que possibilita sua identificação por fluorescência (fluorescência vermelha). A Figura 43C apresenta uma ampliação das imagens de sobreposição de sinais, para melhor visualização da internalização celular das nanopartículas sintetizadas.

Figura 43. Imagens celulares de (A) L540 e (B) Karpas 299 obtidas por microscopia confocal.

A primeira coluna (L540/Karpas 299) corresponde ao controle de células na ausência das SiO2NPs, já a segunda coluna refere-se às células tratadas com as nanopartículas sem Ki-1

(SiO2-NH2 (75% Zwitt)) e, por último a terceira coluna corresponde às células tratadas com as

nanopartículas funcionalizadas com Ki-1 (SiO2-NH2-Ki-1 (75% Zwitt)). As nanopartículas

utilizadas foram produzidas com adição rodamina, obtendo nanopartículas fluorescentes. A linha de Hoechst 33342 representa o núcleo das células; MitoTracker® _{Green FM indica a}

mitocôndria no citoplasma; a linha de Rodamina indica o sinal proveniente das nanopartículas internalizadas e a última linha representa a sobreposição das três imagens de cada condição.

(C) Ampliação das imagens 11 e 12 de ambas as células para melhor visualização das

nanopartículas internalizadas (sinal fluorescente vermelho).

As células L540 e Karpas 299 (Figuras 43A e B) foram marcadas com MitoTracker® _{Green FM e Hoechst 33342. O MitoTracker}® _{Green FM possibilita a}

identificação das mitocôndrias viáveis presentes no citoplasma, enquanto que o Hoechst 33342 permite a identificação do núcleo das células.

Para ambas as células, observa-se que sob o tratamento com as nanopartículas sem Ki-1 (SiO2-NH2 (75% Zwitt)), não ocorre internalização celular das

mesmas (Figura 43C, imagens 11), notando a ausência de fluorescência proveniente da rodamina (fluorescência vermelha). No entanto, verifica-se a presença das SiO2-

NH2-Ki-1 (75% Zwitt) no interior de ambas as células CD30+ (Figura 43C, imagens

12), sendo um forte indício de que a internalização das SiO2NPs sintetizadas nesse

trabalho ocorre mediada pela interação do Ki-1 das nanopartículas com o CD30 expresso na membrana celular de ambas L540 e Karpas 299. No entanto, essa hipótese precisa ser melhor validada por futuras investigações que justifiquem plenamente a internalização e consequente citotoxicidade observadas para as SiO2NPs.