UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
JESSICA FERNANDA AFFONSO DE OLIVEIRA
SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS DE SÍLICA MESOPOROSA
FUNCIONALIZADAS COM ANTICORPOS MONOCLONAIS: UMA ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE LINFOMAS HODGKIN (LH) E LINFOMA
ANAPLÁSICO DE GRANDES CÉLULAS CD30+ (ALCL – CD30+)
CAMPINAS 2019
JESSICA FERNANDA AFFONSO DE OLIVEIRA
SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS DE SÍLICA MESOPOROSA
FUNCIONALIZADAS COM ANTICORPOS MONOCLONAIS: UMA ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE LINFOMAS HODGKIN (LH) E LINFOMA
ANAPLÁSICO DE GRANDES CÉLULAS CD30+ (ALCL – CD30+)
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Mateus Borba Cardoso Coorientador: Prof. Dr. Edvaldo Sabadini
O arquivo digital corresponde à versão final da Tese defendida pela aluna Jessica Fernanda Affonso de Oliveira e orientada pelo Prof. Dr. Mateus Borba Cardoso.
CAMPINAS 2019
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Mateus Borba Cardoso (Orientador)
Prof. Dr. Celso Aparecido Bertran (Instituto de Química - Unicamp)
Prof. Dr. Italo Odone Mazali (Instituto de Química - Unicamp)
Profa. Dra. Eliana Martins Lima (Universidade Federal de Goiás – UFG)
Dr. Diego Stéfani Teodoro Martinez (CNPEM/LNNano)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pela aluna Jessica Fernanda Affonso de Oliveira, aprovada pela Comissão Julgadora em 22 de maio de 2019.
Dedicatória
Esse trabalho é extensamente dedicado à minha amada tia Aracélia Serra (in memoriam), que sempre será meu maior exemplo de força, determinação e fé. Desde que adquiri consciência acerca de sua enfermidade há 20 anos atrás, meu objetivo de vida tornou-se buscar alternativas para minimizar os efeitos colaterais da quimioterapia, através do desenvolvimento de metodologias alternativas para o tratamento do câncer. Ela superou por três vezes essa enfermidade e é minha grande inspiração. Porém seu óbito ocorreu devido aos malignos efeitos adversos da quimioterapia. Obrigada por fazer parte da minha vida e por me motivar a levar esperança à milhares de outras pessoas na mesma situação.
Dedico também à minha avó Maria Helena Gradim Affonso (in memoriam) e a todos os amigos desencarnados, que sempre me apoiaram, estiveram ao meu lado e me inspiraram durante os meus momentos mais difíceis. Aos meus pais Marco e Claudia que me proporcionaram todo amor, apoio, incentivo. Serei eternamente grata aos sacrifícios que eles fizeram durante todos esses anos para que eu chegasse até aqui. Ao meu amado irmão Leonardo que sempre teve muita paciência, me apoiou e me ajudou muito nas horas em que mais precisei. À minha cunhada Gabi, por todo amor e apoio incondicional. Aos meus avós Albano Horácio, Maria de Lourdes e Antonio Gomes, por todo amor e carinho nos momentos mais difíceis. À minha madrinha Nair, pelo amor e pelas carinhosas orações e palavras de conforto. Ao meu primo Diego, por ser meu porto seguro e minha estrela guia. Aos meus tios Cleber, Ana Paula, Cristiane e Fábio (e primo Théo), pelo amor e carinho que têm por mim. Enfim, à toda a minha grande e maravilhosa família pelo amor incondicional, compreensão e apoio em todos os momentos da minha vida.
A todos meus amigos de infância (Carlos, Heitor, Weberson, Paula), aos amigos do colégio, aos meus queridos amigos da UFSCar (principalmente à Ariele), USP (principalmente ao Vinícius Dantas), Unicamp, CNPEM, UMass (Ryan, Mahdieh, Riddha, Carol, Prof. Dr. Rotello), e à todos os amigos que ganhei ao longo da vida.
Aos meus professores do ensino fundamental, colégio, universitário e da pós-graduação. Todos foram de fundamental importância em cada momento da minha formação pessoal e profissional. Obrigada a todos por todos os ensinamentos. E à todas as pessoas que foram essenciais para que eu chegasse até aqui.
" Eu vou tentar Sempre E acreditar que sou capaz De levantar uma vez mais Eu vou seguir Sempre Saber que ao menos eu tentei E vou tentar mais uma vez."
Agradecimentos
✓ À Deus pela oportunidade de viver e de poder desenvolver tal trabalho.
✓ Ao meu orientador Prof. Dr. Mateus Borba Cardoso e Co-orientador Prof. Dr. Edvaldo Sabadini, pela orientação ao longo desses anos e plena confiança em meu trabalho, que contribuíram muito para meu desenvolvimento pessoal e profissional. ✓ Aos membros da banca pela disposição em examinar e contribuir para este trabalho.
✓ O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
✓ À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - Processo 2013/22429-9) pela bolsa de doutorado concedida e suporte financeiro ao LNLS/LNNano. E também pela Bolsa Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE FAPESP - Processo 2015/21918-1), que contribuiu significativamente para o desenvolvimento desse projeto.
✓ Ao Prof. Dr. Jörg Kobarg e às Dra. Ângela Saito e Dra. Talita Diniz Melo Hanchuk, por toda orientação e disponibilidade que possibilitou a aplicação biológica dos materiais sintetizados ao longo do projeto.
✓ À MSc. Maria Eugênia Ribeiro Camargo e Dra. Raquel Frenedoso da Silva pela amizade, por toda orientação ao longo do trabalho e disponibilidade em auxiliar nos ensaios de citometria de fluxo.
✓ À Jackeline de Lima Zanella pela disponibilidade e auxílio na purificação do anticorpo monoclonal produzido. À Dra. Marília Meira Dias por toda orientação e disponibilidade em realizar as imagens de microscopia confocal.
✓ À Simone Baú Betim e Natalia Cristina Moreno pela amizade ao longos dos anos e disponibilidade em realizar as caracterizações necessárias para esse trabalho. ✓ À Dra. Andressa da Cruz Scheind pela amizade e orientações que contribuíram imensamente para a realização desse trabalho. À MSc Íris Renata Ribeiro pela amizade e contribuição essencial para realização do imageamento das células estudadas.
✓ À Dra. Larissa Brentano Capeletti pela amizade, trabalho em equipe e ensinamentos ao longos dos anos. Suas orientações e experiência profissional contribuíram muito para minha formação.
✓ Ao Prof. Dr. Vincent M. Rotello e ao seu grupo de pesquisa, pela hospitalidade e ensinamentos durante a realização do estágio de Doutorado na UMass-Amherst (Massachusetts, EUA).
✓ Ao Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, em especial aos Laboratórios Nacional de Nanotecnologia (LNNano), Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS), Laboratório Nacional de Biociências (LNBio) e Laboratório de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), pela infraestrutura que possibilitou o desenvolvimento desse trabalho.
✓ À Unicamp, em especial ao Instituto de Química, por ter me proporcionado um ensino de excelência durante todo o período de pós-graduação.
✓ Á todo os membros e ex-membros do grupo de pesquisa do Prof. Dr. Mateus Borba Cardoso, que de alguma forma contribuíram para a realização desse projeto. ✓ E a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho!
Resumo
O presente trabalho descreve a síntese de nanopartículas de sílica (SiO2NPs)
utilizadas no encapsulamento do fármaco antitumoral doxorrubicina (DOX) e posterior funcionalização com o anticorpo monoclonal Ki-1, para o tratamento de células de linfoma CD30+. Devido às suas propriedades físico-químicas e ao eficiente transporte de moléculas biologicamente ativas, as SiO2NPs têm sido consideradas promissores
sistemas de entrega de fármacos. No entanto, quando nanopartículas estão em contato com fluidos biológicos, proteínas tendem adsorver em sua superfície, formando um recobrimento conhecido como coroa de proteínas (do inglês protein corona), consequentemente afetando sua interação biológica.
