Ausência de sinal no canal de fluorescência F1 ou 530 no controlo positivo (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control):
A selecção do canal de fluorescência na análise dos dados da PCR não corresponde à indicação do protocolo.
Seleccione para a análise dos dados o canal de fluorescência F1 ou 530 para a PCR analítica do C. trachomatis e o canal de fluorescência F3-Back-F1 ou 705/Back 530 para a PCR do Controlo
interno.
A programação do perfil de temperatura do instrumento LightCycler®
1.1/1.2/1.5 ou LightCycler® 2.0 estava incorrecta.
Compare o perfil de temperatura com as indicações do protocolo (ver capítulo 8.5 Programação dos instrumentos LightCycler®).
Composição incorrecta da reacção de PCR.
Reveja os passos com ajuda do esquema de pipetagem (ver capítulo 8.4 Preparação da PCR) e, se for o caso, repita a PCR.
As condições de conservação para um ou mais componentes do kit não corresponderam às instruções do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit indicadas no capítulo 2. Conservação ou a data de validade foi excedida.
Por favor, reveja tanto as condições de conservação como também a data de validade (ver etiqueta no kit) dos reagentes e, se for o caso, utilize um novo kit.
Sinal do Controlo interno enfraquecido ou até mesmo a ausência do
mesmo (desvio maior que Ct = 27 ±±±± 3; método de análise: Second
Derivative Maximum
)
no canal de fluorescência F3/Back-F1 ou 705/Back530 em caso de ausência simultânea de um sinal no canal F1 ou 530: As condições da PCR não correspondem ao protocolo.
Reveja as condições da PCR (ver acima) e, se for o caso, repita a PCR com as configurações corrigidas.
A PCR foi inibida.
Certifique-se de que seja utilizado um dos nossos procedimentos de purificação recomendados (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN) e seja fiel às instruções do fabricante.
Certifique-se de que seja efectuado o passo recomendado da centrifugação adicional para completa eliminação de resíduos de etanol antes da eluição na purificação do ADN (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN).
Ocorreram perdas de ADN por causa da purificação.
Se o Controlo interno foi adicionado à purificação, a ausência do sinal do Controlo interno pode significar que ocorreram perdas de ADN por causa da purificação. Certifique-se de que seja utilizado um dos nossos procedimentos de purificação recomendados (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN) e seja fiel às instruções do fabricante.
As condições de conservação para um ou mais componentes do kit não corresponderam às instruções do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit indicadas no capítulo 2. Conservação ou a data de validade foi excedida.
Por favor, reveja tanto as condições de conservação como também a data de validade (ver etiqueta no kit) dos reagentes e, se for o caso, utilize um novo kit.
Sinais nos controlos negativos no canal de fluorescência 705/Back 530
ou F3/Back-F1 da PCR analítica.
Ocorreu uma contaminação durante a preparação da PCR.
Repita a PCR com reagentes ainda não utilizados em réplicas.
Tape cada tubo de PCR, se possível logo após a adição da amostra a ser analisada.
Pipete o controlo positivo sempre no fim.
Certifique-se que a superfície de trabalho e os aparelhos sejam desinfectados frequentemente.
Ocorreu uma contaminação por causa da purificação.
Repita a purificação e a PCR da amostra a ser analisada com reagentes ainda não utilizados.
Certifique-se que a superfície de trabalho e os aparelhos sejam desinfectados frequentemente.
Se houver dúvidas ou problemas, por favor contacte o nosso suporte técnico.
11. Especificações
11.1 Sensibilidade analítica
Para o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, foram determinados tanto o limite de detecção analítica quanto o limite de detecção analítica de acordo com a purificação (limite de sensibilidade). O limite de detecção analítica de acordo com a purificação foi determinado através de amostras clínicas positivas para o C. trachomatis e de acordo com o método de purificação utilizado. O limite de detecção analítica, por sua vez, é determinado sem amostras clínicas e independente do método de purificação relacionado com o serotipo com uma concentração determinada.
Para determinar a sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5, foi criada
uma série de diluições padrão do C. trachomatis serotipo E de 2,1 a 0,00066 cópias de equivalentes de genoma bacteriano do C. trachomatis/µl (egb/µl) e esta foi analisada com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. As análises foram efectuadas em três dias diferentes, contendo cada uma delas oito determinações. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 está,
desta forma, estabelecido em 0,1 egb/µl. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectadas 0,1 egb/µl.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 foi determinada com uma série de diluições padrão de serotipo C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 nominais C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem.
