UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA
Estudo Químico do Fungo Fitopatogênico
Lasiodiplodia theobromae
(Sphaeropsidaceae)
Tese de Doutorado
Fátima Miranda Nunes
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA
Estudo Químico do Fungo Fitopatogênico
Lasiodiplodia theobromae
(Sphaeropsidaceae)
Tese de Doutorado submetida à coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Química Orgânica, como requisito para a obtenção do Grau
de Doutor em Química Orgânica.
Aluna: Fátima Miranda Nunes
Orientadora: Profa. Dra. Maria da Conceição Ferreira de Oliveira
Co-orientadores: Dr. Francisco Marto Pinto Viana
Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho
N925e Nunes, Fátima Miranda
Estudo químico do fungo fitopatogênico Lasiodiplodia theobromae
(Sphaeropsidaceae) / Fátima Miranda Nunes, 2008. 211 f. ;il. color. enc.
Orientadora: Profa. Dra. Maria da Conceição Ferreira de Oliveira Co-Orientador: Dr. Francisco Marto Pinto Viana
Co-Orientador : Prof. Pós Dr. Edson Rodrigues Filho Área de concentração: Química Orgânica
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências.
Depto. de Química Orgânica e Inorgânica, Fortaleza, 2008.
AGRADECIMENTOS
A Deus que me concede a cada dia uma nova oportunidade.
Ao Naldo, meu amor, por todo o carinho, paciência e compreensão.
Às minhas irmãs e ao meu irmão que sempre acreditaram em mim.
À Profa. Maria da Conceição pelas oportunidades, orientação, ensinamentos e incentivo nessa caminhada.
Ao Dr. Francisco Marto Pinto Viana da EMBRAPA - Agroindústria Tropical (CE) pela co-orientação deste trabalho.
À Viviane Marque Ferreira, aluna de IC da EMBRAPA, pelo treinamento na manipulação de fungos.
Ao Prof. Edson Rodrigues Filho pela co-orientação e amizade durante a realização desse trabalho no Departamento de Química da UFSCar.
Aos colegas de laboratório da UFSCar Luciana Amaral, Renata Pastre, Thaícia, Taís, Gezimar, Elaine, Luís Henrique, Luís Fernando, Afonso e Antonia pelo acolhida.
Ao Prof. Jair Mafezoli, da UNIFOR, pela ajuda no trabalho experimental, determinação estrutural e na elaboração dessa tese.
À Profa. Maria Nenmaura pela utilização da infra-estrutura do Laboratório de Micolologia e Patologia de Sementes (LAMPS) – UFC.
Ao Prof. Antonio Gilberto Ferreira, do Departamento de Química da UFSCar, pela obtenção dos espectros nOe difference da substância LC1.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Química Orgânica e em especial às professora Mary Anne Souza Lima e Otília Loiola Pessoa pela carinho e atenção.
Ao CENAUREMN pela aquisição dos espectros de RMN e em especial à Gizelle e ao João Henrique pela realização dos experimentos.
Ao Bartholomeu, João Sammy, João Carlos, Luciana Bertini, Luciana Lucas e Ayla pelos espectros de massas e IV.
Ao Daniel Araújo pela colaboração nos experimentos de biotransformação e nas análises por CG/DIC.
Aos amigos Gizelle, Allana, Mozarina e Glauber pelo companheirismo nos momentos mais difíceis.
Aos companheiros de laboratório Rosa, Reinaldo, Pontes, Alexandre, Lidiane e Ernani e em especial Gizelle, Bartholomeu, Natália, Daniel e Biel pela amizade e apoio.
A todos os colegas do Curso de Pós-Graduação em Química Orgânica.
Aos funcionários Lana, Célia, Mundinha e Paulo pela colaboração.
A todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ESQUEMAS LISTA DE GRÁFICOS LISTA DE SIGLAS RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO ...
2. CONSIDERAÇÕES TAXONÔMICAS ...
3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ... 3.1 Ácidos graxos fúngicos ...
3.1.1 Biossíntese dos ácidos graxos ... 3.2 Metabólitos secundários isolados de L. theobromae ...
3.3 Sesquiterpenos eremofilanos ... 3.3.1 Eremofilanos naturais ... 3.3.2 Origem biogenética dos eremofilanos ... 3.3.3 Eremofilanos fúngicos ... 3.3.3.1 Dados de RMN 13C dos eremofilanos fúngicos ... 3.4 Biotransformação utilizando L. theobromae ...
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 4.1 Avaliação dos ácidos graxos de L. theobromae ...
4.1.1 Produção de massa micelial ... 4.1.2 Obtenção de extratos fúngicos ... 4.1.3 Partição dos extratos fúngicos ... 4.1.4 Fracionamento do material lipídico ... 4.1.5 Identificação dos ácidos graxos ... 4.1.5.1 Ésteres metílicos ... 4.1.5.2 Ésteres de trimetilsilila ... 4.2 Cultivo fúngico e isolamento de metabólitos secundários ... 4.2.1 Cultivo de L. theobromae em Czapeck ...
4.2.1.1 Isolamento de LC1 e LC2 ... 4.2.1.1.1 Identificação de LC1 ... 4.2.1.1.2 Identificação de LC2 ... 4.2.2 Cultivo de L. theobromae em peptona ...
4.2.2.1 Isolamento de LP1 e LP2 ... 4.2.2.1.1 Identificação de LP1 ... 4.2.2.1.2 Identificação de LP2 ... 4.2.2.2 Isolamento de LP3 ... 4.2.2.2.1 Identificação de LP3 ... 4.2.3 Cultivo de L. theobromae em arroz ...
4.2.3.1 Fracionamento cromatográfico de LGM: caracterização de LGS ... 4.2.3.1.1 Análise de LGS por cromatografia líquida de
alta eficiência... 4.2.3.2 Fracionamento cromatográfico de LGA: Isolamento de LA ... 4.2.3.3 Crescimento de L. theobramae utilizando LGS com fonte de açúcar ...
4.3 Estudo da cinética de produção de ácido jasmônico por L. theobromae ...
4.3.1 Detecção de ácido jasmônico por espectrometria de massas ... 4.4 Emprego de L. theobromae na biotransformação de substratos orgânicos ...
4.4.1 Biotransformação da (R)-carvona ...
4.4.1.1 Avaliação da concentração inibitória mínima (CIM) da (R)-carvona ...
4.4.1.2 Análise dos produtos de biotransformação da (R)-carvona ...
4.4.1.3 Identificação dos produtos da biotransformação da (R)-carvona ...
4.4.1.3.1 Identificação de A ... 4.4.1.3.2 Isolamento e identificação de B e C ...
4.4.1.3.2.1 Identificação de B ... 4.4.1.3.2.2 Identificação de C ... 4.4.1.4 Estudo da Cinética de Biotransformação da (R)-carvona
utilizando células em crescimento de L. theobromae ...
4.4.1.4.1 Biotransformação da (R)-carvona: 3-15 dias ...
4.4.1.4.2 Biotransformação da (R)-carvona: 12-48 horas ...
4.4.1.5 Determinação da estereoquímica dos produtos da biotransformação da (R)-carvona ...
4.4.1.6 Confirmação do álcool (1R,2S,4R,8S)-p-mentan-2,8,9-triol (C)
como produto de biotransformação ... 4.4.1.7 Biotransformação da (R)-carvona em caldo da cultura e células
remanescentes de L. theobromae ...
4.4.2 Biotransformação da (S)-carvona utilizando células em crescimento de
L. theobromae ...
4.4.3 Biotransformação da acetofenona e derivados p-substituídos ...
4.4.3.1 Variação no tempo de reação da acetofenona e da
p-bromoacetofenona ...
5. PARTE EXPERIMENTAL ... 5.1 Métodos Cromatográficos ...
5.1.1 Cromatografia em gel de sílica ... 5.1.2 Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência ... 5.1.3 Cromatógrafo Gasoso ... 5.2 Solventes ... 5.3 Métodos Espectrométricos ... 5.3.1 Espectrometria de Infravermelho (IV) ... 5.3.2 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ... 5.3.3 Espectrometria de Massas (EM) ... 5.4 Ponto de Fusão ... 5.5 Rotação Óptica ... 5.6 Esterilização e preparação de meios de cultura ... 5.7 Microrganismo ... 5.7.1 Preservação do microrganismo ... 5.8 Preparação dos meios de cultura ... 5.8.1 Meio de Czapeck ... 5.8.2 Meio de peptona ... 5.8.3 Meio de caldo de batata ... 5.8.4 Meio de arroz... 5.9 Avaliação dos ácidos graxos de L. theobromae ...