Nesse contexto, o primeiro desafio a ser transposto é prevenir a adsorção inespecífica de proteínas na superfície das SiO2NPs. Assim, propusemos uma
modificação na superfície das mesmas de forma a obter dupla funcionalização, de maneira a modular seu comportamento in vitro. Portanto, a funcionalização das SiO2NPs foi realizada com um organossilano sulfobetaína zwitteriônico, que fornece
estabilidade coloidal, e com o 3-aminopropiltrietóxisilano (APTES). As aminas primárias (-NH2) presentes na estrutura química do APTES ofereceram extensão
química na modificação da superfície das SiO2NPs, que possibilitou posterior reação
de conjugação com o anticorpo monoclonal Ki-1. Verificamos que a porção zwitteriônica foi bastante efetiva na prevenção da adsorção de proteínas, mesmo em soluções com elevada concentração das mesmas. Isso permitiu a manutenção da identidade biológica dos materiais sintetizados, possibilitando sua posterior interação com as células de interesse.
Além disso, o segundo desafio desse trabalho está relacionado à avaliação do comportamento biológico e especificidade das SiO2NPs funcionalizadas com
anticorpo monoclonal Ki-1 em ensaios celulares. Ki-1 foi escolhido devido à sua seletividade no reconhecimento da proteína transmembranar CD30, a qual é superexpressa na membrana celular de linfomas Hodgkin (LH) e anaplásico de grandes células (ALCL). Dessa forma, ensaios de viabilidade celular foram realizados através de citometria de fluxo com as linhagens celulares L540 (LH) e Karpas 299 (ALCL), sendo ambas CD30+. Investigamos o direcionamento seletivo dos materiais funcionalizados com Ki-1, e pudemos observar que as SiO2NPs não funcionalizadas
90%. Por outro lado, as nanopartículas funcionalizadas com Ki-1 apresentaram redução de ~30% na viabilidade celular de ambas L540 e Karpas 299. Acreditamos que o efeito citotóxico das SiO2NPs só é observado quando as mesmas são
internalizadas pelas células. Assim, é possível que a funcionalização com o Ki-1 favoreça a entrada das nanopartículas, por meio da interação do anticorpo com a proteína CD30 presente na membrana das células estudadas, resultando em internalização mediada por receptor celular. Ensaios de microscopia confocal possibilitaram validar a hipótese citada, porém ainda há a necessidade de investigações que justifiquem plenamente a internalização e consequente citotoxicidade ocasionada pelas SiO2NPs.
Dessa maneira, acreditamos que o presente trabalho apresenta fundamental contribuição para o avanço de pesquisas relacionadas ao direcionamento biológico e seletivo utilizando nanopartículas. Apresentamos uma estratégia de modificação de superfície que, ao mesmo tempo que mantém a identidade biológica dos materiais, favorece o acoplamento com moléculas direcionadoras. Essa metodologia pode contribuir para a estabilidade e melhor biodisponibilidade de fármacos encapsulados, assim como reduzir possíveis efeitos adversos apresentados pelos tratamentos quimioterápicos convencionais.
Abstract
The present work describes the synthesis of silica nanoparticles (SiO2NPs)
used for antitumor drug doxorubicin (DOX) encapsulation and subsequent functionalization with the monoclonal antibody Ki-1, for CD30+ lymphoma cells treatment. Due to their physico-chemical properties and the efficient transport of biologically active molecules, SiO2NPs have been considered promising drug delivery
systems. However, when nanoparticles are in contact with biological fluids, proteins tend to adsorb on their surface, forming a coating known as protein corona, consequently affecting their biological interaction.
In this context, the first challenge to be transposed is to prevent nonspecific proteins adsorption on the SiO2NPs surface. Thus, we propose a surface modification
to obtain dual functionalization, in order to modulate their behavior in vitro. Therefore, the functionalization of SiO2NPs was performed with an organosilane zwitterionic
sulfobetaine, which provides colloidal stability and with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). The primary amines (-NH2) on APTES chemical structure offered a chemical
extension on SiO2NPs surface modification, enabling subsequent coupling reaction
with Ki-1 monoclonal antibody. We verified that the zwitterionic portion was very effective in protein adsorption prevention, even in solutions with high protein concentration. This allowed the maintenance of the biological identity of the synthesized materials, allowing their subsequent interaction with the targeted cells.
In addition, the second challenge of this work is related to the evaluation of the biological behavior and specificity of SiO2NPs functionalized with Ki-1 monoclonal
antibody in cellular viability assays. Ki-1 was chosen because of its selectivity towards recognition of CD30 transmembrane protein, which is overexpressed in the cell membrane of Hodgkin's (LH) and anaplastic large cell (ALCL) lymphomas. Thus, cell viability assays were performed through flow cytometry with L540 (LH) and Karpas 299 (ALCL) cell lines, both CD30+. We investigated the selective targeting of Ki-1 functionalized materials, and we could observe that the non-functionalized SiO2NPs
show negligible cytotoxic effect, maintaining cell viability above 90%. On the other hand, Ki-1 functionalized nanoparticles showed ~ 30% reduction in the cellular viability for both L540 and Karpas 299. We believe that the cytotoxic effect of SiO2NPs is only
observed when they are internalized by the cells. Thus, it is possible that the functionalization with Ki-1 favors the entry of the nanoparticles, through the interaction
of the antibody with the CD30 membrane protein of the cells studied, resulting in cell receptor-mediated internalization. Confocal microscopy assays allowed to validate the hypothesis cited, but there is still a need for investigations that fully justify the internalization and consequent cytotoxicity caused by SiO2NPs.
In this way, we believed that this work presents fundamental contribution for advancement of research related to biological and selective targeting using nanoparticles. We present a surface modification strategy that, while maintaining the biological identity of the materials, favors the coupling with targeting molecules. This methodology can contribute to stability and better bioavailability of encapsulated drugs, as well as reduce possible side effects presented by conventional chemotherapeutic treatments.