Estas foram submetidas a uma purificação com o QIAamp DSP Virus Kit (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. A sua avaliação gráfica está representada na Fig. 15. O limite de detecção analítica (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 e levando-se em consideração a
purificação está, desta forma, estabelecido em 200 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 200 egb/ml .
Análise de probit: C. trachomatis Plus (LightCycler®1.1/1.2/1.5)
Fig. 15: Sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) sob a utilização do equipamento
LightCycler® 1.1/1.2/1.5.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III [Bacteria, Fungi]) do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 foi determinada com uma série de diluições padrão
egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram submetidas a uma purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III (volume de extração: 100 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção analítica (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 e levando-se em consideração a
purificação está, desta forma, estabelecido em 500 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 500 egb/ml .
Para determinar a sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do instrumento LightCycler® 2.0, foi criada uma série de diluições padrão do serotipo E C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 cópias de equivalentes de genoma bacteriano do C. trachomatis/µl (egb/µl) e esta foi analisada com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. As análises foram efectuadas em três dias diferentes, contendo cada uma delas oito determinações. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o instrumento LightCycler® 2.0 está, desta forma, estabelecido em 0,12 egb/µl. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 0,12 egb/µl.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 2.0 foi determinada com uma série de
diluições padrão do serotipo E C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 nominais
C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram
submetidas a uma purificação com o QIAamp DNA Mini Kit (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. A sua avaliação gráfica está representada na Fig. 16. O limite de detecção (p = 0,05) do
equipamento LightCycler® 2.0 e levando-se em consideração a purificação
está, desta forma, estabelecido em 350 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 350 egb/ml.
Análise de probit: C. trachomatis Plus (LightCycler®2.0)
Fig. 16: Sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) sob utilização do equipamento
LightCycler® 2.0.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III [Bacteria, Fungi]) do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 2.0 foi determinada com uma série de diluições padrão de serotipo E C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 nominais C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram submetidas a uma purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção analítica (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação
purificação está, desta forma, estabelecido em 400 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 400 egb/ml.
Para se obter a sensibilidade analítica levando-se em consideração a
purificação com o QIAamp Viral RNA Mini Kit do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 , assim como do LightCycler® 2.0, pode-se utilizar
uma sensibilidade comparável, como a utilizada para o instrumento em questão com o QIAamp DNA Mini Kit, pois os valores médios de perda pela purificação em ambos os métodos de extração utilizados estão entre 0,3 e 1,8 %.
11.2 Especificidade
A especificidade do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit é, em primeiro lugar, garantida através da selecção dos iniciadores (primers) e das sondas, assim como da selecção de condições de reacção optimizadas. Os iniciadores (primers) e as sondas foram verificados mediante uma análise de comparação de sequência quanto a eventuais homologias com todas as sequências publicadas em bancos de genes. A detecção de todos os serotipos relevantes foi assegurada através de um alinhamento do banco de dados e de um ensaio de PCR no instrumento LightCycler® com os seguintes
Tabela 1: Teste da especificidade dos serotipos relevantes
Clamídia Serotipo Fonte de referência C. trachomatis (F1 ou. 530)
Controlo interno (F3/Back-F1 ou. 705/Back 530) C. trachomatis A ATCC¤ (VR-571B) + + C. trachomatis B ATCC¤ (VR-573) + +
C. trachomatis Ba ATCCprep 1) ¤ (VR-347, + +
C. trachomatis C ATCC¤ (VR-872) + + C. trachomatis D ATCC¤ (VR-885) + + C. trachomatis E ATCC¤ (VR-348B) + + C. trachomatis F ATCC¤ (VR-346) + + C. trachomatis G ATCC¤ (VR-878) + + C. trachomatis H ATCC¤ (VR-879B) + + C. trachomatis I ATCC¤ (VR-880) + + C. trachomatis J ATCC¤ (VR-886) + + C. trachomatis K ATCC¤ (VR-887) + + C. trachomatis LGV I ATCC¤ (VR-901B) + + C. trachomatis LGV II ATCC¤ (VR-902B) + + C. trachomatis LGV II ATCC¤ (VR-577) + +
C. trachomatis LGV III ATCC¤ (VR-903) + +
¤ ATCC: American Type Culture Collection
A validação da especificidade foi realizada com 100 diferentes amostras de raspagem, 30 de urina e 30 de esperma humanas negativas para o
C. trachomatis que não geraram sinal com os iniciadores (primers) e sondas
específicas para o C. trachomatis contidos na C. trachomatis Plus LC Master. Para a determinação da especificidade do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, foi examinado o grupo de controlo, citado na Tabela 2, em relação à existência de reacções cruzadas. Nenhum dos agentes patogénicos testados era reactivo.