5.9.1 Partição e fracionamento dos extratos dos micélios ... 5.9.2 Saponificação ...
5.9.3 Esterificação ... 5.9.4 Sililação ... 5.9.5 Análise dos ésteres metílicos e de silício dos ácidos graxos ... 5.10 Cultivo fúngico e isolamento de metabólitos secundários ... 5.10.1 Cultivo em Czapeck ... 5.10.1.1 Fracionamento cromatográfico de LG-MLM ... 5.10.1.2 Fracionamento cromatográfico de LFA ... 5.10.1.3 Fracionamento cromatográfico de C4: Isolamento de LC1 ... 5.10.1.4 Fracionamento cromatográfico de C9 ... 5.10.1.5 Fracionamento cromatográfico de P6: Isolamento de LC2 ... 5.10.2 Cultivo de peptona ...
5.10.2.1 Fracionamento cromatográfico LG-MLP ... 5.10.2.2 Fracionamento cromatográfico de MLP6: Isolamento de LP1
e LP2 ... 5.10.2.3 Fracionamento cromatográfico LG-MP ... 5.10.2.4 Fracionamento cromatográfico PM5: Isolamento de LP3 ... 5.11 Estudo da cinética de produção de ácido jasmônico por L. theobromae ...
5.11.1 Cultivo em arroz ... 5.11.1.1 Análise dos extratos por espectrometria de massas ... 5.11.2 Análise dos extratos por CCDA ... 5.11.2.1 Fracionamento cromatográfico de LGM ... 5.11.2.2 Fracionamento cromatográfico de LGA ...
5.11.2.2.1 Fracionamento cromatográfico de F6: Isolamento de LA ... 5.11.3 Crescimento de L. theobramae utilizando LGS com fonte de açúcar ...
5.12 Emprego de L. theobromae na biotransformação de substratos orgânicos ...
5.12.1 Substratos ... 5.12.2 Redução química dos substratos: preparação de padrões ... 5.12.4 Construção das curvas de calibração ... 5.12.3 Biotransformação da (R)-carvona ...
5.12.4.1 Avaliação da concentração inibitória mínima (CIM) da
(R)-carvona ...
5.12.4.2 Análise por CG/EM: Biotransformação da (R)-carvona em
células em crescimento de L. theobromae ...
5.12.4.3 Isolamento dos produtos da biotransformação da (R)-carvona ...
5.12.4.4 Cinética da biotransformação da (R)-carvona ...
5.12.4.5 Biotransformação da (R)-carvona em caldo da cultura e
células remanescentes ... 5.12.5 Biotransformação da (S)-carvona ...
5.12.6 Biotransformação da acetofenona e derivados p-substituídos utilizando
células em crescimento de L. theobromae ...
5.12.6.1 Análise dos álcoois 90a-94a por CG/DIC ... 5.12.6.1.1 Preparação das amostras ... 5.12.6.1.2 Quantificação dos álcoois 90a-94a ... 5.12.6.1.3 Determinação dos excessos enantioméricos dos
álcoois 90a-94a...
6. CONCLUSÃO ...
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Sintomas do ataque de L. theobromae em diversos hospedeiros...
Figura 2: Cultura de L. theobromae em BDA (A) e conídios (B e C) ...
Figura 3: Ácido jasmônico e derivados isolados de L. theobromae ...
Figura 4: Lasiodiplodinas isoladas de L. theobromae ...
Figura 5: Outros metabólitos secundários isolados de L. theobromae ...
Figura 6: Metabólitos voláteis de L. theobromae detectados por CG/EM ...
Figura 7: Esqueleto básico de sesquiterpenos do tipo eremofilano... Figura 8: Eremofilanos isolados de plantas e organismos marinhos ... Figura 9: Eremofilanos de origem fúngica ... Figura 10: Meios de cultura utilizando caldo de batata ... Figura 11: Meios de cultura utilizando peptona ... Figura 12: Meios de cultura utilizando Czapeck ... Figura 13: Massas miceliais: (1) BG; (2) BM; (3) PG; (4) PM; (5) CGL; (6) CM em
sextuplicata ... Figura 14: Meios de cultura: (1) BG; (2) BM; (3) PG; (4) PM; (5) CGL; (6) CM em
sextuplicata ... Figura 15: Cromatograma dos ésteres metílicos de BG1 ... Figura 16: Cromatograma dos ésteres metílicos de BM1 ... Figura 17: Cromatograma dos ésteres metílicos de PG1 ... Figura 18: Cromatograma dos ésteres metílicos de PM1 ... Figura 19: Cromatograma dos ésteres metílicos de CGL1 ... Figura 20: Cromatograma dos ésteres metílicos de CM1 ...6 Figura 21: Cromatograma dos ésteres metílicos de BG2 ... Figura 22: Cromatograma dos ésteres metílicos de BM2 ... Figura 23: Cromatograma dos ésteres metílicos de PG2 ... Figura 24: Cromatograma dos ésteres metílicos de PM2 ... Figura 25: Espectro de massas do hexadecanoato de metila ... Figura 26: Espectros de massas do éster metílico não identificado ... Figura 27: Espectro de massas do octadecanoato de metila ... Figura 28: Espectro de massas do 9,12-octadecadienoato de metila ... Figura 29: Espectro de massas do 9-octadecenoato de metila ... Figura 30: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de BM3 ... Figura 31: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de BG4 ... Figura 32: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de BM4 ... Figura 33: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de PG4 ... Figura 34: Cromatograma dos ésteres de trimetilsilila de PM4 ... Figura 35: Espectro de massas do hexadecanoato de trimetilsilila ... Figura 36: Espectro de massas do octadecanoato de trimetilsilila ... Figura 37: Espectro de massas do 9-trans-octadecenoato de trimetilsilila ...
Figura 38: Sub-estruturas I e II para LC1 propostas segundo o mapa de correlação homonuclear 1H x 1H de LC1 ... Figura 39: Correlações a longa distância da cadeia de ácido graxo ... Figura 40: Acoplamentos a longa distância da sub-estrutura III ... Figura 41: Estrutura do sesquiterpeno eremofilano ... Figura 42: Estrutura do sesquiterpeno eremofilano com esteroquímica relativa ... Figura 43: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme de NaCl, cm-1)
de LC1 ... Figura 44: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) de LC1 ...
Figura 45: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 50 MHz) de LC1 ...
Figura 46: Mapa de correlação homonuclear 1H x 1H (CDCl
3, 400 MHz)de LC1 ...
Figura 47: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 400 MHz/100 MHz)
a uma ligação de LC1 ... Figura 48: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 400 MHz/100 MHz)
a longa distância de LC1 ... Figura 49: Espectro de massas (APCI no modo positivo) de LC1 ... Figura 50: Espectros nOe differrence (CDCl3 ,400 MHz) para H-3 (a), H-6 (b) e
H-4 (c)... Figura 51: Estrutura da isocumarina cis-4-hidroximeleina ...
Figura 52: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme de NaCl, cm-1) de LC2 ... Figura 53: Espectro de RMN 1H (CDCl
3, 200 MHz) de LC2 ...
Figura 54: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 50 MHz) de LC2 ...
Figura 55: Espectro de massas (IE, 70 eV) de LC2 ... Figura 56: Estrutura do éster metílico do ácido hexadecanóico ... Figura 57: Espectro de RMN 1H (CDCl
3, 500 MHz) de LP-1 ...
Figura 58: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 125 MHz) de LP-1 ...
Figura 59: Cromatograma de LP1 ... Figura 60: Cromatograma dos ésteres metílicos de LP1 ... Figura 61: Estrutura do ergosterol ... Figura 62: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) de LP2 ...
Figura 63: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 125 MHz) de LP2 ...
Figura 64: Estrutura do ácido 2-amino-trans-hex-4-enóico ...
Figura 65: Espectro de absorção na região do IV (filme de NaCl, cm-1) de LP3 ... Figura 66: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl
3) de LP3 ...
Figura 67: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 125 MHz) de LP3 ...
Figura 68: Espectro de RMN 13C - DEPT 1350 (CDCl3, 125 MHz) de LP3 ...