Lista de abreviaturas
ADCs Antibody-drug conjugates
ALCL Linfoma Anaplásico de Grandes Células APTES 3-aminopropiltrietoxisilano
ATCC American Type Culture Collection BSA Albumina de Soro Bovino
BV Brentuximab Vedotin
CD Dicroísmo circular
cHL Linfoma Hodgkin clássico DLS Espalhamento de Luz Dinâmico DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DNA Ácido desoxirribonucleíco
DNR Daunorrubicina
DOX Doxorrubicina
EDC Hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida EPR Enhanced Permeability and Retention
FBS Soro Fetal Bovino
FITC Isotiocianato de Fluoresceína HRP Horseradish Peroxidase
λ Comprimento de onda
LH Linfoma Hodgkin
LNH Linfoma não-Hogdkin mAbs Anticorpos monoclonais
METV Microscopia Eletrônica de Transmissão por Varredura MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
NHS N-hidroxisuccinimida
NP40 Nonidet P-40
NSMs Nanopartículas de Sílica Mesoporosas OMS Organização Mundial da Saúde
PB Tampão fosfato
PBS Tampão fosfato salino PEG Polietileno glicol
PI Iodeto de Propídeo
RIPA Radioimmunoprecipitation assay buffer RMN Ressonância Magnética Nuclear
RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 SDS Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-Page Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS SiO2NPs Nanopartículas de sílica
TBS-T Tampão Tris Salino com Tween 20 TEOS Tetraetilortosilicato
TGA Análise Termogravimétrica Tris-HCl Tampão Tris-HCl
UV-Vis Espectroscopia Ultravioleta-Visível
XPS Espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X Zwitt Zwitteriônico
Sumário
1. Introdução ... 17 2. Fundamentação teórica ... 20 2.1. Câncer ... 20 2.1.1. Tipos de câncer ... 23 2.1.2. Linfomas ... 23 2.1.2.1. Linfoma Hodgkin (LH) ... 242.1.2.2. Linfoma não Hodgkin (LNH) ... 25
2.1.3. Tratamento ... 26
2.1.3.1. Doxorrubicina (DOX) ... 27
2.2. Nanomateriais e materiais nanoestruturados ... 30
2.3. Tipos de nanomateriais e materiais nanoestruturados ... 31
2.4. Nanopartículas de sílica (SiO2NPs) ... 33
2.4.1. Rotas sintéticas ... 33
2.4.2. Método Stöber ... 34
2.4.3. Funcionalização da superfície das SiO2NPs ... 37
2.4.3.1. Coroa de proteínas ... 39
2.5. Anticorpos ... 41
2.5.1. Terapias com anticorpos ... 42
2.5.2. Anticorpos monoclonais (mAbs) ... 42
2.5.3. Tecnologia de Hibridoma ... 43
2.5.4. Purificação dos anticorpos monoclonais ... 45
2.5.5. Terapia com anticorpos monoclonais ... 46
2.5.5.1. Proteína transmembranar CD30 ... 47
2.5.5.2. Bioquímica da CD30 ... 47
2.5.5.3. Aplicação clínica do anticorpo monoclonal Ki-1 ... 48
2.5.5.4. Conceito conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) ... 49
2.5.5.5. Anticorpos conjugados à nanopartículas para aplicações biomédicas ... 50
3. Objetivo ... 54
3.1. Objetivo geral ... 54
3.2. Objetivos específicos ... 54
4. Procedimento experimental ... 55
4.1. Materiais ... 55
4.1.1. Síntese do organossilano sulfobetaína zwitteriônico (Zwitt) ... 55
4.1.2. Síntese e funcionalização das nanopartículas de silica (SiO2NPs) ... 56
4.1.4. Reação de acoplamento entre o anticorpo monoclonal Ki-1 e as SiO2NPs duplamente
funcionalizadas ... 58
4.2. Caracterização das SiO2NPs ... 59
4.2.1. Ensaio de liberação de DOX ... 60
4.2.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ... 60
4.2.3. Identificação de Ki-1 na superfície das SiO2NPs (citometria de fluxo) ... 61
4.3. Ensaios biológicos ... 62
4.3.1. Geração e produção do anticorpo monoclonal Ki-1 (tecnologia dos hibridomas) ... 62
4.3.2. Purificação do sobrenadante dos hibridomas (obtenção do anticorpo Ki-1) ... 63
4.3.3.Dicroísmo circular (CD) ... 63
4.3.4. Cultura de células ... 63
4.3.5. Identificação da CD30 trasmembranar por Western Blot ... 64
4.3.6. Identificação da CD30 transmembranar por citometria de fluxo ... 66
4.3.7. Investigação da interação entre o Ki-1 acoplado nas SiO2NPs e a proteína CD30 ... 67
4.3.8. Ensaio de viabilidade celular (AlamarBlue®) ... 68
4.3.9. Citometria de fluxo ... 69
5.Resultados e discussão... 70
5.1. Síntese das SiO2NPs ... 70
5.2. Escolha do material ... 86
5.3. Acoplamento com anticorpo monoclonal Ki-1 (síntese das SiO2-NH2-Ki-1 NPs) ... 93
5.3.1. Confirmação da expressão de CD30 na membrana das células ... 96
5.3.2. Reconhecimento da CD30 pelos nanomateriais sintetizados (imunoprecipitação) .... 100
5.4. Ensaios biológicos ... 101
6. Conclusões ... 111
7. Referências Bibliográficas ... 113
8. Anexos ... 131
8.1. Espectro de dicroísmo circular teórico para IgG ... 131
1. Introdução
Câncer é o nome genérico dado à um conjunto de doenças que podem afetar qualquer parte do corpo. É um dos principais problemas de saúde pública mundial e a segunda principal causa de morte todos os anos.1–3 Atualmente, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), anualmente surgem cerca de 14,1 milhões de novos casos de câncer no mundo, dos quais cerca de 8,2 milhões levam à óbito.1,4
Além disso, tratamentos convencionais, como a quimioterapia, ocasiona efeitos adversos, muitas vezes severos, devido à sua ação inespecífica no organismo, visto que não são seletivos para as células doentes.3
O desenvolvimento do câncer (carcinogênese) consiste em múltiplas etapas e complexos mecanismos de sinalização celular. Geralmente, o câncer se inicia de forma localizada, mas pode adquirir motilidade e se alocar em outras regiões do corpo, dificultando sua cura.2 Até hoje, os tipos mais comuns de tratamento do câncer estão
restritos principalmente à cirurgias e ao uso de quimio e radioterapias.2,5 No entanto,
a intervenção cirúrgica muitas vezes é incapaz de remover completamente o tecido doente, devido à dificuldade de acesso ao sítio tumoral ou até mesmo à recorrência da enfermidade. Por outro lado, a quimioterapia apresenta inúmeros efeitos associados à ação inespecífica dos agentes antitumorais, concentração inadequada de fármaco que atinge o tecido doente, citotoxicidade intolerável, habilidade limitada de monitorar a resposta terapêutica e até mesmo o desenvolvimento de resistência aos fármacos utilizados.2,3,6
Dessa forma, alternativas aos tratamentos convencionais vêm sendo desenvolvidas com o objetivo principal de atingir a concentração mínima desejada do agente terapêutico no sítio tumoral, agindo seletivamente contra as células doentes, minimizando o dano às células sadias.2,5 Uma das estratégias mais utilizadas na
literatura é a ligação de fármacos a moléculas direcionadoras,7 que incluem
imunotoxinas,8–10 radioimunoterapêuticos11 e imunoconjugados.12 Além disso, o uso
da nanotecnologia também tem sido considerada uma alternativa promissora para o tratamento do câncer.2,5,13–16 O crescente interesse em materiais nanoestruturados está relacionado às suas propriedades físico-químicas diferenciadas frequentemente superiores àquelas de materiais que apresentam estruturas na escala micrométrica.17,18
A aplicação médica da nanotecnologia deu origem à “nanomedicina”, cujo o principal objetivo é a utilização de elementos na escala nanométrica para atingir benefícios medicinais (cura, diagnóstico ou prevenção de doenças).19 Dentre várias
estratégias, nanopartículas de sílica (SiO2NPs) têm surgido como agentes
promissores para aplicações biomédicas.15,16 Essas nanopartículas apresentam
propriedades físico-químicas únicas tais como estabilidade química e estrutural,20
biocompatibilidade,20,21 além de que sua superfície pode ser facilmente modificada.20– 22 As diversas possibilidades de modificação da superfície das SiO
2NPs levam ao
surgimento de tecnologias promissoras, proporcionam um maior controle no encapsulamento de fármacos e podem melhorar a estabilidade coloidal das nanopartículas. Além disso, tais modificações conduzem à uma melhor hemocompatibilidade das SiO2NPs, aumentando seu tempo de circulação na corrente
sanguínea.16,23
O êxito na utilização das SiO2NPs depende da compreensão das suas
propriedades físico-químicas, visto que as mesmas definem a eficiência de encapsulamento/liberação de fármaco e a resposta da partícula frente ao meio biológico.24 Assim, SiO
2NPs porosas são utilizadas no intuito de encapsular fármacos
hidrofóbicos,20 alterando sua farmacocinética e distribuição, consequentemente
melhorando a eficácia do fármaco e reduzindo possíveis efeitos adversos.3,6,25
A identidade química das SiO2NPs define as interações da superfície das
mesmas com os componentes do meio em que estão inseridas. Por exemplo, proteínas contidas em fluidos biológicos adsorvem na superfície das SiO2NPs devido
a sua elevada energia livre superficial, formando uma coroa de proteínas (do inglês protein corona).26,27 Essa camada de proteínas resulta em uma nova identidade
biológica para as nanopartículas e determina sua interação com as células.20,28,29
Assim, visando manter a atividade dos grupos funcionais na superfície das SiO2NPs,
as mesmas podem ser funcionalizadas com grupos que previnam a formação da coroa de proteínas.30
Além disso, para que sejam eficazes, os sistemas de entrega de fármaco (do inglês drug delivery) devem ser seletivos, ou seja, ter a capacidade de transportar a droga até o tecido desejado.31 Por isso, têm sido proposto na literatura32 a conjugação
de nanopartículas com anticorpos monoclonais (mAbs),33 que apresentam elevada
especificidade no reconhecimento seletivo de uma determinada proteína expressa na membrana das células doentes. Desta forma, este sistema auxilia no direcionamento
específico do material, favorecendo a liberação dos agentes antitumorais nos alvos intencionados,33 reduzindo a toxicidade e aumentando a eficácia do agente
quimioterápico frente à célula tumoral.34
Neste contexto, o presente trabalho visa o desenvolvimento de um sistema coloidalmente estável e específico para a liberação de doxorrubicina em linhagens de linfomas Hodgkin (LH) e anaplásico de grandes células (ALCL), através do reconhecimento do receptor CD30 superexpresso em suas membranas celulares. Assim, utilizamos o método Stöber,35 com algumas modificações, para encapsular a
doxorrubicina nas SiO2NPs.5,36,37 A grande vantagem dessa metodologia é a sua
simplicidade através de uma reação de aprisionamento e funcionalização com poucas etapas.
