Capítulo 4
Resultados e
Discussão
Resultados e Discussão 54
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação dos ácidos graxos de L. theobromae
A avaliação dos ácidos graxos produzidos por L. theobromae foi feita utilizando- se os meios de cultura líquidos batata, peptona e Czapeck (Item 5.9, Pág. 177). Além de variar o meio de cultura, também foi variada a fonte de açúcar nesses meios, sendo utilizado glicose e manitol. Assim, este estudo envolveu o cultivo de L. theobromae em 6 meios diferente: batata-glicose - BG, batata-manitol - BM, peptona-glicose - PG, peptona-manitol - PM, Czapeck-glicose - CGL e Czapeck-manitol - CM.
4.1.1 Produção de massa micelial
Com 7 dias de crescimento fúngico, foi possível observar diferenças na massa micelial produzida. Visualmente, as culturas à base de caldo de batata (BG e BM) (Figura 10) e peptona (PG e PM) (Fig. 11, Pág. 55) apresentaram crescimento superior àquelas cultivadas em meio de cultura Czapeck (CGL e CM) (Fig. 12, Pág. 55). Diferenças na produção de massa micelial desse tipo são esperadas, uma vez que a composição dos meios de caldo de batata e peptona é bem mais abundante em nutrientes do que o meio Czapeck, que é formado a base de sais. Não foi possível observar diferenças significativas entre os meios no que se refere ao açúcar utilizado, glicose ou manitol.
BG BM
Resultados e Discussão 55
PG PM
Figura 11: Meios de cultura utilizando peptona.
CGL CM
Figura 12: Meios de cultura utilizando Czapeck.
A avaliação final das culturas fúngicas foi realizada com 15 dias (SOMASHEKAR et. al., 2001) e, após separação do meio de cultura do micélio por filtração à vácuo, algumas observações acerca das massas miceliais obtidas foram feitas.
A análise da Tabela 5 (Pág. 56), que representa os valores médios das massas miceliais secas obtidas nos seis meios de cultura utilizados, revela que o crescimento fúngico foi mais acentuado quando se utilizou o meio líquido a base de peptona. O caldo de batata apresentou valores intermediários de massa micelial, quando comparado com os outros dois meios de cultura, enquanto que o meio Czapeck forneceu os menores valores de massa fúngica (Fig. 13, Pág. 56) e esses resultados foram independentes da fonte de açúcar utilizada. Dessa forma, os resultados obtidos com 15 dias de análise continuaram semelhantes àqueles observados com 7 dias.
Resultados e Discussão 56
Tabela 5: Valores médios das massas miceliais secas (g) com 15 dias de crescimento.
Czapeck Peptona Caldo de Batata Glicose
(CGL) Manitol (CM) Glicose (PG) Manitol (PM) Glicose (BG) Manitol (BM)
0,88 0,42 2,01 2,23 1,78 1,07
Figura 13: Massas miceliais: (1) BG; (2) BM; (3) PG; (4) PM; (5) CGL; (6) CM em sextuplicata.
Outro fator importante observado foi a diferença entre o aspecto dos meios de culturas obtidos após a separação do micélio (Fig. 14, Pág. 57), indicando que o fungo apresenta comportamento diferente dependendo do meio utilizado. Dentre os meios empregados, o que chamou mais atenção foi o meio de peptona com glicose como fonte de açúcar. Nesse meio houve a liberação de um pigmento azul pelo fungo para o meio de cultura. Uma alíquota desse meio foi submetida à partição líquido-líquido com AcOEt. Após secagem com sulfato de sódio anidro e destilação do solvente o pigmento foi decomposto rapidamente, tornando impossível sua análise.
1 2 3 4 5 6
Resultados e Discussão 57
Figura 14: Meios de cultura: (1) BG; (2) BM; (3) PG; (4) PM; (5) CGL; (6) CM em sextuplicata
4.1.2 Obtenção de extratos fúngicos
Para a análise dos ácidos graxos, todos os micélios oriundos de 15 dias de crescimento foram extraídos com a mistura CHCl3/MeOH 2:1 (FOLCH; LESS; STANLEY, 1956; PUPIN et. al., 2000; KONOVA et. al., 2002; BATRAKOV et. al., 2004) e, após destilação do solvente foram obtidas as massas (valores médios) apresentadas na Tabela 6. Tabela 6: Valores médios dos extratos fúngicos (mg) com 15 dias de crescimento.