Figura 69: Mapa de correlação homonuclear 1H x 1H (CDCl3, 500 MHz) de LP3 ...
Figura 70: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 500 MHz/125 MHz)
a uma ligação de LP3 ... Figura 71: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 500 MHz/125 MHz)
a longa distância de LP3 ... Figura 72: Espectro de massas (IE, 70 eV) de LP3 ... Figura 73: Estruturas dos estereoisômeros - e - D-glicose ... Figura 74: Espectros de RMN 1H (500 MHz, D2O) de LGS (77a) e LGS +
D-glicose (77b) ... Figura 75: Espectros de RMN 13C - BB (125 MHz, D2O) de LGS (78a) e LGS +
D-glicose (78b) ... Figura 76: Cromatograma com superposição de picos detectados em LGS e padrões ... Figura 77: Estrutura do dissacarídeo celobiose ... Figura 78: Estrutura dos políssacarídeos formadores do amido ... Figura 79: Culturas de L. theobromae utilizando com fonte de açúcar LGS (82a) e
D-glicose (82b) ... Figura 80: Estrutura do ácido jasmônico ... Figura 81: Espectro de massas do ácido jasmônico [M – H+]- ...
Figura 82: Espectros de massa full scan do 160 ao 320 dia de cultivo ...
Figura 83: Culturas de L. theobromae na avaliação da CIM de carvona (50 250 µL);
(A): 3 dias e (B): 6 dias ... Figura 84: Cromatograma da (R)-carvona ...
Figura 85: Cromatograma do produto bruto da reação com 20 uL de (R)-carvona ...
Figura 86: Cromatograma do produto bruto da reação com 50 uL de (R)-carvona ...
Figura 87: Cromatograma do produto bruto da reação com 100 uL de (R)-carvona ...
Figura 88: Cromatograma do produto bruto da reação com 150 uL de (R)-carvona ...
Figura 89: Cromatograma do produto bruto da reação com 250 uL de (R)-carvona ...
Figura 90: Espectro de massas da (R)-carvona ...
Figura 91: Espectro de massas do derivado A ... Figura 92: Espectro de massas do derivado B ... Figura 93: Espectro de massas do derivado C ... Figura 94: Produto da redução da (R)-carvona com NaBH4...
Figura 95: Cromatograma dos produtos da redução química com NaBH4 ...
Figura 96: Estrutura proposta de B ... Figura 97: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme de NaCl, cm-1)
da (R)-carvona ...
Figura 98: Espectro de RMN 1H (CDCl
3, 500 MHz) da (R)-carvona ...
Figura 99: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 125 MHz) da (R)-carvona ...
Figura 100: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme de NaCl, cm-1)
de B ... Figura 101: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) de B ...
Figura 102: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl3, 125 MHz) de B ...
Figura 103: Espectro de RMN 13C - DEPT 135o (CDCl3, 125 MHz) de B ...
Figura 104: Mapa de correlação homonuclear 1H x 1H (CDCl3, 500 MHz) de B ...
Figura 105: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 500/125 MHz) a uma
ligação de B ... Figura 106: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 500/125 MHz) a longa
distância de B ... Figura 107: Estrutura proposta de C ... Figura 108: Acoplamentos a longa distância de 9-CH2 (117a - 117b), 8-CH (117c),
2-CH (117d) ... Figura 109: Espectro de absorção na região do infravermelho (filme de NaCl, cm-1)
de C ... Figura 110: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) de C ...
Figura 111: Espectro de RMN 13C - BB (CDCl
3, 125 MHz) de C ...
Figura 112: Espectro de RMN 13C - DEPT 135o (CDCl3, 125 MHz) de C ...
Figura 113: Mapa de correlação homonuclear 1H x 1H (CDCl3, 500 MHz) de C ...
Figura 114: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 500/125 MHz) a uma
ligação de C ... Figura 115: Mapa de correlação heteronuclear 1H x 13C (CDCl3, 500/125 MHz) a longa
distância de C ... Figura 116: Cromatograma do produto bruto da (R)-carvona com 3 dias ...
Figura 117: Cromatograma do produto bruto da (R)-carvona com 6 dias ...
Figura 118: Cromatograma do produto bruto da (R)-carvona com 9 dias ...
Figura 119: Cromatograma do produto bruto da (R)-carvona com 12 dias ...
Figura 120: Cromatograma do produto bruto da (R)-carvona com 15 dias ...
Figura 121: Espectros de massas de B e B’ ... Figura 122: Espectros de massas de C e C’ ... Figura 123: Cromatograma do produto bruto da (S)-carvona com 12 dias ...
Figura 124: Cromatograma do produto bruto da (S)-carvona com 24 dias ...
Figura 125: Cromatograma do produto bruto da (S)-carvona com 48 dias ...
Figura 126: Cromatograma do produto bruto da (S)-carvona com 72 dias ...
Figura 127: Espectro de massas da (S)-carvona ...
Figura 128: Espectro de massas do derivado E ... Figura 129: Espectro de massas do derivado F ... Figura 130: Espectro de massas do derivado G ... Figura 131: Espectro de massas do derivado H ... Figura 132: Curva de calibração do feniletan-1-ol ... Figura 133: Curva de calibração do p-metilfeniletan-1-ol ...
Figura 134: Curva de calibração do p-clorofeniletan-1-ol ...
Figura 135: Curva de calibração do p-bromofeniletan-1-ol ...
Figura 136: Curva de calibração do p-nitrofeniletan-1-ol ...
Figura 137: Cromatograma da mistura padrão interno, feniletan-1-ol e acetofenona eluídos em coluna OV-5 ... Figura 138: Cromatograma do produto de reação da acetofenona com 3 dias eluído em
coluna OV-5 ... Figura 139: Cromatograma do produto de reação da acetofenona com 2 dias eluído em
coluna OV-5 ... Figura 140: Cromatograma do produto de reação da acetofenona com 1 dia eluído em
coluna OV-5 ... Figura 141: Cromatograma da mistura padrão interno, p-metilfeniletan-1-ol e
p-metilacetofenona eluídos em coluna OV-5 ...
Figura 142: Cromatograma do produto de reação da p-metilacetofenona com 3 dia
eluído em coluna OV-5 ... Figura 143: Cromatograma da mistura padrão interno, p-clorofeniletan-1-ol e
p-cloroacetofenona eluídos em coluna OV-5 ...
Figura 144: Cromatograma do produto de reação da p-clorocetofenona com 3 dia
eluído em coluna OV-5 ... Figura 145: Cromatograma da mistura padrão interno, p-bromofeniletan-1-ol e
p-bromoacetofenona eluídos em coluna OV-5 ...
Figura 146: Cromatograma do produto de reação da p-bromocetofenona com 3 dias
eluído em coluna OV-5 ... Figura 147: Cromatograma do produto de reação da p-bromocetofenona com 4 dias
eluído em coluna OV-5 ... Figura 148: Cromatograma do produto de reação da p-bromocetofenona com 5 dias
eluído em coluna OV-5 ... Figura 149: Cromatograma do produto de reação da p-bromocetofenona com 6 dias
eluído em coluna OV-5 ... Figura 150: Cromatograma da mistura padrão interno, p-nitrofeniletan-1-ol e
p-nitroacetofenona eluídos em coluna OV-5 ...
Figura 151: Cromatograma do produto de reação da p-nitrocetofenona com 3 dias
eluído em coluna OV-5 ... Figura 152: Cromatograma do racemato do feniletan-1-ol eluído em coluna quiral
CHIRASIL-DEX ... Figura 153: Cromatograma do produto de reação da acetofenona com 3 dias eluído em
coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 154: Cromatograma do produto de reação da acetofenona com 2 dias eluído em
coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 155: Cromatograma do produto de reação da acetofenona com 1 dia eluído em
coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 156: Cromatograma do racemato do p-metilfeniletan-1-ol eluído em coluna
Figura 157: Cromatograma do produto de reação da p-metilacetofenona com 3 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 158: Cromatograma do racemato do p-clorofeniletan-1-ol eluído em coluna
quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 159: Cromatograma do produto de reação da p-cloroacetofenona com 3 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 160: Cromatograma do racemato do p-bromofeniletan-1-ol eluído em coluna
quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 161: Cromatograma do produto de reação da p-bromoacetofenona com 3 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 162: Cromatograma do produto de reação da p-bromoacetofenona com 4 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 163: Cromatograma do produto de reação da p-bromoacetofenona com 5 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 164: Cromatograma do produto de reação da p-bromoacetofenona com 6 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 165: Cromatograma do racemato do p-nitrofeniletan-1-ol eluído em coluna
quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 166: Cromatograma do produto de reação da p-nitroacetofenona com 3 dias
eluído em coluna quiral CHIRASIL-DEX ... Figura 167: Fotos dos meios de cultura ... Figura 168: Fluxograma de isolamento de LC1 e LC2 ... Figura 169: Fluxograma de isolamento de LP1, LP2 e LP3 ... Figura 170: Estudo da produção de ácido jasmônico e isolamento de LGS e LA... Figura 171: Substratos utilizados na biotransformação ...