Por conseguinte, realizamos uma dupla modificação da superfície dessas partículas através da variação da razão molar entre grupos zwitteriônicos (sulfobetaína) e amino (proveniente da molécula 3-aminopropiltrietoxissilano). As moléculas zwitteriônicas previnem a formação da coroa de proteínas, mesmo em concentrações fisiológicas de soro, porém o grupo ácido sulfônico presente na estrutura dessa molécula pode dificultar funcionalização adicional.38 Por isso, o
3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) foi adicionado, uma vez que os grupos amino primário presentes em sua estrutura oferecem extensão química que possibilitam posteriores funcionalizações com moléculas direcionadoras (nesse trabalho o anticorpo monoclonal Ki-1 foi utilizado). Devido à sua biocompatibilidade e superfície quimicamente variável, essas partículas são candidatas promissoras para aplicações biológicas, promovendo uma abordagem alternativa para a síntese de nanomateriais terapêuticos.
2. Fundamentação teórica
2.1. Câncer
Ao longo da história, tanto os seres humanos como outros animais estiveram susceptíveis ao surgimento e desenvolvimento do câncer. Assim, não é surpresa que algumas das primeiras evidências de câncer foram encontradas na forma de tumores ósseos nas múmias humanas no Egito. Os primeiros casos documentados são datados do antigo Egito (∼3000 a.C.),39 no texto médico egípcio (Papiro de Edwin
Smith). Embora o termo “câncer” não tenha sido utilizado, nesse documento estão descritos oito casos de tumores de mama que foram removidos por cauterização.1,40
Hipócrates (460−370 a.C.), o pai da medicina, cunhou mais tarde os termos gregos “carcinoma” e “carcinos” em referência aos tumores formados por úlcera e os não formados por úlcera, respectivamente.1,41–43
Segundo a OMS, o câncer é a segunda principal causa de morte no mundo.1,44,45 As taxas de crescimento atuais sugerem que o número de novos casos
anuais serão em torno de 21,7 milhões e que 13 milhões de mortes por câncer irão ocorrer em 2030. Além disso, o câncer apresenta considerável impacto econômico. Em 2010, por exemplo, o custo econômico global do câncer foi de aproximadamente US$ 1,16 trilhões de dólares, sendo previsto um aumento significativo desse custo nos próximos anos.1
Apesar disso, nosso entendimento sobre a progressão do câncer e os métodos de tratamento têm melhorado a cada século. Sabe-se que o câncer é um conjunto de doenças altamente complexas, heterogêneas e dinâmicas.1,46,47 Enquanto uma célula
sadia segue uma sequência metabólica programada, as células cancerosas não obedecem essa ordem, devido à aquisição de algum tipo de mutação que confere divisão e proliferação celular descontrolada.46,48,49
O número de mutações que ocorrem diariamente durante a divisão celular de uma célula sadia é relativamente baixo.46,49 Obviamente que se apenas uma única
mutação fosse suficiente para converter uma célula sadia em uma célula cancerosa, não seríamos organismos viáveis. Dessa forma, evidências indicam que a formação de neoplasias está associada à acumulação de vários acidentes raros e independentes em uma linhagem celular.49,50
Alterações genéticas e/ou epigenéticas que ocorrem em células normais durante a carcinogênese conferem a estas a habilidade de crescimento irrestrito, levando à formação de um tumor. Desde que as células neoplásicas não se tornem invasivas, o tumor é considerado benigno.46,49 No entanto, quando essas células
adquirem motilidade, capacidade aumentada de proliferação e sobrevivência, o tumor então é considerado um câncer.46,49,51 A Figura 1 mostra uma representação
Figura 1. Representação esquemática da progressão do câncer. (A) Uma célula mutante que
cresce e se prolifera de forma descontrolada origina um tumor. (B) Um tumor apenas é considerado um câncer se for maligno, ou seja, quando as células adquirem motilidade. Essa característica permite à célula se desprender do tecido, penetrar a corrente sanguínea (C) ou os vasos linfáticos e formar tumores secundários (metástases) em outros locais do corpo.49
(Figura criada com alguns elementos extraídos da plataforma Mind the Graph). Esse esquema é meramente ilustrativo e não está na proporção de tamanho real do sistema.
Apesar do grande escopo dessas doenças, algumas características são essenciais para o desenvolvimento de neoplasias malignas:1,46,48
1) Habilidade de reprodução irrestrita e ilimitada, 2) Invasibilidade (metástase),
3) Capacidade de induzir angiogênese,
4) Habilidade de desativar genes supressores de crescimento, 5) Controle sob a regulação dos receptores de adesão celular,
6) Habilidade de evadir os mecanismos de morte celular programada (apoptose).
Dentre essas, a metástase é um dos principais fatores que dificulta o tratamento e cura do câncer, uma vez que os corpos metastásicos podem penetrar na corrente sanguínea ou vasos linfáticos e formar tumores secundários, em outros locais do corpo. Além disso, as células metastásicas podem apresentar um conjunto completamente diferente de mutações e responder de forma muito diferente à quimioterapia aplicada ao tumor primário.46,49,51
Inúmeros fatores podem levar ao desenvolvimento do câncer, como fatores genéticos (de origem endógena) e/ou ambientais (de origem exógena).1 Por exemplo,
a exposição contínua e prolongada a agentes carcinogênicos (radiação, agentes químicos, vírus)51 pode ocasionar mutações genéticas em células sadias, favorecendo
o desenvolvimento do tumor.49
2.1.1. Tipos de câncer
Existem diversos tipos de câncer, e eles são geralmente classificados de acordo com o tipo de célula ou tecido do qual são originados.51 Cânceres derivados
de células epiteliais, por exemplo, são denominados carcinomas. Alterações em células musculares ou do tecido conectivo dão origem aos sarcomas, enquanto que modificações em células hematopoéticas, por sua vez, originam as leucemias e linfomas.49,51 Essas categorias podem ser subdivididas de acordo com os tipos
específicos de células, a localização no corpo e a análise microscópica do tumor.49
2.1.2. Linfomas
O linfoma é uma neoplasia do sangue, sendo originado no sistema linfático.52
Esse sistema integra o sistema imunológico e é composto por vasos, tecidos linfáticos e linfonodos. Uma vez que o sistema linfático é responsável por coletar e redirecionar a linfa (que contém as células de defesa) para o sistema circulatório, as células de linfoma podem facilmente percorrer o corpo humano e se alocar em diferentes órgãos, dando origem à tumores secundários.53
Os linfomas podem ser classificados em dois principais subtipos: linfomas Hodgkin (LH) e não Hodgkin (LNH). Eles diferem basicamente por sua morfologia, pelo seu comportamento biológico e pela resposta à terapia.53 No entanto, a principal
diferença entre o LH e o LNH é a presença das células Reed-Sternberg, que são derivadas de linfócitos B e estão presentes somente nos LH.54 Apesar da
manifestação desses dois subtipos de linfoma serem muito semelhantes, cada um demanda um diferente tratamento quimioterápico. Por isso, é de extrema importância a realização do diagnóstico e classificação correta do tipo de linfoma, para realizar o tratamento adequado do paciente. Os principais sintomas associados ao desenvolvimento do linfoma são cansaço ou fraqueza, febre, sudorese, perda de peso, dores no corpo, emagrecimento, além do aparecimento de nódulos no corpo.