Czapeck Peptona Caldo de Batata Glicose
(CGL) Manitol (CM) Glicose (PG) Manitol (PM) Glicose (BG) Manitol (BM)
458,1 62,6 251,4 160,1 528,7 248,4
As maiores massas de extratos foram obtidas dos meios que empregaram glicose como fonte de açúcar. Embora o cultivo em peptona tenha produzido a maior massa micelial (Tab. 5, Pág. 56), os micélios oriundos dos cultivos em BG e CGL foram os que produziram as maiores quantidades de extratos (Tabela 6). No caso do extrato oriundo em CGL, vale ressaltar que a massa extraída equivale a quase 50% da massa micelial.
Resultados e Discussão 58
4.1.3 Partição dos extratos fúngicos
Um dos extratos de cada meio de cultura foi dissolvido em CHCl3/MeOH 2:1 e particionado com CaCl2 0,2%, como descrito no Item 5.9.1 (Pág. 178). O objetivo dessa extração foi a separação entre os compostos mais polares e os lipídeos, que deveriam permanecer na fase orgânica (Tabela 7). Comparando-se as massas dos extratos obtidos, verificou-se que na extração do extrato CGL, a quantidade de material extraído foi muito pequena em relação à massa inicial (Tab. 30, Pág. 178), sendo am maioroia dos compostos presentes no extrato do meio CGL polares.
Tabela 7: Extratos orgânicos (mg) obtidos da partição com CaCl2 0,2%.
Czapeck Peptona Caldo de Batata Glicose
(CGL) Manitol (CM) Glicose (PG) Manitol (PM) Glicose (BG) Manitol (BM)
20,1 11,8 154,1 197,6 319,9 117,9
4.1.4 Fracionamento do material lipídico
A análise dos extratos fúngicos por CCDA, mostrou a existência de três classes de lipídeos com polaridades diferentes. Como a maioria dos lipídeos apresenta-se na forma de mono-, di- e triacilglicerídeos, além de ácidos graxos livres, foi possível sugerir que os compostos observados por CCDA tratavam-se dessas classes de lipídeos. Sendo assim, os extratos fúngicos foram submetidos a um fracionamento cromatográfico para separação das classes de lipideos (Item 5.9.1, Pág. 178). Nesse tratamento cromatográfico em coluna aberta, foram utilizados hexano/CHCl3 10%, AcOEt e MeOH como eluentes, obtendo-se 3 frações
As amostras oriundas do meio Czapeck (CGL e CM) não foram fracionadas, pois a pequena quantidade de material tornaria inviável a análise das suas frações. Logo, todas as metodologias aplicadas às frações obtidas das demais amostras foram realizadas com CGL e CM não fracionadas.
Resultados e Discussão 59
4.1.5 Identificação dos ácidos graxos
As duas frações menos polares do fracionamento cromatográfico (hexano/CHCl3 10% e AcOEt), bem como as amostras CGL e CM, foram submetidas à saponificação seguida de metilação (Item 5.9.2 e 5.9.3, Pág. 179) e reação de sililação (Item 5.9.4, Pág. 180). A primeira derivação teve como objetivo identificar os ácidos graxos que estavam na forma de glicerídeos, enquanto a reação de sililação objetivou analisar os ácidos graxos na forma livre. Vale ressaltar que a fração mais polar, oriunda da extração com MeOH, não foi empregada para identificação de ácidos graxos por tratar-se segundo a literatura de fosfolipídeos (FAKAS et. al., 2007).
4.1.5.1 Ésteres metílicos
A identificação dos ácidos graxos na forma de ésteres do glicerol foi feita através da análise dos cromatogramas (Fig. 15-24, Pág. 62-66) e dos espectros de massas (Fig. 25-29, Pág. 67 e 68) dos respectivos ésteres metílicos.