164
165
165
166
166
166
167
167 168
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Ácidos graxos de ocorrência natural ... Tabela 2: Meios de cultura utilizados para a produção de metabólitos secundários
por L. theobromae ...
Tabela 3: Dados de RMN 13C dos carbonos C-1 a C-15 de eremofilanos fúngicos
descritos na literatura ... Tabela 4: Dados de RMN 13C da cadeia lateral em C-1 ou C-3 ... Tabela 5: Valores médios das massas miceliais secas (g) com 15 dias de crescimento ... Tabela 6: Valores médios dos extratos fúngicos (mg) com 15 dias de crescimento ... Tabela 7: Extratos orgânicos (mg) obtidos da partição com CaCl2 0,2% (mg) ...
Tabela 8: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres metílicos eluídos
com hexano/CHCl3 10% ...
Tabela 9: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres metílicos eluídos
com AcOEt ... Tabela 10: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres de trimetilsilila eluídos
com hexano/CHCl3 10%...
Tabela 11: Ácidos graxos (%) identificados na forma de ésteres de trimetilsilila eluídos com AcOEt ... Tabela 12: Dados de RMN de 1H e 13C (δ) de LC1 ... Tabela 13: Dados de RMN de 1H e 13C (δ) de LC2 e comparação com os dados da
cis-4- hidroximeleina descritos na literatura ...
Tabela 14: Dados de RMN 1H e 13C (δ) de LP2 e comparação com os dados do
ergosterol descritos na literatura (SHIRANE et. al., 1996) ...
Tabela 15: Dados de RMN de 1H e 13C (δ) de LP3 ... Tabela 16: Dados de RMN 1H e 13C (δ) de LGS e comparação com os dados da
D-glicose descritos na literatura ... Tabela 17: Extratos obtidos de L. theobromae utilizando LGS e D-glicose como fonte
de açúcar ... Tabela 18: Composição percentual relativa entre a (R)-carvona e seus derivados
variando a concentração do substrato (20 - 250 µL) ... Tabela 19: Dados de RMN de 1H e 13C (δ) de B ... Tabela 20: Dados de RMN de 1H e 13C de B e comparação com dados da literatura ... Tabela 21: Dados de RMN de 1H e 13C de C e comparação com dados da literatura ... Tabela 22: Composição percentual relativa entre a (R)-carvona e seus derivados
variando o tempo reacional (3 - 15 dias) ... Tabela 23: Composição percentual relativa entre os derivados da (R)-carvona
durantes 48 horas ... Tabela 24: Produtos da biotransformação (%) utilizando o caldo de cultura e células
remanescentes de L. theobromae como fonte enzimática...
Tabela 25: Composição percentual relativa entre a (S)-carvona e seus derivados ...
Tabela 26: Produtos de redução da acetofenona e derivados p-substituídos ...
Tabela 27: Produtos de redução da acetofenona e da p-bromoacetofenona ...
Tabela 28: Massas fúngicas (g) de L. theobromae ...
Tabela 29: Massas dos extratos (mg) de L. theobromae ...
Tabela 30: Massas (mg) das amostras da partição e do fracionamento cromatográfico dos extratos ... Tabela 31: Extratos (mg) oriundos da saponificação ... Tabela 32: Fracionamento cromatográfico de LG-MLM ... Tabela 33: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico de LFA ...
Tabela 34: Frações reunidas após fracionamento cromatográfico de LFA ... Tabela 35: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico de C4 ... Tabela 36: Frações de C4 após análise por CCDA ... Tabela 37: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico de C9 ... Tabela 38: Frações de C9 após analisadas por CCDA ... Tabela 39: Fracionamento cromatográfico de LG-MLP ... Tabela 40: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico de MLP6 .... Tabela 41 Frações reunidas após separação cromatográfica de MLP6 ... Tabela 42: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico de LG-MP .. Tabela 43: Frações reunidas após separação cromatográfica de LP-MP ... Tabela 44 Frações reunidas da separação cromatográfica de LP-MP ... Tabela 45: Extratos da cultura fúngica em arroz ... Tabela 46: Fracionamento cromatográfico de LGA ... Tabela 47: Fracionamento cromatográfico de F6 ... Tabela 48 Frações reunidas da separação cromatográfica de F6 ... Tabela 49: Frações do estudo da CIM da (R)-carvona sob L. theobromae ...
Tabela 50: Fracionamento cromatográfico de 50D ... Tabela 51 Frações reunidas do fracionamento cromatográfico de 50D ... Tabela 52: Parâmetros cromatográficos da quantificação dos álcoois 90a-94a... Tabela 53: Parâmetros cromatográficos de quantificação dos excessos enantioméricos
dos álcoois 90a-94a ... 182 183 183 184 184 186 187 187 187 188 188 190 191 192 192 196 197 197 200
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Etapas biosintéticas da formação dos ácidos graxos ... Esquema 2: Formação dos triglicerídeos ... Esquema 3: Formação do IPP e DMAPP a partir do MVA ... Esquema 4: Formação do cátion eudesmila ... Esquema 5: Formação do esqueleto eremofilano ... Esquema 6: Síntese do ácido 3 ,7 -dihidroxi-7 -colan-24-oico via hidroxilação
microbiológica com B. theobromae ...
Esquema 7: Derivados da -ionona obtidos por biotransformação com L. theobromae ...
Esquema 8: Biotransformação da (+)-valencena utilizando B. theobromae ...
Esquema 9: Hidrólise e redução de lactonas sesquiterpênicas por B. theobromae ...
Esquema 10: Resolução cinética com L. theobromae ...
Esquema 11: Proposta de fragmentação para LC1 ... Esquema 12: Formação do ácido 2-amino-cis-hex-4-enóico proposto por Shaw et. al.
(1965) ... Esquema 13: Mecanismo de fragmentação para o íon m/z 209 ...
Esquema 14: Produto A da biotransformação da (R)-carvona ...
Esquema 15: Proposta de fragmentação para A ... Esquema 16: Proposta de fragmentação para B ... Esquema 17: Proposta de fragmentação para C ... Esquema 18: Reação de redução da (R)-carvona ...
Esquema 19: Produtos da biotransformação de (R)-carvona com 3 dias ...
Esquema 20: Obtenção de C a partir de reação de hidrólise ácida de B ... Esquema 21: Produtos da biotransformação da (S)-carvona ...
Esquema 22: Cetonas aromáticas utilizadas na biotransformação com L. theobromae ...
Esquema 23: Reação de redução química da (R)-carvona ...
Esquema 24: Redução química da acetofenona e derivados ... Esquema 25: Produtos de redução utilizando L. theobromae ...