2.1.2.1. Linfoma Hodgkin (LH)
O linfoma Hodgkin (LH) recebe esse nome em homenagem a Thomas Hodgkin, que descreveu a doença em 1832.55 Esse linfoma surge quando um linfócito se
transforma em uma célula maligna, apresentando alto índice de proliferação celular e capacidade acentuada de disseminação. O LH pode acometer indivíduos de qualquer idade, sendo mais comum na faixa etária de 15 a 40 anos, podendo apresentar bom prognóstico quando tratado adequadamente.56
Os fatores de risco mais comumentes relacionados ao desenvolvimento dos diversos tipos de câncer não estão conectados ao surgimento do LH. Na verdade, pouco se sabe sobre o que causa esse tipo de linfoma. Porém, é descrito na literatura que infecções relacionadas aos vírus Epstein-Barr57,58 e HIV,59,60 podem aumentar o
risco de desenvolvimento da doença. No entanto, na maioria dos casos, o desenvolvimento dessa enfermidade está associada à herança genética.61
Os LH podem ser subdivididos em duas classes principais, classificados a partir da presença ou não das células Reed-Sternberg. Diferentemente dos linfócitos B normais, as células Reed-Sternberg são muito grandes e multinucleadas. Elas são encontradas caracteristicamente no denominado linfoma Hodgkin clássico.57 A
segunda classe linfoma Hodgkin é o nodular de predomínio linfócitário, tendo menor incidência que o LH clássico.57 A Figura 2 apresenta uma imagem histopatológica das
Figura 2. Imagens histopatológicas de (A) Células de Reed-Sternerg, binucleada com
nucléolos grandes (apontada pela seta). Essas células são características do linfoma Hodgkin clássico.57 (B) Células de linfoma Hodgkin, mononucleada mas com nucléolo proeminente.57 Disponível em: http://anatpat.unicamp.br/lamhemo11.html. Acesso em: 19 Mar 2019.
Geralmente o LH é tratado através de quimioterapia associada à radioterapia. Quando o paciente sofre recaída, dependendo do tratamento inicial adotado, é necessário o transplante de medula óssea.56 Nos últimos 50 anos, o número de casos
de LH permaneceu estável, enquanto a mortalidade foi reduzida em mais de 60% desde o início dos anos 70 devido aos avanços no tratamento.61
2.1.2.2. Linfoma não Hodgkin (LNH)
Por outro lado, o linfoma não-Hodgkin (LNH) é o tipo mais comum de câncer do sistema linfático,62 sendo a quarta neoplasia mais incidente nos Estados Unidos.52
Os LNH são agrupados de acordo com sua agressividade e são classificados dependendo do tipo celular que se originam: linfomas de células B (mais comuns), T ou NK. O linfoma anaplásico de grandes células (ALCL),63 por exemplo, é originado
de linfócitos T maduros,64 sendo classificado como Linfoma de grau intermediário. É
bastante comum em jovens e pode apresentar bom prognóstico se for diagnosticado em estágios iniciais e tratado adequadamente. A Figura 3 apresenta uma imagem histopatológica de um tipo de linfoma não-Hogdkin.
Figura 3. Imagem histopatológica de um tipo de linfoma não-Hodgkin. Disponível em:
https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Linfoma_n%C3%A3o_Hodgkin&oldid=53642025. Acesso em: 19 Mar 2019.
Atualmente, a quimioterapia é o principal tratamento utilizado para esse tipo de câncer, podendo ser empregada sozinha ou em conjunto com outras formas de terapia. Em 1969, o primeiro antibiótico antitumoral (doxorrubicina) se tornou disponível comercialmente e, após muitos testes clínicos, se mostrou ser um dos agentes terapêuticos mais efetivos para o tratamento de LNH.62 Alternativamente, a
imunoterapia tem sido utilizada em substituição aos fármacos quimioterápicos no tratamento dessa enfermidade, bem como, dependendo do acometimento do paciente, existe a possibilidade de transplante de medula óssea.65,66
2.1.3. Tratamento
Devido ao impacto na saúde e bem estar humano, não é nenhuma surpresa que a busca por terapias menos agressivas contra o câncer continua sendo um dos principais focos das indústrias farmacêuticas e da comunidade acadêmica.1
Atualmente, os tipos mais comuns de tratamento para o câncer são a quimioterapia, a radiação (radioterapia) e a cirurgia.2,67 Embora a intervenção cirúrgica (utilizada para
a remoção da massa tumoral) desempenhe um papel crucial no tratamento do câncer, muitos pacientes são diagnosticados quando a doença encontra-se em estágio
avançado ou metastásico, apresentando tumores/cânceres muitas vezes inoperáveis.67
Por isso, a quimioterapia é um dos métodos mais utilizados no tratamento do câncer, consistindo geralmente na combinação de dois ou mais agentes antitumorais.5,45 Como as células tumorais apresentam potencial replicativo ilimitado,
elas requerem biossíntese continua de material genético. Assim, a inibição da replicação do DNA proporciona uma abordagem lógica para retardar o crescimento do tumor, sendo um alvo bastante utilizado na quimioterapia do câncer.68
Historicamente, a mostarda nitrogenada (Mecloretamina, Mustargen®) foi
introduzida em 1942 como um dos primeiros agentes quimioterápicos.1 Ela é um
análogo do gás mostarda de enxofre altamente tóxico, utilizado como arma em 1917 durante a Primeira Guerra Mundial. O advento da mostarda nitrogenada foi o início da quimioterapia antineoplásica moderna e originou uma série de agentes terapêuticos mais eficazes e menos tóxicos que ainda estão em uso atualmente.68
Devido à sua ação inespecífica, a maioria dos agentes quimioterápicos é citotóxicos frente às células sadias.2,3,6 Além disso, para que o fármaco atinja o tecido
desejado em sua concentração terapêutica, é necessária a aplicação inicial de uma dosagem elevada.69 Ainda, devido à capacidade de proliferação acelerada e acúmulo
de mutações genéticas, as células cancerosas são capazes de desenvolver resistência ao tratamento quimioterápico, reduzindo a eficácia do fármaco.45
2.1.3.1. Doxorrubicina (DOX)
As antraciclinas estão entre as drogas anticancerígenas mais eficazes já desenvolvidas.70 As primeiras antraciclinas foram isoladas a partir da Streptomyces
peucetius no início da década de 60, e denominadas doxorrubicina (DOX) e daunorrubicina (DNR).71–73
A DOX, cuja estrutura química está representada na Figura 4, é um dos agentes quimioterápicos mais eficazes comumente utilizados no tratamento de diversos tipos de câncer,69,74,75 tais como sarcomas, câncer de mama, ovário, bexiga e tireóide, além
de ser muito utilizado no tratamento de leucemia e linfomas.34 Além disso, a DOX é
geralmente administrada em combinação com ciclofosfamida, vincristina, bleomicina ou prednisona (combinação denominada CHOP).76
Figura 4. Estrutura química do fármaco doxorrubicina (DOX).