Tabela 2: Teste da especificidade dos kits com possíveis agentes patogénicos inter- reactivos.
Grupo de controlo C. trachomatis (F1 ou. 530) Controlo interno (F3/Back-F1 ou. 705/Back 530) Escherichia coli - + Candida glabrata - + Candida albicans - + Chlamydia psittaci - + Chlamydia pneumoniae - + Neisseria gonorrhoeae - + Salmonella enteritides - + Salmonella typhimurium - + Staphylococcus aureus - + Streptococcus pyogenes - + Streptococcus pneumoniae - + Proteus mirabilis - + Proteus vulgaris - + Enterococus faecalis - + Enterobacter cloacea - + Klebsiella pneumoniae - + Haemophilus parainfluenzae - + Bordetella pertussis - + Acinetobacter spp. - + Gardnerella vaginalis - +
Vírus da herpes simples 1 e 2 - +
11.3 Precisão
Os dados de precisão para o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do instrumento LightCycler® 2.0 possibilitam a averiguação da variância total do sistema de teste. Esta variância total compõe-se da Variabilidade Intra-Ensaio (variabilidade de amostras com a mesma concentração em um ensaio), da Variabilidade Inter-Ensaio (variabilidade devida à utilização de diversos aparelhos do mesmo tipo por pessoas diferentes do mesmo laboratório) e da Variabilidade Inter-Lote (variabilidade devida à utilização de diferentes lotes). Para este fim, apuram-se o desvio
padrão, a variância e o coeficiente de variação tanto para a PCR específica do agente patogénico como também para a de Controlo interno.
Estes dados foram apurados para o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit com serotipo E do C. trachomatis na concentração mais próxima do triplo do valor de limite de sensibilidade (2,1 egb/µl com purificação, 0,66 egb/µl sem purificação). As análises foram efectuadas contendo oito determinações. Os resultados do teste de precisão estão representados nos valores do Ct da curva de amplificação (Ct: threshold cycle, ver Tabela 3). De acordo com estes resultados, a flutuação estatística de uma amostra qualquer com a concentração determinada é de 3,95 % (Ct), 3,89 % (Ct) com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit e 3,47 % (Ct) com a purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III; para a detecção do Controlo interno é de 2,29 % (Ct), 3,48 % (Ct) com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit e 3,30 % (Ct) com a purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III. Estes valores baseiam-se na totalidade de cada um dos valores apurados nas variabilidades.
Tabela 3 (Parte I): Dados de precisão com base nos valores Ct.
Desvio
Padrão Variância Coeficiente de variação [%]
Variabilidade Intra-Ensaio:
Serotipo E C. trachomatis 0,66 egb/µl 0,29 0,08 0,91 Variabilidade Intra-Ensaio:
Controlo interno 0,32 0,10 1,41
Variabilidade Inter-Ensaio:
Serotipo E C. trachomatis 0,66 egb/µl 0,74 0,55 2,41 Variabilidade Inter-Ensaio:
Controlo interno 0,36 0,13 1,58
Variabilidade Inter-Lote:
Serotipo E C. trachomatis 0,66 egb/µl 1,35 1,81 4,23 Variabilidade Inter-Lote:
Controlo interno 0,47 0,22 2,00
Variância Total:
Serotipo E C. trachomatis 0,66 egb/µl 1,16 1,35 3,95 Variância Total:
Controlo interno 0,59 0,34 2,29
Tabela 3 (Parte II): Dados de precisão com base nos valores Ct com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit.
Desvio
Padrão Variância Coeficiente de variação [%]
Variabilidade Intra-Ensaio:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl 0,14 0,02 0,46 Variabilidade Intra-Ensaio:
Controlo interno 0,29 0,08 1,18
Variabilidade Inter-Ensaio:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl 0,78 0,61 2,46 Variabilidade Inter-Ensaio:
Controlo interno 0,74 0,55 3,15
Variabilidade Inter-Lote:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl 1,11 1,23 3,33 Variabilidade Inter-Lote:
Controlo interno 0,64 0,41 2,62
Variância Total:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl 1,26 1,59 3,89 Variância Total:
Tabela 3 (Parte III): Dados de precisão com base nos valores Ct com a purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III.