As Tabelas 8 e 9 mostram os ácidos graxos detectados na forma de ésteres metílicos. Foi possível identificar os ésteres metílicos dos seguintes ácidos: ácido hexadecanóico (C16:0, ácido palmítico), ácido octadecanóico (C18:0, ácido esteárico), ácido 9-octadecenóico (C18:1, ácido oléico) e ácido 9-12-octadecadienóico (9,12-C18:2, ácido linoléico). Todos esses ácidos graxos são geralmente relatados em altas concentrações na composição lipídica de fungos (COX; SCHERM; RILEY, 2006). Não foi possível definir a identidade do ácido graxo com TR=23,6 min.
Como as amostras CGL e CM não foram fracionadas, seus resultados não estão descritos nas Tabela 8 e 9. A análise dos cromatogramas dessas amostras (Fig. 19 e 20, Pág. 64), denominadas CGL1 e CM1, mostra a presença de diversos sinais não atribuídos a ésteres metílicos de ácidos graxos, provavelmente compostos pertencentes a outras classes de substâncias. Nessas amostras, o único ácido graxo detectado foi o ácido hexadecanóico (C16:0).
Analisando a Tabela 8, referente aos ácidos graxos das frações eluídas com hexano/CHCl3 10%, observou-se que as frações BG1, BM1 e PM1 apresentam a mesma composição de ácidos graxos e o percentual relativo entre esses ácidos graxos é muito semelhante. Diferentemente desses resultados, na fração PG1 foi detectado apenas o ácido hexadecanóico. É importante lembrar que nessa cultura houve a liberação de um pigmento
Resultados e Discussão 60
azul pelo micélio para o meio de cultura, podendo a formação do pigmento ter influenciado a composição lipídica do fungo.
Tabela 8: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres metílicos eluídos com hexano/CHCl3 10%.
Ácido graxo TR* (min) BG1 BM1 PG1 PM1
Ácido hexadecanóico (C16:0) 23,9 62,9 66,7 100 56,6 Ácido 9-octadecenóico (9-C18:1) 26,1 32,0 26,9 ND 34,5 Ácido octadecanóico (C18:0) 26,4 5,1 6,4 ND 8,9
TR = tempo de retenção; ND: não detectado
Nas frações eluídas com AcOEt (Tab. 9, Pág. 60) não foram encontradas semelhanças entre os ácidos graxos. Dessas frações, destaca-se a fração BG2, que além dos ácidos graxos já detectados, apresentou o ácido 9,12-octadecadienóico em sua composição, enquanto a fração BM2 apresentou apenas o ácido hexadecanóico. As culturas oriundas do caldo de peptona também mostraram algumas particularidades. Enquanto a fração menos polar, oriunda do cultivo com glicose (PG1), apresentou apenas o ácido hexadecanóico, em PG2 foram detectados os mesmos ácidos graxos presentes nas outras frações de menor polaridade, porém em proporções diferentes. Já a fração BM2 mostrou apenas os ácidos hexadecanóico e 9-octadecenóico, que são os majoritários nas frações de menor polaridade. Tabela 9: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres metílicos eluídos com AcOEt
Ácido graxo TR* (min) BG2 BM2 PG2 PM2
NI Ácido hexadecanóico (C16:0) 23,6 23,9 9,3 53,5 ND 100 ND 64,7 ND 77,7 Ácido 9,12-octadecadienóico (C18:2) Ácido 9-octadecenóico (9-C18:1) 26,0 26,1 9,3 18,6 ND ND ND 23,4 ND 22,4 Ácido octadecanóico (C18:0) 26,4 9,3 ND 11,9 ND
Resultados e Discussão 61
4.1.5.2 Ésteres de trimetilsilila
Para a identificação dos ácidos graxos livres, as frações derivadas do fracionamento cromatográfico foram submetidas à reação de sililação, sendo os ácidos graxos identificados na forma de ésteres de trimetilsilila. A análise dos cromatogramas (Fig. 30-34, Pág. 69-71) e dos espectros de massas (Fig. 35-37, Pág. 72) mostraram que as frações menos polares, eluídas com hexano/CHCl3 10%, são pobres em ácidos graxos livres, com exceção da fração BM3 na qual foi detectado o ácido hexadecanóico. Já as frações eluídas com AcOEt, que representam os ácidos graxos mais polares, tiveram o ácido hexadecanóico como majoritário em todas as amostras, sendo o único detectado na amostra BG4. O ácido octadecanóico também foi observado nas demais amostras e, na amostra BM4 um ácido graxo não identificado foi detectado. Esses resultados estão apresentados nas Tabelas 10 e 11.