Em 1995 foi aprovada a formulação lipossômica Doxil® para o tratamento de sarcoma Kaposi relacionado à AIDS em pacientes cuja quimioterapia não foi eficaz e a doença se tornou recorrente.70 No entanto, a utilização clínica das antraciclinas tem
sido limitada devido aos seus potenciais efeitos adversos.72 Dependendo da dosagem
utilizada e do tempo de exposição, a DOX apresenta elevada toxicidade,34 podendo
até mesmo ocasionar danos significativos no tecido cardíaco (cardiomiopatia).72
Apesar da ampla utilização clínica, os mecanismos de ação das antraciclinas nas células cancerígenas não são completamente compreendidos.71,72 De modo geral,
seu principal mecanismo de ação é através da interação com o sistema replicativo do DNA no núcleo celular.75,77 A molécula de DOX se intercala no DNA das células em
divisão rápida, inibindo a síntese de ácidos nucleícos, ocasionando morte celular.34
De acordo com a literatura, a DOX inibe a enzima topoisomerase II, ocasionando danos no DNA, favorecendo a indução de apoptose.70,72 Por outro lado, a toxicidade
cardíaca induzida pelo uso da DOX difere do mecanismo de ação antitumoral da mesma, sendo ocasionado pelo aumento do estresse oxidativo, regulação negativa de genes específicos do coração e indução de apoptose dos miócitos cardíacos.70,72
Como droga livre, apenas uma ínfima porção da dosagem administrada de DOX é capaz de atingir e atuar sobre o tumor de interesse, pois ela é facilmente eliminada do plasma e se acumula essencialmente no fígado.78
Dessa forma, as limitações associadas às formulações das drogas antitumorais convencionais têm levado ao desenvolvimento de novos sistemas para o tratamento do câncer, de forma a obter seletividade frente às células doentes, aumentando sua eficácia e reduzindo os efeitos adversos em células sadias.2,5,69 Assim, o
desenvolvimento da medicina personalizada é de fundamental importância para aprimorar o tratamento específico/seletivo de uma determinada enfermidade.79
Nesse contexto, sistemas de entrega de fármaco nanoparticulados têm se mostrado alternativas promissoras na terapia do câncer, pois podem ser sintetizados de maneira a atingir seletivamente as células tumorais, favorecendo a redução dos efeitos adversos ocasionados pelo tratamento quimioterápico convencional.45
2.2. Nanomateriais e materiais nanoestruturados
O progresso na área da nanotecnologia fez o início do século XXI ser conhecido como o século da nanotecnologia.80 O crescente interesse em materiais
nanoestruturados vem do fato de que as propriedades destes são diferentes e frequentemente superiores àquelas de materiais que apresentam estruturas na escala micrométrica.17 Estas propriedades surgem devido a um aumento substancial da
fração de átomos de superfície, aumentando os efeitos de superfície, tais como confinamento quântico em semicondutores,81 ressonância de plasmons de superfície
em metais82 e superparamagnetismo em materiais magnéticos.83 Além disso, as
dimensões nanométricas conferem uma área superficial maior que os materiais em bulk, permitindo assim que os nanomateriais interajam com uma maior quantidade (ou concentração) de espécies disponíveis no meio.
Nos últimos anos, a nanotecnologia têm impactado profundamente vários campos da medicina contemporânea,44,84,85 principalmente como metodologia
alternativa à quimioterapia devido às suas potenciais aplicações como carreadores de fármacos antitumorais.77,86 Os nanocarreadores podem aumentar a biodisponibilidade
e o tempo de liberação de moléculas terapêuticas, além de permitir a entrega seletiva de fármacos aos tecidos doentes.16,44,87,88
Do ponto de vista da farmacoterapia,89,90 um carreador ideal deve apresentar
fácil metodologia de preparação, ser biocompatível, ser capaz de proteger o fármaco contra degradação e liberação prematura, apresentar liberação continuada no sítio de ação, ser biodegradável e sua dispersão deve ser estável em fluidos humanos.90,91
Nos últimos anos, houve grandes avanços no desenvolvimento de nanopartículas orgânicas (lipossomas, nanopartículas poliméricas, micelas poliméricas, dendrímeros, etc.) e inorgânicas (metálicas, óxidos, etc.) para serem aplicadas como nanocarreadores.92 Enquanto as nanopartículas orgânicas geralmente apresentam
excelente biocompatibilidade, nanopartículas inorgânicas fornecem diversas vantagens em termos de funcionalidade e propriedades diferenciadas.92
2.3. Tipos de nanomateriais e materiais nanoestruturados
Apesar de inúmeras vantagens que os nanomateriais apresentam, apenas algumas formulações baseadas em nanoestruturas foram aprovadas para aplicações clínicas pela Food and Drug Administration (FDA, agência norte americana responsável pelo controle e supervisão produtos alimentares e farmacêuticos).93 A
Tabela 1 apresenta os tipos mais comuns de materiais estudados para a terapia do câncer, bem como suas vantagens e desvantagens.
Tabela 1. Tipos de nanomateriais e materiais nanoestruturados mais comumente utilizados
em pesquisas para o tratamento de câncer, suas vantagens e limitações94
Material Vantagens Limitações
Lipossomas São anfifílicos e, em geral, são
biocompatíveis
Podem apresentar estabilidade limitada
Polimérico Alguns são biodegradáveis e podem ser
funcionalizados
Alguns polímeros podem apresentar citotoxicidade
Micelas São biocompatíveis e podem ser
funcionalizadas
Podem apresentar estabilidade limitada
Metais Exibem excelentes propriedades ópticas
e podem ser funcionalizados
Apresentam tendência de aglomeração quando expostos
em ambiente fisiológico e não são biodegradáveis
Não metais
Podem ser sintetizados de maneira a obter boa estabilidade coloidal e podem apresentar propriedades físico-químicas
únicas
Geralmente não são biodegradáveis e alguns materiais podem apresentar
efeitos citotóxicos
Materiais híbridos
Combinam as propriedades de diferentes materiais, originando materiais únicos com aplicações teranósticas, diagnósticas
e para tratamento
As principais limitações dessa abordagem estão associadas à
metodologia de síntese e sua reprodutibilidade
Alguns desses sistemas nanométricos apresentam limitações que dificultam sua utilização como carreadores de fármacos,95 como por exemplo a instabilidade
o processo de manufatura dos nanocarreadores, pode ocasionar instabilidade química ou desnaturação do fármaco a ser encapsulado, alterando sua eficácia terapêutica.96
Os parâmetros de síntese e pós-síntese desses nanomateriais devem ser rigorosamente controlados, para evitar problemas como polidispersão, coexistência de diferentes formas das partículas sintetizadas, e a liberação prematura do fármaco encapsulado.91 Além disso, a modificação da superfície das nanoestruturas orgânicas
(polímeros, micelas, lipossomas) é mais complexa que a dos sistemas inorgânicos. Isso porque, geralmente requer múltiplas etapas de síntese química, que podem elevar o custo da produção, além de poder ocasionar à degradação ou liberação do fármaco encapsulado.96 Portanto, pesquisadores têm investido na síntese de
nanocarreadores inorgânicos que apresentem performance otimizada na entrega seletiva de agentes terapêuticos.93
2.4. Nanopartículas de sílica (SiO2NPs)
Recentemente, consideráveis avanços no desenvolvimento de nanomateriais inorgânicos para diagnósticos e aplicações terapêuticas foram observados. Para que sejam utilizados clinicamente, esses materiais devem apresentar biocompatibilidade, não ser citotóxicos,97 devem apresentar dispersões estáveis em ambientes
fisiológicos, de maneira a aumentar o tempo de circulação no sangue e favorecer o direcionamento seletivo de fármacos para os tecidos doentes.16
Dentre vários nanomateriais inorgânicos, as nanopartículas de sílica (SiO2NPs)
têm sido consideradas promissoras alternativas na síntese de nanocarreadores. As SiO2NPs apresentam estabilidade estrutural e química, assim como, sua síntese pode
ser facilmente escalonada.16,32,98,99 Além disso, são consideradas biocompatíveis e
sua toxicidade é dependente da sua cristanilidade, forma e concentração utilizada.100
Em geral, as SiO2NPs são degradadas em ácido ortossilícico (Si(OH)4), que é utilizado
pelo organismo humano na formação de proteínas de sustentação da pele, unhas e cabelos.99,101,102
Além do mais, a superfície das SiO2NPs pode ser facilmente modificada de
forma a melhorar sua dispersão coloidal, aumentar seu tempo de circulação sanguínea, controlar as possíveis interações com o meio biológico, além de possibilitar o encapsulamento de fármacos em seus poros e permitir a ligação com agentes de direcionamento seletivo.16 A habilidade de combinar essas propriedades
tornam as SiO2NPs plataformas promissoras para o desenvolvimento de novos
sistemas terapêuticos com efeitos adversos mínimos.16
2.4.1. Rotas sintéticas
Diversas rotas sintéticas têm sido desenvolvidas para a produção de nanopartículas com distribuição de tamanho estreita e composição uniforme. A maioria delas empregam o processamento sol-gel com cuidadoso controle da razão entre os reagentes e solventes. Além disso, podem ser utilizados templates de forma a controlar o tamanho das SiO2NPs e direcionar a formação de poros.16 A Figura 5
mostra um esquema das rotas de síntese mais comumente utilizadas para a obtenção das SiO2NPs.