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Formação dos produtos da biotransformação da (R)-carvona
variando a concentração do substrato ... Gráfico 2: Formação dos produtos da biotransformação da (R)-carvona
durante 15 dias ... Gráfico 3: Formação dos produtos da biotransformação da (R)-carvona
e 12-48 horas ... 32 32 39 39 39
51 51 52 52 52 82
97 111 121 122 126 135 145 146 147 149 152 194 195 195
116
141
LISTA DE SIGLAS
ADH – Enzima Alcooldesidrogenase
APCI – Atmospheric Pressure Chemical Ionization
BD – Meio de Cultura Batata-Dextrose
BDA – Meio de Cultura Batata-Dextrose-Àgar BG – Meio de Cultura Batata-Glicose
BM – Meio de Cultura Batata-Manitol CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CCDA – Cromatografia em Camada Delgada Analítica CCDP – Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CGL – Meio de Cultura Czapeck-Glicose
CG/DIC – Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização em Chama CG/EM – Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CM – Meio de Cultura Czapeck-Manitol
COSY – Correlation Spectroscopy
EM – Espectro de Massas
ESI-MS/MS – Espectrometria de massas TANDEM com ionização por electrospray
HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Conectivy
HSQC – Hetronuclear Single Quantum Correlated
IE – Impacto Eletrônico IV - Infravermelho
J- Constante de Acoplamento
LA – Substância isolada do extrato de L. theobromae em arroz
LC1 – Substância 1 isolada do extrato de L. theobromae em Czapeck
LC2 – Substância 2 isolada do extrato de L. theobromae em Czapeck
LGS – Mistura de açúcares separada do extrato de L. theobromae em arroz
LP1 – Mistura de ácidos graxos do extrato de L. theobromae em peptona
LP2 – Substância 2 isolada do extrato de L. theobromae em peptona
LP3 – Substância 3 isolada do extrato de L. theobromae em peptona
nOe – Nuclear Overhauser Effect
PG – Meio de cultura peptona-glicose PM – Meio de cultura peptona-manitol
RMN 13C – BB – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 – Broad Band
DEPT – Distorneless Enhancement by Polarization Transfer
RESUMO
Este trabalho descreve o estudo químico do fungo fitopatogênico Lasiodiplodia
theobromae (Sphaeropsidaceae). Desse fungo foram investigados o perfil de ácidos graxos, a
produção de metabólitos secundários e seu emprego em biotransformação de cetonas. O estudo da composição de ácidos graxos desse fungo em diversos meios de cultura revelou a presença dos ácidos graxos hexadecanóico (C16:0), octadecanóico (C18:0), 9-octadecenóico
(C18:1) e 9,12-octadienóico (C18:2). A identificação dos ácidos graxos foi feita por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). O estudo dos metabólitos secundários de L. theobromae foi realizado utilizando os meios de cultura líquido
(Czapeck e peptona) e sólido (arroz). A partir de extratos do meio de cultura Czapeck foram isolados a isocumarina 4-hidroximeleina e o sesquitepeno eremofilano 2,4,6-trimetiloct-2-enoato de 1,2,6,8a-tetrahidro-7-hidroxi-1,8a-dimetil-6-oxo-2-naftalenila, inédito na literatura. Do cultivo em peptona isolou-se uma mistura de ácidos graxos e o esteróide ergosterol do meio líquido e o aminoácido 2-amino-trans-hex-4-enóico do micélio. Do cultivo em arroz foi
isolado o ergosterol. Os açúcares D-glicose e celobiose foram identificados como produtos da degradação do amido. Através de um estudo cinético realizado durante 32 dias por espectrometria de massas, foi possível detectar a produção de ácido jasmônico em culturas de
L. theobromae em arroz a partir do 16º dia. A biotransformação da (R)-carvona utilizando-se
L. theobromae, levou a caracterização dos álcoois neodihidrocarveol, 8(9)-p-menten-2,10-diol
e (1R,2S,4R,8S)-p-mentan-2,8,9-triol como produtos de reação. Resultados semelhantes foram
observados para a (S)-carvona. O emprego da acetofenona e quatro derivados p-substituídos
ABSTRACT
This work reports the chemical investigation of Lasiodiplodia theobromae
(Sphaeropsidaceae). The fatty acid profile, secondary metabolites production and application of this fungus in biotransformation of ketones were investigated. The fatty acid composition
of L. theobromae in several culture broth produced hexadecanoic acid (C16:0), octadecanoic
acid (C18:0), 9-octadecenoic acid (C18:1) and 9,12-octadienoic acid (C18:2) as main compounds.
The identification of these fatty acid was done by GC/MS. L. theobromae was grown in liquid
(Czapeck and peptone) and solid (rice) medium and allowed the isolation of 4-hydroxy-mellein, 2,4,6-trimethyloct-2-enoic acid and the eremophilane sesquiterpene 1,2,6,8a-tetrahydro-7-hydroxy-1,8a-dimethyl-6-oxo-2-naphtalenyl ester from the Czapeck broth. From the fungus culture in peptone it was isolated a mixture of fatty acids, 2-amino-trans
-4-hexenoic acid and ergosterol. This steroid was also isolated from the culture of L. theobromae
in rice, as well as D-glucose and cellobiose as products of starch degradation. The eremophilane sesquiterpene isolated from the Czapeck broth is being reported for the first time in the literature. The production of jasmonic acid by L. theobromae was investigated by
mass spectrometry (MS/ESI). This fungus was grown for 32 days and revealed the presence of jasmonic acid from the 16th day. Biotransformation of (R)-carvone by L. theobromae
yielded neodihydrocarveol, 8(9)-p-menthene-2,10-diol and p-menthane-2,8,9-triol as
products. The same results was obtained when (S)-carvone was used as starting material.
Biotransformation of acetophenone and four p-substituted derivatives provided the
Capítulo 1
Introdução 23
1. INTRODUÇÃO
Este trabalho foi desenvolvido no Programa de Pós-Graduação em Química Orgânica da Universidade Federal do Ceará e descreve o estudo químico do fungo fitopatogênico Lasiodiplodia theobromae. Trata-se do primeiro trabalho de doutorado em
Química de Microrganismos nesse Programa de Pós-graduação, o qual teve início em 2004 através de uma parceria com o grupo do Laboratório de Bioquímica Micromolecular (LaBioMi), do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos, sob a coordenação do Prof. Edson Rodrigues Filho. Esta parceria foi consolidada através da aprovação do projeto de cooperação acadêmica CAPES/PROCAD-2005 “Nucleação e Consolidação de Grupos Atuando em Química de Microrganismos na UFC e UFPA” e contribuiu fortemente para o desenvolvimento desta tese.
Os produtos naturais têm sido usados pelo homem através dos séculos e, historicamente, a indústria farmacêutica utiliza extratos de plantas para obter compostos farmacologicamente ativos (BAKER et. al., 2007). Nas últimas décadas os microorganismos,
principalmente bactérias, fungos e leveduras, estão recebendo atenção especial por parte da indústria e dos pesquisadores em produtos naturais. Os avanços obtidos no campo da biotecnologia, aliado ao emprego de técnicas modernas de fracionamento químico, elucidação estrutural e screening na busca por novos protótipos bioativos, têm revelado seu enorme
potencial em fornecerem compostos com atividade biológica ou com alguma característica estrutural que leve a isso (VIEGAS-JR.; BOLZANI;BARREIRO, 2006). Além do seu uso na indústria farmacêutica, esses microrganismos vêm sendo bastante utilizados em indústrias de enzimas, vitaminas, pigmentos, lipídeos e glicolipídeos (ADRIO et. al., 2003) dentre outras
aplicações biotecnológicas.
Os fungos que causam doenças em plantas, denominados fitopatogênicos, têm sido alvos de diversas pesquisas em todo o mundo, uma vez que a agressividade desses fungos indicam uma alta atividade enzimática permitindo a sua utilização em diversos estudos na área de biotecnologia. No Brasil, são diversos os fitopatógenos que vêm despertando a atenção dos fitopatologistas, onde Lasiodiplodia theobromae merece destaque por estar
associado a mais de 500 espécies de plantas (PUNITHALINGAM, 1980). Esse fitopatógeno é considerado um dos agressores mais resistentes das regiões tropicais (FREIRE et. al., 2004).
L. theobromae tem sido objeto de estudo do Laboratório de Fitopatologia da
Introdução 24
problemática da agricultura cearense, foi realizada uma parceria com a EMBRAPA-Agriondústria Tropical onde L. theobromae foi utilizado como objeto de estudo dessa tese de
doutorado.
Os objetivos gerais e específicos dessa tese são:
Objetivos gerais
♦ Realizar o estudo químico de L. theobromae.
♦ Determinar em qual das linhas de estudo desenvolvidas L. theobromae se destaca.
Objetivos específicos
♦ Determinar, dentre diferentes meios de cultura, aquele em que L. theobromae
apresenta melhor desenvolvimento.
♦ Isolar metabólitos secundários de L. theobromae a partir de extratos orgânicos
oriundos dos meios de cultura utilizados.
♦ Analisar o perfil de ácidos graxos produzidos por L. theobromae em diferentes
meios de cultura.
♦ Investigar o potencial de L. theobromae na biotransformação de substratos
orgânicos.