Quanto as amostras CGL e CM, oriundas do cultivo em Czapexk, não foram detectados ésteres de trimetilsilila nos cromatogramas analisados (CGL3 e CM3), o que indica a ausência de ácidos graxos livres.
Tabela 10: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres de trimetilsilila eluídos com hexano/CHCl3 10%
Ácido graxo TR* (min) BG3 BM3 PG3 PM3
Ácido hexadecanóico (C16:0) 25,5 100 ND ND ND
TR = tempo de Retenção; ND: não detectado
Tabela 11: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres de trimetilsilila eluídos com AcOEt
Ácido graxo TR* (min) BG4 BM4 PG4 PM4
Ácido hexadecanóico (C16:0) 25,5 100 67,0 54,5 57,8 NI 27,4 ND 22,7 ND ND Ácido octadecanóico (C18:0) 27,6 ND 10,3 45,4 42,2
Resultados e Discussão 62
Figura 15: Cromatograma dos ésteres metílicos de BG1.
Resultados e Discussão 63
Figura 17: Cromatograma dos ésteres metílicos de PG1.
Resultados e Discussão 64
Figura 19: Cromatograma dos ésteres metílicos de CGL1.
Resultados e Discussão 65
Figura 21: Cromatograma dos ésteres metílicos de BG2.
Resultados e Discussão 66
Figura 23: Cromatograma dos ésteres metílicos de PG2.
Resultados e Discussão 67
Figura 25: Espectro de massas do hexadecanoato de metila.
Figura 26: Espectros de massas do éster metílico não identificado.
Figura 27: Espectro de massas do octadecanoato de metila.
CH3OOC
Resultados e Discussão 68
Figura 28: Espectro de massas do 9,12-octadecadienoato de metila.
Figura 29: Espectro de massas do 9-octadecenoato de metila. CH3OOC
Resultados e Discussão 69
Figura 30: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de BM3.
Resultados e Discussão 70
Figura 32: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de BM4.
Resultados e Discussão 71
Resultados e Discussão 72
Figura 35: Espectro de massas do hexadecanoato de trimetilsilila.
Figura 36: Espectro de massas do octadecanoato de trimetilsilila.
Figura 37: Espectros de massas do éster de trimetilsilila não identificado.
(CH3)3SiOOC
Resultados e Discussão 73
4.2 Cultivo fúngico e isolamento de metabólitos secundários 4.2.1 Cultivo de L. theobromae em Czapeck
4.2.1.1 Isolamento de LC1 e LC2 (Nunes et. al., 2008)
Os extratos AcOEt do meio líquido e EtOH do micélio, oriundos do crescimento de L. theobromae em Czapeck (Item 5.10.1, Pág. 181), foram agrupados e submetidos a sucessivos fracionamentos cromatográficos em gel de sílica levando ao isolamento de 6,9 mg de LC1 (Item 5.10.1.3, Pág. 183) e 4,0 mg de LC2 (Item 5.10.1.5, Pág. 184). LC1 apresentou- se com um sólido amorfo branco com faixa de fusão de 115,7 - 117,3 oC e LC2 como um sólido amorfo amarelado com faixa de fusão de 113,8 - 115,1 oC.
4.2.1.1.1 Identificação de LC11
O espectro de absorção na região do IV (Fig. 43, Pág. 79) de LC1 apresentou, dentre outras, uma banda em 3300 cm-1 de estiramento O-H (ν
OH), uma banda em 3041 cm-1 de Csp2-H (νCsp2-H), estiramentos em 2958, 2928 e 2872 cm-1 de ligação Csp3-H (νCsp3-H),
bandas associadas a estiramentos C=O (νC=O) 1643 e 1708 cm-1 e banda em 1212 cm-1 de estiramento C-O (νCO).