Standard- abweichung Varianz Variations- koeffizient [%] Variabilidade Intra-Ensaio:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl 0,14 0,02 0,44 Variabilidade Intra-Ensaio:
Controlo interno 0,28 0,08 1,10
Variabilidade Inter-Ensaio:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl 0,50 0,25 1,57 Variabilidade Inter-Ensaio:
Controlo interno 0,50 0,25 1,96
Variabilidade Inter-Lote:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µl l 1,39 1,93 4,17 Variabilidade Inter-Lote:
Controlo interno 0,83 0,69 3,30
Variância Total:
Serotipo E C. trachomatis 2,1 egb/µ 1,13 1,29 3,47 Variância Total:
Controlo interno 0,66 0,43 3,30
11.4 Robustez
A verificação da robustez serve para apurar a taxa total de erro do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. Para este efeito, foram misturadas 30
amostras de urina, 100 de raspagem e 30 de esperma negativas para o
C. trachomatis com ADN de controlo do C. trachomatis (cerca de três vezes a
concentração dos limites de sensibilidade analíticos) purificadas com o QIAamp DNA Mini Kit (esperma e amostras de raspagem), QIAamp Viral RNA Mini Kit (amostras de urina) e MagNA Pure DNA Isolation Kit (amostras de urina, raspagem e esperma) e analisadas com o
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN).
A taxa de erro para o C. trachomatis foi de 0 % para a totalidade das amostras. A robustez do Controlo interno foi verificada adicionalmente através da purificação e da análise de 30 amostras de urina, 100 de raspagem e 30
Não foram observadas inibições. Deste modo, a robustez do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit é ≥ 99 %.
11.5 Reprodutibilidade
Os dados da reprodutibilidade permitem avaliar regularmente o desempenho do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, assim como para compará-lo com o desempenho de outros produtos através da participação em ensaios colaborativos de controlo externo de qualidade.
11.6 Avaliação diagnóstica
O artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit está a ser avaliado em vários estudos.
11.6.1 Comparação de amostras de urina e raspagem com o
COBAS
®Amplicor CT/NG Assay
Na comparação do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit com o COBAS®
Amplicor CT/NG Assay, foram analisadas 107 amostras retrospectivas de raspagem e urina.
Sensibilidade diagnóstica
No estudo, a sensibilidade com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 100 %. Não foram observadas inibições.
Especificidade diagnóstica
A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 100 %.
Tabela 4: Resultados dos estudos de validação comparativos.
COBAS® Amplicor
+ -
+ 49 0
artus C. trachomatis Plus
11.6.2 Comparação de amostras de esperma com o COBAS
®Amplicor CT/NG Assay
Em uma comparação do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit com o COBAS® Amplicor CT/NG Assay, foram analisadas 65 amostras de esperma prospectivamente.
Sensibilidade diagnóstica
Para as 65 amostras retrospectivas de esperma testadas, foi observada uma correlação do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kits de 100 % com o COBAS® Amplicor Assay. A taxa de inibição está em torno de 0 %.
Especificidade diagnóstica
A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 100 %.
Tabela 5: Resultados dos estudos de validação comparativos.
COBAS® Amplicor CT/NG Assay
+ -
+ 16 0
artus C. trachomatis Plus
PCR Kit - 0 49
11.6.3 Comparação de amostras de urina e raspagem com o
LCx
®e Aptima
®Combo 2™ Assay
Na comparação do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit com o de kit de reacção em cadeia de ligase (LCx® CT Assay) e o TMA (transcription mediated amplification [APTIMA® Combo 2™ Assay]), foram analisadas 234 amostras retrospectivas de raspagem e de urina.
Sensibilidade diagnóstica
No estudo, a correlação da reacção em cadeia de ligase (LCx® CT Assay) e
do Aptima® Combo 2™ Assay com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 99 % para amostras retrospectivas de raspagem e de urina.
Especificidade diagnóstica
A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 100 %.
Tabela 6: Resultados dos estudos de validação comparativos.
LCx®/Aptima® Combo 2™
+ -
+ 107 0
artus C. trachomatis Plus
PCR Kit - 1 126
11.6.4 Exame de amostras clínicas de raspagem do olho
Cem amostras clínicas de raspagem do olho previamente testadas foram analisadas retrospectivamente com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. Sensibilidade diagnóstica
Para as amostras de raspagem do olho previamente testadas, a sensibilidade do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 100 %.
Especificidade diagnóstica
A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit foi de 100 %.
Tabela 7: Resultados dos estudos de validação comparativos.
Resultado esperado
+ -
+ 5 0
artus C. trachomatis Plus