Este trabalho está dividido em seis capítulos: 1 – Introdução; 2 – Consideração Taxonômica; 3 – Levantamento Bibliográfico; 4 – Resultados e Discussão; 5 – Parte Experimental; 6- Conclusão.
Capítulo 2
Considerações
Considerações Taxonômicas 26
2. CONSIDERAÇÕES TAXONÔMICAS
Lasiodiplodia theobromae (Patouillard) Griffon & Maublanc é um fungo
fitopatogênico encontrado em mais de 500 espécies de plantas (PUNITHALINGAM, 1980) sendo considerado um problema sério na agricultura brasileira (FREIRE et. al. 2004).
Atualmente, L. theobromae é responsável pela infecção de várias culturas (Figura 1),
causando doenças importantes, como a morte descendente do cajueiro, cacauzeiro, gravioleira e mangueira. Outros sintomas apresentados são murcha, podridão basal de frutos, cancro de tronco e de ramos da mangueira (PEREIRA; SILVA; RIBEIRO, 2006). A sua capacidade de infectar frutos coloca-o dentre os patógenos mais eficientes disseminados por meio de sementes e causadores de problemas de pós-colheita (FREIRE et. al., 2004).
Figura 1: Sintomas do ataque de L. theobromae em diversos hospedeiros: (A) cajueiro; (B) mangueira; (C)
aceroleira; (D) gravioleira; (E) cajazeira; (F) mamoeiro; (G) folha do coqueiro; (H) fruto do coqueiro.
L. theobromae é a forma anamórfica de Botryosphaeria rhodina (Berkeley &
Curtis) von Arx. Botryodiplodia theobromae é sinonímia de L. theobromae, porém sua
utilização na literatura está em desuso. L. theobromae pertencente à classe dos
Deuteromicetos, ordem dos Sphaeropsidales e a família Sphaeropsidaceae. Também é descrito como Botryodiplodia theobromae, porém essa sinonímia não é mais utilizada
Considerações Taxonômicas 27
Segundo Encinas (1996), o micélio de L. theobromae é aéreo, os picnídios são
simples ou compostos, imersos em um estroma com até 5 mm de largura. Os conidióforos são hialinos, simples e em alguns casos septados, raramente ramificados. As células conidiogênicas são hialinas, simples, cilíndricas a subperiformes e os conídios são inicialmente asseptados, hialinos, subovóides e elipsóides (Figura 2B). Quando maduros esses conídios apresentam um septo, também são frequentemente estriados com tamanho variando de 20-30 x 1-15 µm (Figura 2C).
Figura 2: Cultura de L. theobromae em BDA (A) e conídios (B e C).
F
.M
.P
.V
IA
N
A
/C
N
P
A
T
B C
Capítulo 3
Levantamento
Levantamento Bibliográfico 29
3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
A utilização dos fungos não está restrita a produção de substâncias farmacologicamente ativas. Esses microrganismos estão presentes em muitos processos industriais, como a produção de enzimas, vitaminas, polissacarídeos, pigmentos, lipídeos e glicolipídeos dentre outros (ADRIO; DEMAIN, 2003). Sendo assim, uma investigação na literatura sobre a importância dos ácidos graxos fúngicos, metabólitos secundários produzidos
por L. theobromae e a utilização desse fungo em reações de biotransformação foi realizada.
Vale ressaltar que não foi encontrado qualquer relato do estudo do perfil de ácidos graxos de
L. theobromae.
3.1 Ácidos graxos fúngicos
Os ácidos graxos são componentes fúngicos importantes, fazendo parte da composição da membrana celular dos mesmos. Muitos estudos têm comprovado a importância dos lipídeos no desenvolvimento, esporulação e germinação, assim como nos processos fisiológicos. Em geral, a maioria dos fungos apresenta cerca de 5 a 32% de ácidos graxos, dependendo principalmente da espécie, condições de cultivo e idade da cultura. Os fatores que mais influenciam na sua produção são a natureza e a proporção das fontes de carbono e nitrogênio no meio de cultura (PUPIN et. al, 2000), bem como a temperatura
(COX; SCHERM; RILEY, 2006).
Os ácidos graxos podem ser encontrados na forma livre ou como ésteres do glicerol. São também chamados de gorduras ou óleos, se forem sólidos ou líquidos, respectivamente, á temperatura ambiente (DEWICK, 2004). Estruturalmente, os ácidos graxos são de cadeia linear, sendo o ácido palmítico (ácido hexadecanóico - C16:0) o mais encontrado na maioria dos fungos. Dos ácidos graxos insaturados, os mais comuns são o ácido oléico (ácido 9-octadecenóico - C18:1) e o ácido linoléico (ácido 9,12-octadecenedióico - C18:2) (PUPIN et. al, 2000). O tamanho da cadeia carbônica, grau de insaturação, geometria
e posição da dupla ligação são fatores responsáveis pelas características dos lipídeos em diferentes microrganismos (UNO et. al., 2000).
Levantamento Bibliográfico 30
atraente, uma vez que os métodos de classificação e identificação utilizados pelos micologistas requerem muito tempo, além de habilidade extremamente apurada na diferenciação das estruturas celulares. Logo, a utilização do perfil de ácidos graxos, associado às análises das características morfológicas pode facilitar a identificação de uma determinada espécie (SILVA et. al., 1998; MADAN et. al., 2002).
Sacharomyces cerevisiae e Candida spp. puderam ser diferenciados pela
composição de seus ácidos graxos. S. cerevisiae apresentou principalmente ácidos graxos
C16:1, enquanto Candida spp., além desse tipo de ácido, teve alta concentração de ácidos
graxos C18:2 (KOBAYASHI; SUZINAKA; YANO, 1987). Foi possível estabelecer diferenças
entre ácidos graxos de dezoito espécies de Penicillum. Nesse gênero, é comum a presença de
ácidos graxos C16:0, C18:0 e C18:2,todavia o reconhecimento das espécies foi feito pela variação
das quantidades presentes desses ácidos (SILVA et. al., 1998).
A composição de ácidos graxos também é descrita na diferenciação de classes fúngicas de oomicetos, zigomicetos, ascomicetos e basidiomicetos. Nesse estudo, muitos fungos produziram os mesmos ácidos graxos, porém em concentrações diferentes; outros diferiram tanto na concentração quanto na composição (STAHL; KLUG, 1996).
Levantamento Bibliográfico 31
3.1.1 Biossíntese dos ácidos graxos
Acetil-CoA e malonil-CoA são os precursores dos ácidos graxos os quais, pela ação de enzimas e proteínas carreadoras de grupos acila (ACP), são convertidos a tioéster acil-enzima e malonil-ACP, respectivamente. Posterior condensação de Claisen dos grupos formados leva à formação do -acetoacil – ACP (etapa 1, Esq. 1, Pág. 32), que por redução estereosseletiva da carbonila com NADPH forma o -hidroxiacil – ACP (etapa 2, Esq. 1, Pág. 32). A desidratação forma um éster , -insaturado (etapa 3, Esq. 1, Pág. 32). A redução da ligação dupla com NADPH forma uma cadeia saturada com um grupo acil-ACP (etapa 4, Esq. 1, Pág. 32). Nesse ponto, o ácido graxo-ACP pode ter a inserção de mais unidades de malonil-ACP, aumentado a cadeia carbônica, ou sofrer hidrólise levando a formação do ácido graxo livre (etapa 5, Esq. 1, Pág. 32). Todas as etapas da formação dos ácidos graxos estão representadas no Esquema 1 (Pág. 32) (DEWICK, 2004).
Pela análise da biossíntese dos ácidos graxos conclui-se que a partir de uma unidade de acetato e sete malonatos é formado uma cadeia C16 (ácido palmítico) e com oito
malonatos uma cadeia C18 (ácido esteárico). Logo, em geral como as unidades formadoras
possuem dois átomos de carbono cada, os ácidos graxos possuem número par de átomos de carbono (DEWICK, 2004).