O espectro de RMN 13C - BB (Fig. 45, Pág. 80) de LC1 apresentou 23 sinais, dos quais um foi associado a carbono sp3 oxigenado (69,8 δ), dez relativos a carbonos sp2 (181,5 – 121,1 δ) dos quais dois apresentaram deslocamento característico de carbonila (181,5 e 197,9 δ) e doze atribuídos a carbonos sp3 (44,1 – 11,2 δ).
A análise do espectro de RMN 1H (Fig. 44, Pág. 79) de LC1 mostrou a presença de cinco hidrogênios olefínico em 6,21 δ (1H, sl); 6,24 δ (1H, dd, J = 5,0 e 9,8); 6,30 δ (1H, d, J = 0,4 Hz); 6,45 δ (1H, ddl, J = 0,6 e 9,8 Hz) e 6,56 δ (1H, dq, J = 1,4 e 10,0 Hz). Foram observados sinais em 5,48 δ (1H, t, J = 5,0 Hz) e 2,63 δ (1H, m). Seis metilas em 1,43 δ (3H, s), 1,19 δ (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,00 δ (3H, d, J = 6,6 Hz), 0,84 δ (3H, d, J = 7,1 Hz) , 0,84 δ (3H, d, J = 6,2 Hz) e 1,88 (3H, d, J = 1,4) foram observadas e, segundo a constante de acoplamento e deslocamento químico, esta última pertence a um sistema alílico.
Resultados e Discussão 74
De acordo com os dados de RMN 1H e 13C pôde-se sugerir a fórmula molecular C23H32O4, a qual está de acordo com a razão m/z 373,7 daltons [M+H]+ obtida no espectro de massas de LC1 (Fig. 49, Pág. 82) adquirido por ionização química a pressão atmosférica (APCI) no modo positivo.
A análise do mapa de correlação homonuclear 1H x 1H (Fig. 46, Pág. 80) de LC1, obtido através do experimento COSY, mostrou o acoplamento do hidrogênio em 6,56 δ com os hidrogênios em 2,63 e 1,88 δ. Através dessa última correlação pôde-se confirmar a natureza vinílica da metila em 1,88 δ, observou-se ainda a correlação do hidrogênio em 2,63 δ com a metila em 1,00 δ, indicando sua posição nesse sistema. A correlação homonuclear do hidrogênio em 5,48 δ com os hidrogênios em 6,24 e 2,11 δ bem como a correlação dos hidrogênios olefínicos em 6,24 e 6,45 δ e dos hidrogênios em 1,19 e 2,11 δ, mostrando a natureza vicinal entre o carbono oxigenado e um carbono olefínico. Através dessas correlações foi possível estabelecer as sub-estruturas I e II para LC1 (Figura 38).
CH3 CH3 H H 6,56 2,63 1,88 1,00 CH3 H H H O H 6,45 6,24 5,48 2,11 1,19 I II
Figura 38: Sub-estruturas I e II para LC1 propostas segundo o mapa de correlação homonuclear 1H x 1H de LC1.
Através da comparação entre o espectro de RMN 13C – BB de LC1 e o mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (Fig. 47, Pág. 81) a uma ligação de LC1, obtido através do experimento HSQC, foi possível estabelecer a conectividade entre os hidrogênios e seus respectivos carbonos (1J), bem como confirmar a identidade dos carbonos não hidrogenados
(Tab. 12, Pág. 78).
No mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (Fig. 48, Pág. 81) a longa distância de LC1, obtido através do experimento HMBC, foram observadas várias correlações. Algumas merecem destaque, pois foram determinantes na elucidação total das sub-estruturas propostas. O hidrogênio alílico em 2,63 δ apresentou correlação com os carbonos em 20,4 (2J); 149,6 (2J) e 125,7 δ (3J) corroborando a sub-estrutura I, além de mostrar o acoplamento
Resultados e Discussão 75
com o carbono em 44,1 δ (2J). Observou-se também, acoplamento dos hidrogênios que estão
na forma de multipletos em 1,40-131 δ e 1,17-1,10 δ com o carbono em 32,0 δ (2J), 1,34-1,29
δ e 1,17-1,10 δ com o carbono em 19,2 δ (3J). Os hidrogênios metílicos em 0,84 δ acoplam
com os carbonos em 30,0 δ (2J) e 32,4 δ (3J). Outra correlação importantíssima observada é o
acoplamento do hidrogênio em 6,56 δ com a carbonila de éster em 167,9 δ (3J). Das
observações feitas, conclui-se que a sub-estrutura I fazia parte de uma cadeia lateral com onze carbonos, a qual está representada na Figura 39. Esse tipo de cadeia ligada em C-3 é a mesma encontrada na eremoxilarina B (74), um sesquiterpeno eremofilano isolado do fungo endofítico xilariaceou YUA-026 (SHIONO; MURAYAMA, 2005).
H3C O O H H H 2,63 149,6 125,7 44,1 20,4 0,84 1,34-1,29 1,17-1,10 30,0 32,4 19,2 1,40-1,31 1,17-1,10 32,4 6,56 167,9O O H H H
Figura 39: Correlações a longa distância da cadeia lateral de LC1.
O assinalamento completo da sub-estrutura II foi feito pela análise das demais correlações a longa de distância, observadas no mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (Fig. 48, Pág. 81) de LC1. O hidrogênio olefínico em 6,45 δ apresentou acoplamentos com os carbonos em 130,0 (2J) e 131,9 δ (3J), além de acoplamentos com os carbonos 163,8 (3J);
122,7 (3J) e 41,3 δ (3J) (Fig. 40, Pág. 76). Foram também observadas correlações do
hidrogênio em 2,11 δ com os carbonos em 11,7 (2J); 41,3 (2J); 24,0 (3J); 121,0 (3J) e 163,8 δ
(3J). Além dessas correlações, aquelas entre o hidrogênio em 6,21 δ com os carbonos em
163,8 (2J); 130,0 (3J); 41,3 (3J) e 146,5 δ (3J) e o hidrogênio em 6,30 δ com os carbonos 41,3
(2J); 146,5 (2J); 24,0 (3J); 163,8 (3J); 181,4 (3J) (Fig. 46, Pág. 80) nos levaram a sugerir a
presença de um sistema -hidroxidienona com um oxigênio enólico característico de um grupo diosfenólico (SCHNEIDER; VILJOEN, 2002)
Resultados e Discussão 76 O O H O H 6,4 5 13 1,9 16 3,8 6 9,8 4 1,3 12 2,7 O OH O H 2,11 163,8 11,7 24,0 41,3 6,21 41,3 163,8 146,5 130,0 O OH O H O OH O H 6,30 41,3 24,0 163,8 181,4 146,5
Figura 40: Acoplamentos a longa distância da sub-estrutura III.
Através dos dados espectrométricos, sugeriu-se que LC1 tratava-se de um sesquiterpeno eremofilano, com uma cadeia lateral insaturada ligada em C-3, chamado 2’,4’,6’-trimetiloct-2-enoato de 1,2,6,8a-tetrahidro-7-hidroxi-1,8a-dimetil-6-oxo-2-naftalenila (Figura 41) inédito na literatura. A proposta de fragmentação (Esq. 11, Pág. 82) sugerida para o espectro de massas (Fig. 49, Pág. 82) de LC1 confirmam essa estrutura.
O O OH O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 10' 11'
Figura 41: Estrutura do trinorsesquiterpeno eremofilano.
A configuração relativa de LC1 foi determinada utilizando RMN de 1H, através do experimento nOe difference. A irradiação de H-3 em 5,48 δ aumentou a intensidade dos sinais de H-2, H-4 e 3H-C12 (Fig. 50a, Pág. 84). Quando H-6 é irradiado os sinais dos hidrogênios metílicos em C-11 e C-12 apresentaram um aumento em seus sinais (Fig. 50b, Pág. 83). Isso indica que esses grupos estão próximos espacialmente. Finalmente, a iradiação de H-4 produz um aumento dos hidrogênios H-3 e 3H-C12 (Fig. 50c, Pág. 83). Todos os efeitos nOe observados estão de acordo com os resultados dos cálculos computacionais.