Figura 5. Esquema das metodologias mais comumente utilizadas na síntese das
nanopartículas de sílica.16
2.4.2. Método Stöber
Do ponto de vista químico, a síntese de nanopartículas requer o uso de métodos que permitam o controle preciso do tamanho e da forma das estruturas. O método de Stöber,35 uma evolução e extensão da tese de doutorado de Gerhard Kolbe
(1956), foi desenvolvido e reportado em 1968, e continua sendo amplamente empregado na síntese de SiO2NPs. Werner Stöber e colaboradores desenvolveram o
método de síntese para a preparação de partículas de sílica coloidal através de reações de hidrólise e condensação de alcóxidos de silício.35 Devido à sua natureza
amorfa, o controle de tamanho e polidispersão durante a síntese é o maior desafio para a obtenção destas nanoestruturas.15
De acordo com a literatura,22 as duas etapas que controlam a morfologia das
estruturas de sílica são a velocidade de hidrólise do precursor alcoxisilano e a velocidade de condensação dos grupos silanóis (Si–OH) para formar as ligações Si-O-Si. Assim, primeiramente o precursor alcoxisilano hidrolisa na presença de álcool e os monômeros de Si(OH)x(OR)4-x hidrolisados se condensam para formar partículas
elementares de sílica.15 A Figura 6 mostra o mecanismo de reação de hidrólise básica
onde são formados os silanóis.
OH Si RO OR OR OR Si RO OR OR OR HO - RO Si HO OR OR OR
Figura 6. Mecanismo de reação de hidrólise básica, responsável pela formação dos
silanóis,onde R corresponde à cadeia carbônica do precursor alcoxisilano.103
A Figura 7 mostra o possível mecanismo de condensação de dois grupos silanóis, formando a estrutura básica que compõe as nanopartículas de sílica.
Si HO OH O OH Si HO OH OH OH - OH Si HO OH O OH Si OH OH OH
Figura 7. Mecanismo de condensação de dois grupos silanóis, formando a estrutura básica
que compõe as nanopartículas de sílica.103
Os métodos convencionais de preparação de SiO2NPs são capazes de produzir
estruturas amorfas com uma variedade de formas e tamanhos.91 Nanopartículas de
sílica mesoporosas (NSMs) foram propostas pela primeira vez em 2001 como carreadores para moléculas terapêuticas.98 Inspirado por este conceito simples (na
época ainda sem controle sobre encapsulamento ou liberação de droga), muitos esforços foram feitos nos últimos anos para criar sistemas nanocarreadores multifuncionais e sensíveis a estímulos.98
De fato, as NSMs apresentam elevada área superficial, grande volumes de poros, e algumas NSMs possuem estruturas de poros altamente ordenadas e
tamanho de poro controlável.20–22,104 Quando comparado com outros nanocarreadores, as NSMs apresentam elevada estabilidade às mudanças de pH, ao estresse mecânico e às degradações por hidrólise, o que auxília na prevenção da degradação do fármaco aprisionado.105,106 Além disso, sua superfície pode ser
facilmente funcionalizada com moléculas ou grupos químicos que melhorem sua estabilidade coloidal ou até mesmo ajam como direcionadores seletivos para a entrega específica de agentes terapêuticos.105,106
Porém, para obter uma nanopartícula porosa bem estruturada, direcionadores de poros (templates) têm sido utilizados para o controle de porosidade das SiO2NPs.
Por isso, para o posterior encapsulamento do fármaco, o template geralmente é removido através de extração por solvente ou calcinação das nanopartículas.15 A
extração por solvente gera muitos resíduos prejudiciais ao meio ambiente, além de ser um processo demorado, podendo levar até semanas para a remoção total do template. A calcinação por sua vez, requer elevadas temperaturas (500 °C–900 °C), e pode ocasionar mudanças nas propriedades estruturais das nanopartículas, podendo até mesmo gerar impurezas nos poros do material.15
Dessa forma, a situação ideal na produção de nanopartículas para utilização biomédica é aquela onde a síntese é realizada através de um reduzido número de etapas e em total ausência de reagentes que apresentem toxicidade ao organismo humano. Assim, o método Stöber com algumas modificações foi adotado por Leirose et.al.15 para a produção de nanocarreadores alternativos às NSMs. Leirose et.al.15
propôs que quando o tetraetilortossilicato (TEOS) é misturado com etanol, domínios de nucleação são criados e formam partículas elementares. Em seguida, essas partículas crescem através dos monômeros hidrolisados, e se aglomeram após a adição de hidróxido de amônia (NH4OH), formando as SiO2NPs. Assim, o fármaco
pode ser aprisionado nos espaços intersticiais formados pelo empacotamento das partículas elementares, evitando a utilização de direcionadores de poros. A Figura 8 mostra um modelo esquemático da estrutura hierárquica das SiO2NPs.
Figura 8. Etapas da síntese das SiO2NPs. (A) O TEOS é misturado com o etanol e (B)
domínios de nucleação são criados, formando partículas elementares. (C) Em seguida, partículas elementares se aglomeram na presença de NH4OH formando as SiO2NPs. A
ampliação em (C) é um esquema da borda da nanopartícula formada pelas esferas elementares de sílica.15 Esse esquema é meramente ilustrativo e não está na proporção de
tamanho real do sistema.
2.4.3. Funcionalização da superfície das SiO2NPs
Um dos métodos mais comumente utilizado para funcionalização de superfície das SiO2NPs é através da reação de condensação dos grupos silanóis (Si-OH) na
superfície da sílica com diferentes alcoxisilanos, formando ligações Si-O-Si.107
Diferentes grupos funcionais (por exemplo, aminas, carboxilatos, epóxidos e tióis) podem ser combinados na modificação de superfície dos nanomateriais, de maneira a promover estabilidade coloidal, modular seu comportamento biológico, possibilitar posteriores acoplamentos com moléculas biológicas que agem como direcionadores seletivos.33
Por exemplo, SiO2NPs funcionalizadas com 3-aminopropiltrietoxissilano
(APTES), apresentam grupos -NH2 que possibilitam a realização de reações de
acoplamento ácido-base com grupos carboxila (-COOH) de moléculas direcionadoras. Essas reações utilizam comumente o reagente 3-(3-(dimetilamino)-propil)carbodiimida (EDC), que reage com o grupo carboxila para formar um intermediário (O-acilisouréia) altamente reativo. Esse intermediário reage com um nucleófilo, tal como uma amina primária, formando então uma ligação amida.108
A vantagem da utilização do EDC é sua solubilidade em água, permitindo a adição direta do reagente à mistura reacional sem dissolução prévia em solvente orgânico. Dessa forma, o EDC é um reagente apropriado para a conjugação de
moléculas bioativas.108 Além disso, o excesso de EDC e de isouréia formado como
subprodutos da reação são solúveis em água e são facilmente removidos por etapas de centrifugação/redispersão.108 O mecanismo de reação desse acoplamento está
representado nas Figuras 9, 10 e 11.