Levantamento Bibliográfico 32 (etapa 1) (etapa 2) (etapa 3) (etapa 4) (etapa 5) CH2CO SCoA
CO2H
ACP
CH2CO S
CO2H
ACP
malonil - CoA malonil - ACP
CH3CO SCoA
RCH2CO S Enz
acetil - CoA tioéster acil - enzima
RCH2COCH2CO S ACP
RCH2 CH2CO S ACP
OH H
H2O
NAD/FAD
-cetoacil - ACP β
ββ β
-hidroxiacil - ACP β
ββ β
RCH2
CO S ACP
α α α
α,ββββ - insasturadoacil - ACP
NADPH
RCH2CH2CH2COS ACP
ácido graxo - ACP
H2O
RCH2CH2CH2CO2H
ácido graxo livre
HSCoA
RCH2CH2CH2CO SCoA
Esquema 1: Etapas biossintéticas da formação dos ácidos graxos (DEWICK, 2004).
OH OP HO
R1CO SCoA OCOR
1 OP
HO R
2
CO SCoA
H2O
OCOR1 OP O
R2CO
OCOR1 OH O
R2CO R3CO SCoA OCOR1
OCOR3 O
R2CO
3-fosfato de glicerol 3-P-1-acilglicerol 3-P-1,2-diacilglicerol
1,2-diacilglicerol triacilglicerol
(triglicerídeo)
esterificação esterificação
esterificação
Levantamento Bibliográfico 33
Os ácidos graxos naturais geralmente contêm de quatro a trinta átomos de carbonos e os mais abundantes são aqueles com 16 ou 18 carbonos. A Tabela 1 mostra os principais ácidos graxos e como esses são nomeados (DEWICK, 2004).
Tabela 1: Principais ácidos graxos de ocorrência natural.
Saturados
butírico CH3(CH2)2CO2H 4:0 esteárico CH3(CH2)16CO2H 18:0
capróico CH3(CH2)4CO2H 6:0 araquidico CH3(CH2)18CO2H 20:0
caprílico CH3(CH2)6CO2H 8:0 behenico CH3(CH2)20CO2H 22:0
caprico CH3(CH2)8CO2H 10:0 lignocerico CH3(CH2)22CO2H 24:0
láurico CH3(CH2)10CO2H 12:0 cerótico CH3(CH2)24CO2H 26:0
miristico CH3(CH2)12CO2H 14:0 montânico CH3(CH2)26CO2H 28:0
palmítico CH3(CH2)14CO2H 16:0 melíssico CH3(CH2)28CO2H 30:0
Insaturados
palmitoleico CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7CO2H 16:1 (9c)
oléico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO2H 18:1 (9c)
cis-vacenico CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9CO2H 18:1 (11c)
linoleico CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO2H 18:2 (9c,12c)
-linoléico CH3CH2CH=CHCH2CH= CHCH2CH=CH(CH2)7CO2H 18:3 (9c,12c,15c)
γ-linoléico CH3(CH2)4CH=CHCH2CH= CHCH2CH=CH(CH2)4CO2H 18:3 (6c,9c,12c)
gadoleico CH3(CH2)9CH=CH(CH2)7CO2H 20:1 (9c)
araquidônico CH3(CH2)4CH=CHCH2CH= CHCH2CH= CHCH2CH
=CH(CH2)3CO2H
20:4 (5c,8c,11c,14c)
Abreviações 18:2 (9c,12c)
Número de átomos de carbono
Posição da ligação dupla
Estereroquímica da ligação dupla (c = cis; t = trans)
Levantamento Bibliográfico 34
3.2 Metabólitos secundários isolados de L. theobromae
A produção de metabólitos secundários oriundos de L. theobromae ainda é pouco
relatada e dentre os principais metabólitos isolados dessa espécie, destacam-se o ácido jasmônico (Fig. 3, Pág. 35) e diversas macrolactonas chamadas lasiodiplodinas (Fig. 4, Pág. 36).
Assim como na maioria dos fungos, a produção de metabólitos secundários é influenciada principalmente pelo meio de cultura utilizado (Tabela 2). A análise dos resultados descritos revela que a maioria dos metabólitos isolados de L. theobromae são
excretados para o meio e que o tempo de cultivo varia de 7 a 35 dias.
Tabela 2: Meios de cultura utilizados para a produção de metabólitos secundários por L.
theobromae.
Meio de cultura
Tempo (dias)
Parte da cultura
Metabólito
secundário Referência
A 7 meio 1-4 MIERSCH; SCHNEIDER, SEMBDNER 1987
A 7 meio 5-8 MIERSCH et. al., 1989
B 30 meio 1, 9-11 NAKAMORI et. al., 1994
B 35 meio 12 MATSUURA et. al., 1998a
B 30 meio 13-14 MATSUURA et. al., 1998a
B 35 micélio 15-17 YANG et. al., 2000
B 21 meio 18 MATSUURA et. al., 1998b
A 13 meio 19-23 MIERSCH; SCHNEIDER; SEMBDNER, 1991 C 13 meio 1, 11, 24-29 ALDRIDGE et. al., 1971
B 21 meio 30 HE; MATSUURA; YSHINARA, 2004
B 21 meio 31 LI et. al., 2005
(A) Agar-malte: glicose (50 g), farinha de soja (5 g), caldo de milho (15 mL), solução salina (5 mL) por litro, pH 5,4-5,6. Solução salina: KH2PO4 (0,5 g), MgSO4.7H2O (0,3 g), FeSO4.7H2O (10 mg), ZnSO4.7H2O (8,8 mg):L; (B) Batata-dextrose 2%; (C) Czapeck-Dox
O ácido jasmônico (1) e derivados são importantes reguladores celulares de plantas, descritos como metabólitos secundários em microrganismos. (CHEONG; CHOI, 2003). A análise da Tabela 2 revela que esses compostos são produzidos por L. theobromae
em todos os meios utilizados. Os de natureza ácida foram isolados a partir de tratamento dos extratos orgânicos do meio de cultura com Na2CO3, tornando possível a separação dos
mesmos. Os extratos ácidos foram submetidos a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando coluna de fase reversa (MIERSCH; SCHNEIDER, SEMBDNER 1987).
Levantamento Bibliográfico 35
hidrolisar a lactona. Algumas dessas macrolactonas foram isoladas por CLAE e outras por cromatografia em coluna convencional (Fig. 4, Pág. 36).
Outros metabólitos secundários, como diidroisocumarinas (9; 25), derivados do cicloexeno (10; 18), lactona (30), alcalóides indólicos (27-28) e éster linear (29) também foram isolados de L. theobromae (Fig. 5, Pág. 36). A lactona 30 foi injetada em frutos sadios
de banana, que depois de alguns dias desenvolveram os sintomas de patogenicidade desse fungo. Assim, a patogenicidade de L. theobromae foi atribuída a esse metabólito (HE;
MATSUURA; YOSHINARA, 2004).
O estudo da composição volátil de L. theobromae é relatado pela análise do
destilado do micélio em BDA(MATSUMOTO; NAGO, 1994). A isocumarina meleina (9), já relatada como metabólito secundário de L. theobromae, e outros dois metabólitos (32-33)
foram detectados por CG/EM (Fig. 6, Pág. 36).
CO2R
O
n 1 R = H; n = 1 5 R = CH2CH3; n = 1
7 R = H; n = 3 8 R = H; n = 4 11 R = CH3; n = 1
CO2H
HO
2
CO2H
O
4
CO2H
O
3
CO2H
O
6
CO2R
O OH
n 19 (S)-OH; n = 1 20 (R)-OH; n = 1 22 (R ou S)-OH; n = 3
CO2H
O
OH
21
O
CO2H
OH
23
Levantamento Bibliográfico 36
O
HO
O
O OCH3
12
O
HO
O OCH3
OH
13
O O
HO
R1 R2
R3
14 R1 = OCH3; R2 = H; R3 = (S)-OH
17 R1 = OH; R2 = H; R3 = (S)-OH
24 R1 = OCH3; R2 = CH3; R3 = H
26 R1 = OH; R2 = CH3; R3 = H
O
HO
O
R2
R1
R3
15 R1 = OCH3; R2 = (R)-OH; R3 = H
16 R = OH; R2 = H; R3 = (S)-OH
31 R1 = OCH3; R2 = H; R3 = (S)-OH
Figura 4: Lasiodiplodinas isoladas de L. theobromae.
O
O OH
R
9 R = H
25 R = OH
O O OH
O OH
18
OH
HO
O
N
R
10 27 R = CHO
28 R = CO2H
HO2C OC2H5 O
29
O O HO2C
30
Figura 5: Outros metabólitos secundários isolados de L. theobromae.