Resultados e Discussão 77
Como esperado, os átomos que formam a porção diosfenólica são co-planares e os orbitais p da dupla ligação ∆1,2 estão paralelos a ∆9,10. Através desses resultados sugeriu-se a estereoquímica relativa de C-3, C-4 e C-5 (Figura 42) que está de acordo com a estrutura de outros eremofilanos fúngicos (39-78). A determinação da estereoquímica dos centros C-4’ e C-6’ da porção ácida do éster não foi deduzida por meios desse experimento, uma vez que as informações obtidas não foram suficientes. A rotação ótica de LC1 observada foi de [α]D = +0.246 (c 0.05, CHCl3).
O O
OH O
Resultados e Discussão 78 Tabela 12: Dados de RMN de 1H e 13C (δ) de LC1. HSQC HMBC C 1Ha 13Cb 2 Ja 3Ja 1 6,45 (1H, ddl, J = 0,6 e 9,8) 130,0 131,9; 163,8 41,3; 69,8; 122,7 2 6,24 (1H, dd, J = 5,0 e 9,8) 131,9 69,8; 130,0 38,5; 163,8 3 5,48 (1H, t, J = 5,0) 69,8 38,5; 131,9 11,7; 41,3; 130,0; 167,9 4 2,11 (1H, dq, J = 5,0 e 7,0) 38,5 11,7 24,0; 41,3; 121,0; 163,8 5 41,3 6 6,30 (1H, d, J = 0,4) 121,0 41,3; 146,5 24,0; 38,5; 163,8; 181,4 7 146,5 8 181,4 9 6,21 (1H, sl) 122,7 163,8 41,3; 130,0; 146,5 10 163,8 11 1,43 (3H, s) 24,0 41,3 38,5; 121,0; 163,8 12 1,19 (3H, d, J = 7,0) 11,7 38,5 41,3; 68,9 1’ 167,9 2’ 125,7 3’ 6,56 (1H, dq, J = 1,4 e 10,0) 149,6 31,0; 125,7 12,5; 20,4; 44,1; 167,9 4’ 2,63 (1H, m) 31,0 20,4; 44,1 125,7; 149,6 5’ 1,40-1,31/1,17-1,10 (1H, m) 44,1 31,0; 32,4 20,4; 149,6 6’ 1,28-1,32 (1H, m) 32,4 19,2; 44,1 7’ 1,34-1,29/1,17-1,10 (2H, m) 30,0 32,4 19,2 8’ 0,84 (3H, t, J = 7,1 Hz) 11,2 30,0; 32,4; 44,1 9’ 1,88 (3H, d, J = 1,4 Hz) 12,5 125,7 149,6; 167,9 10’ 1,00 (3H, d, J = 6,6 Hz) 20,4 31,0 44,1; 149,6 11’ 0,84 (3H, d, J = 6,2 Hz) 19,2 30,0; 32,4; 44,1 7-OH 6,36 (1H, sl) 146,5 121,0; 181,4 (a) CDCl3, 400 MHz (a) CDCl3, 50 MHz
Resultados e Discussão 79
Figura 43: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme de NaCl, cm-1) de LC1.
Figura 44: Espectro de RMN 1H (CDCl 3, 400 MHz) de LC1. O O OH O O O OH O
Resultados e Discussão 80
Figura 45: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl
3, 50 MHz) de LC1.
Figura 46: Mapa de correlação homonuclear 1H x 1H (CDCl3, 400 MHz) de LC1.
O O OH O O O OH O
Resultados e Discussão 81
Figura 47: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl
3, 400 MHz/100 MHz) a uma ligação de LC1.
Figura 48: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl
3, 400 MHz/100 MHz) a longa distância de LC1. O O OH O O O OH O
Resultados e Discussão 82 m/z 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 % 0 100 189.4 167.4 143.5 83.5 373.7
Figura 49: Espectro de massas (APCI no modo positivo) de LC1.
O O OH OH H OH OH OH O m/z 373 m/z 189 OH OH H H2O OH m/z 189 m/z 171 O O OH O H HO OH O O m/z 373 m/z 167