A primeira etapa da reação de acoplamento (Figura 9), envolve a protonação da carbodiimida (EDC), originando o carbocátion representado em 1, que é hidrolisado, formando um derivado de uréia, representado em 2:109
Figura 9. Primeira etapa da reação de acoplamento. Inicialmente, ocorre a protonação da
carbodiimida (EDC), originando o carbocátion representado em 1, que é hidrolisado, formando um derivado de uréia em 2.109
Posteriormente, o grupo ácido carboxílico (-COOH) reage com o carbocátion 1, através do ataque nucleofílico do grupo carboxilato, originando O-acilisouréia, representada em 3, como mostra a Figura 10.109
R O OH R O O NH C N R1 R2 R O O HN C N R1 R2 1 3
Figura 10. O ácido carboxílico reage com o carbocátion 1 através do ataque nucleofílico do
grupo carboxilato, originando O-acilisouréia em 3.109
A O-acilisouréia (representada em 3) é um intermediário reativo que pode ser facilmente atacado por nucleófilos (por exemplo, -NH2, H2O, etc). Como a reação
ocorre em meio aquoso, esse intermediário pode ser atacado pela água, sofrendo hidrólise, o que causa a inativação do EDC.109
Por isso, é comum utilizar a N-hidróxisuccinimida (NHS) nessa reação, pois ela forma um éster mais estável (quando reage com a O-acilisouréia), menos sensível à
N C N R1 R2 H+ NH C N R1 R2 1 NH C N R1 R2 O H H N C N R1 R2 O H H H+ N C N R1 R2 H O H2O 2 EDC H H
hidrólise e mais reativo frente às aminas primárias, facilitando a reação de acoplamento. Além disso, esse composto formado também é estericamente impedido, dificultando possíveis rearranjos, por sua vez facilitando a formação da ligação amida, como mostra a Figura 11.109
Figura 11. Mecanismo de reação entre a O-acilisouréia e o NHS. Quando o NHS reage com
a O-acilisouréia, um éster bastante estável é formado. Como o composto também é estericamente impedido, dificulta possíveis rearranjos e facilita a formação da ligação amida.109
2.4.3.1. Coroa de proteínas
Quando nanopartículas são expostas a fluidos biológicos elas podem ser rapidamente recobertas por uma coroa de proteínas devido à interação entre as superfícies dos nanomateriais e as proteínas presentes no meio biológico.110,111 Essa
coroa altera a identidade biológica dos materiais, frequentemente causando respostas biológicas indesejáveis.112,113 Dessa forma, é de fundamental importância a prevenção
de interações não específicas com biomoléculas, pois as propriedades da superfície das SiO2NPs desempenham um papel fundamental na sua interação com sistemas
biológicos.85,114 A Figura 12 apresenta uma representação esquemática da formação
da coroa de proteínas. H NH R O O HN C N R1 R2 3 N O O HO H R O HN C N R1 R2 O N O O O H+ N C N R1 R2 H O 2 R O N O O O H2N R3 H R O N O O O H+ N O O HO R O N H R3 NHS NHS Amida R3
Figura 12. Representação esquemática da formação da coroa de proteínas ao redor das
nanopartículas. Esse esquema é meramente ilustrativo e não está na proporção de tamanho real do sistema.
A estratégia mais comumente utilizada para evitar a adsorção inespecífica de proteínas é a funcionalização da superfície com grupos químicos que minimizem a interação com as biomoléculas.115 Nesse contexto, a funcionalização das SiO2NPs
com polietilenoglicol (PEG) é amplamente utilizada, pois melhora a estabilidade biológica e tempos de circulação sanguínea quando comparado a muitas outras funcionalidades.116,117
No entanto, nanopartículas PEGuiladas podem ser reconhecidas pelo sistema imunológico o que reduz sua eficácia biológica.118,119 Como alternativa, moléculas
zwitteriônicas têm sido propostas como promissoras na prevenção de interações inespecíficas entre os nanomateriais e os sistemas biológicos.120,121 Usualmente, são
utilizadas duas famílias de zwitteriônicos: betaínas (carboxibetaínas, fosfobetaínas, sulfobetaínas) e aminoácidos.122,123
Embora esses recobrimentos reduzam ou previnam a formação da coroa de proteínas, esses ligantes geralmente dificultam posteriores funcionalizações.124
Assim, a dupla funcionalização da superfície, com grupos químicos distintos, permite um melhor ajuste das propriedades da superfície das nanopartículas, controlando sua biocompatibilidade, ao mesmo tempo que mantém grupos funcionais reativos que permitem posteriores funcionalização com agentes direcionadores.125
2.5. Anticorpos
Anticorpos, ou imunoglobulinas (Ig), são glicoproteínas sintetizadas pelos linfócitos B e possuem características-chave estruturais e funcionais.84,126
Funcionalmente, eles podem ser caracterizados por sua habilidade de se ligar tanto à antígenos solúveis quanto à antígenos presentes na membrana de células especializadas ou microorganismos.126
A forma simplificada de uma molécula de anticorpo é um “Y” com dois sítios idênticos de ligação a antígenos, um em cada extremidade dos braços do “Y”.49 Os
anticorpos são divididos em cinco classes principais (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), cada qual caracterizado por unidades estruturais únicas. A Figura 13 apresenta uma representação esquemática das diferentes classes de anticorpos.
Figura 13. Representação esquemática das diferentes classes de anticorpos. Adaptado de
https://www.onlinebiologynotes.com/antibody-structure-classes-functions/. Acessado em: 20 Mar 2019.
Anticorpos IgG consistem de quatro cadeias de proteínas, duas cadeias leves idênticas (cada uma contendo em torno de 220 aminoácidos) e duas cadeias pesadas idênticas (cada uma contendo em torno de 440 aminoácidos). Essas cadeias são unidas por ligações dissulfeto e outras interações não covalentes. Os dois domínios que carregam o sítio de ligação do antígeno são conhecidos como fragmentos Fab
(do inglês antigen binding) e o domínio proteíco envolvido na regulação imunológica é chamado de Fc (do inglês crystallisable).49,126,127
Todas as classes de anticorpos podem ser expressas na membrana celular ou em sua forma solúvel.49 Os anticorpos não reconhecem o antígeno na sua
globalidade, mas apenas certas porções dele, denominada epítopo. A interação entre o anticorpo e o epítopo é altamente específica, tornando a utilização de anticorpos no tratamento de neoplasias uma alternativa muito atrativa.126
2.5.1. Terapias com anticorpos
A introdução de proteínas terapêuticas na rotina da medicina convencional ocasionou uma grande revolução no tratamento de muitas enfermidades.128
Atualmente, a imunoterapia vêm sendo estabelecida como um componente essencial no tratamento de diversos tipos de câncer, pois as células cancerosas expressam uma variedade de proteínas que podem ser reconhecidas pelo sistema imunológico.129
Os anticorpos apresentam a vantagem de seus sítios de ligação serem específicos, o que favorece a redução dos efeitos adversosobservados pela ação inespecífica da maioria dos fármacos quimioterápicos.128 Em 2018, a imunoterapia
recebeu o prêmio Nobel de Medicina, pelos estudos de Dr. James P. Allison sobre as moléculas anti-CTLA-4130 e do Dr. Tasuku Honjo pelo desenvolvimento dos
compostos anti-PD-1.131
2.5.2. Anticorpos monoclonais (mAbs)
A produção dos anticorpos monoclonais (mAbs) foi um grande avanço no diagnóstico clínico, purificação de proteínas, design de novas tecnologias e no tratamento de doenças.127 Os primeiros mAbs foram produzidos por Milstein e Köhler
(Cambridge University), que ganharam o prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina em 1984.132 Os mAbs são classificados basicamente em murinos, quiméricos,
humanizados e humanos.128
Os mAbs murinos são originados a partir de células de camundongos e causam resposta imunogênica nos seres humanos, sendo rapidamente eliminados do corpo.128 Com o intuito de minimizar seus efeitos adversos, pesquisadores
imunogenicidade, por sequências proteícas humanas, mantendo a elevada especificidade e afinidade para o antígeno alvo.128
Atualmente, já é possível criar anticorpos monoclonais completamente humanos, utilizando camundongos transgênicos ou a tecnologia de phage display (técnica de biologia molecular, que permite selecionar e isolar vetores de clonagem gerados a partir de bibliotecas genômicas).128
2.5.3. Tecnologia de Hibridoma
Em 1975, Georges J. F. Kohler e César Milstein relataram a produção de mAbs através da tecnologia de hibridoma.132 Hibridomas são células especializadas capazes
de produzir anticorpos monoclonais específicos em grande quantidade, que irão reconhecer seletivamente um único tipo de antígeno.133
Nessa técnica ocorre a hibridização celular somática, gerando os hibridomas, que produzem anticorpos e linhagens celulares de replicação contínua.132 A Figura 14
mostra uma representação esquemática das etapas da produção dos mAbs através da tecnologia dos hibridomas.
Figura 14. Representação esquemática da tecnologia dos hibridomas usado para produzir