O
O OH
9
O H
O 32
OH
33
Levantamento Bibliográfico 37
3.3 Sesquiterpenos eremofilanos
O isolamento de um sesquiterpeno eremofilano neste trabalho (Item 4.2.1.1, Pág. 73) motivou um levantamento bibliográfico dessa classe de compostos, com ênfase nos eremofilanos fúngicos.
3.3.1 Eremofilanos naturais
Os sesquiterpenos eremofilanos são metabólitos secundários amplamente distribuídos em plantas e fungos, com alguns relatos em organismos marinhos, e que apresentam o esqueleto básico representado na Figura 7. A numeração do esqueleto eremofilano é confusa quando descrita na literatura em relação às metilas em C4 e C5. De acordo com o Dicionário de Produtos Naturais, a metila C15 encontra-se no carbono C-4, ao passo que C-5 encontra-se a metila de numeração 14. Os eremofilanos são sub-divididos em eremofilanos simples, eremofilanolídeos e furanoeremofilanos, seco- e abeoeremofilanos e
noreremofilanos (HILL, 1994).
1 2
4
3 5
6 7 8 9
10
12 11
13 14
15
Figura 7: Esqueleto básico de sesquiterpenos do eremofilanos.
Eremofilanos diméricos (34) (WU; YANG, SHI, 2005) e com cadeia lateral em C-3 (35) (HANAI et. al., 2005) são relatados em plantas dos gêneros Ligularia, enquanto
eremofilanos mais simples (36-37) têm ocorrido em espécies de Senecio (TORRES et. al.,
1999 e TORI; KAWAHARA; MASAKASU, 1998). O coral Paralemnalia thyrsoides,
Levantamento Bibliográfico 38
O OH
H O
OH H
34
O
O
O O
O
H
35
O
O
O H R
36
H
O O O HO
O O
37
OAc
OAc
38
Figura 8: Eremofilanos isolados de plantas e organismos marinhos.
3.3.2 Origem biogenética dos eremofilanos
Os terpenos constituem uma família de metabólitos secundários com grande variedade estrutural. São subdivididos de acordo com o número de átomos de carbonos presentes, sendo classificados em hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos
(C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40) (DEWICK,
2004). Biogeneticamente, os terpenos são oriundos das vias do mevalonato (MVA) e da triose-piruvato (MEP) (LEITE et. al., 2007).
Na rota do mevalonato as unidades formadoras dos terpenos são o pirofostato de dimetilalila (DMAPP) e o pirofosfato de alila (IPP). Inicialmente, três moléculas de acetil-coenzima A são usadas para formar o ácido mevalônico (MVA) através de diversas reações enzimáticas. Uma reação de descarboxilação-eliminação do MVA, na presença de ATP leva a formação do IPP, que sofre isomerização a DMAPP (Esq. 3, Pág. 39) (MANN, 1987).
Levantamento Bibliográfico 39
grupo metila, do esqueleto eudesmânico, é formado o esqueleto básico dos sesquiterpenos eremofilanos (Esq. 5, Pág. 39) (PINDER, 1977).
O OPP
O OH
H
P OH
HO O
O
ADP
- CO2
OPP H H H+
OPP isomerização
MVA IPP DMAPP
Esquema 3: Formação do IPP e DMAPP a partir do MVA.
cátion eudesmila OPP
DMAPP
OPP H H
OPP H H
OPP IPP
GPP OPP
H H
IPP
OPP H H
FPP
OPP
H
H+
Esquema 4: Formação do cátion eudesmila.
esqueleto
eudesmano eremofilanoesqueleto
Levantamento Bibliográfico 40
3.3.3 Eremofilanos fúngicos
O levantamento bibliográfico dos eremofilanos fúngicos foi realizado através do
softwareScifinder que disponibiliza informações da base de dados do Chemical Abstract, sem
restrição de período. Foi encontrado um total de 38 compostos (Fig. 9, Pág. 41), distribuídos em 12 espécies de fungos filamentosos. Vale ressaltar que nenhum dos sesquiterpenos eremofilanos foi isolado de L. theobromae.
Estruturalmente, os eremofilanos isolados apresentam oxidações em vários carbonos do esqueleto básico e alguns desses compostos estão na forma de ésteres em C-1 ou C-3, com cadeias laterais de até onze carbonos. O interesse por esses metabólitos vem crescendo, por apresentarem atividade biológica nas mais diferentes áreas (MCDONALD et.
al., 2004).
A bipolaroxina (45) mostrou atividade fitotóxica contra diversas espécies de plantas, podendo ser aplicada como herbicida no controle de pragas (SUGAWARA et. al.,
1985). Os eremofilanos isolados do fungo xilareaceous (74-75) tiveram sua atividade antibiótica e antifúngica descrita, chegando a 100% de inibição contra alguns fungos e bactérias (MIREAU: ANKE; STERNER, 2003). O eremofilano 40, isolado de Penicillum
roqueforti, apresentou atividades citotóxica, fungicida e bactericida elevadas (MOULÉ,
MOREAU, BOUSQUET, 1977). Os sesquiterpenos xilarenais A (69) e B (70) apresentaram boa seletividade como ligantes dos neuropeptídeos Y, que atuam no sistema nervoso central no controle de diversas funções fisiológicas. Vale ressaltar que diversos compostos naturais têm sido utilizados como ligantes para avaliar o desempenho desses neuropeptídeos (SMITH
et. al., 2002)
Dos 38 eremofilanos descritos de origem fúngica, quatro deles são tri
nor-sesquiterpenos (47-50). Esse tipo de sesquiterpeno é caracterizado pela perda de três átomos de carbono do esqueleto básico, neste caso tratando-se dos carbonos C-11, C-12 e C-13. São relatados oito eremofilanos com a hidroxila em C-3 acetilada (39-44, 71, 77-78) e treze como ésteres com cadeias saturadas, insaturadas e/ou ramificadas em C-3 ou C-1 (47-52, 67-70, 72 -75). Os eremofilanos que apresentam cadeia lateral ramificada têm substituintes nos carbonos C-2’, C-4’, C-6’ e C-8’, estando a maioria em C-6’.
Todos os eremofilanos isolados de P. roqueforti (39-44) por Moreau et. al. (1980)
apresentaram-se epoxidados nos carbonos C-1 e C-2. Eremofilanos epoxidados em outros carbonos foram isolados de Drechslera gigantea (55-59) (SUGAWARA et. al., 1993) e
Levantamento Bibliográfico 41
C-8 apresentam esse grupo , -insaturado, com exceção de 70 que possui um epóxido nessa posição. Os eremofilanos 51 e 53 foram identificados em cultura do fungo Dendryphiella
salina, juntamente com suas formas hemicetálicas 52 e 54, respectivamente (GUERRIERO et.
al., 1989).
R O O
O
O O
39 R = CH3
40 R = CHO
41 R = CH2OH
42 R = CONH2
O HO O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 43 O O
O OO
OH
44
Penicillum roqueforti
(MOREAU et. al.; 1980)
HO R
O
45 R = CHO
46 R = CH2OH
OH O O HO O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1` 2` 3` 4` 5` 6` 7` 8` 9` 47 Bipolaris cynodontis
(SUGAWARA et. al, 1985)
Dendryphiella salina
(GUERRIERO et. al. 1988; 1989)
OH O O R3 O R2 R1
48 R1 = R3 = H; R2 = OH
49 R1 = R2 = R3 = H
50 R1 = OH; R2 = R3 = H
Dendryphiella salina
(GUERRIERO et. al. 1989)
Levantamento Bibliográfico 42 O O O OH HO O O O OH OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1' 2' 3' 5' 4' 6' 7' 8' 9' 3
51 52
O OH HO O O OH OH O
53 54
Dendryphiella salina
(GUERRIERO et. al. 1989)
HO R
O O
O
55 R = CH3
56 R = CH2OH
HO R1
O O
R2R3
57 R1 = CH2OH; R2, R3 = CH2
58 R1 = CH3; R2 = CH2OH, R3 = OH
HO R1
O R2
60 R1 = CH3; R2 = H
61 R1 = CH2OH; R2 = H
62 R1 = CH3; R2 = OH
HO CH3
O
R2R1
63 R1, R2 = CH2
64 R1 = CH2OH; R2 = OH
HO
O O
H
59
HO CH2OH
O
OH CH2OH
65 HO O HO 66 Drechslera gigantea
(SUGAWARA et. al., 1993)
