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Índice
1.
Conteúdo... 5
2.
Conservação ... 5
3.
Materiais e aparelhos necessários adicionalmente ... 6
4.
Medidas gerais de segurança... 6
5.
Informações acerca do agente patogénico ... 7
6.
Princípio da PCR em Tempo Real (Real-Time PCR).... 7
7.
Descrição do produto... 8
8.
Protocolo... 9
8.1 Pré-analítica: colheita, conservação e transporte de amostras... 9
8.1.1 Colheita de amostras... 9
8.1.2 Conservação de amostras... 12
8.1.3 Transporte de amostras ... 13
8.2 Isolamento de ADN ... 14
8.2.1 Recomendações para a purificação das amostras de urina com o QIAamp Viral RNA Mini Kit... 16
8.2.2 Recomendações para a purificação das amostras de raspagem e esperma com o QIAamp DNA Mini Kit ... 17
8.2.3 Recomendações para a purificação das amostras liofilizadas ou sublimadas com o QIAamp DNA Mini Kit 19 8.3 Controlo interno ... 20
8.4 Preparação da PCR ... 22
8.5 Programação dos instrumentos LightCycler®... 26
8.5.1 Programação do instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 .. 26
8.5.2 Programação do instrumento LightCycler® 2.0 ... 28
9.1 Análise dos dados da PCR do instrumento
LightCycler® 1.1/1.2/1.5 ... 31
9.2 Análise dos dados da PCR do instrumento LightCycler® 2.0 ... 34
10.
Resolução de problemas ... 38
11.
Especificações... 40
11.1 Sensibilidade analítica... 40 11.2 Especificidade ... 44 11.3 Precisão... 46 11.4 Robustez ... 49 11.5 Reprodutibilidade... 50 11.6 Avaliação diagnóstica... 5011.6.1 Comparação de amostras de urina e raspagem com o COBAS® Amplicor CT/NG Assay ... 50
11.6.2 Comparação de amostras de esperma com o COBAS® Amplicor CT/NG Assay... 51
11.6.3 Comparação de amostras de urina e raspagem com o LCx® e Aptima® Combo 2™ Assay... 51
11.6.4 Exame de amostras clínicas de raspagem do olho... 52
12.
Indicações especiais sobre a utilização do produto. 53
13.
Informações de segurança ... 53
14.
Controlo de qualidade... 53
15.
Referência bibliográfica ... 54
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit
Para utilização com o instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 ou
LightCycler® 2.0.
1. Conteúdo
Legenda e conteúdo N° Art. 4559063 24 reacções N° Art. 4559065 96 reacçõesAzul C. trachomatis Plus LC Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Amarelo C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol¤ 1 x 400 µl 1 x 400 µl
Vermelho LC/RG Positive Control C. trachomatis Plus 1 x 200 µl 1 x 200 µl Verde C. trachomatis Plus LC IC¤ 1 x 1.000 µl 2 x 1.000 µl
Branco Water (PCR grade) 1 x 1.000 µl 1 x 1.000 µl
IC = Controlo interno Mg-Sol = Solução de magnésio
2. Conservação
Os componentes do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit são conservados a -20°C e devem ser utilizados antes do fim da data de validade indicada no rótulo. A repetida descongelação e congelação (> 2 x) deve ser evitada, pois, devido a isto, a sensibilidade pode ser reduzida. No caso de utilização irregular, os reagentes devem, por isso, ser divididos em alíquotas. Se houver a necessidade de conservar os componentes a +4°C, não se deve ultrapassar um período de cinco horas.
3. Materiais e aparelhos necessários
adicionalmente
Luvas de laboratório isentas de pó
Kit de isolamento de ADN (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN) Pipetas (reguláveis)
Pontas de pipetas estéreis com filtros Misturador vórtex
Centrífuga de mesa com rotor para tubos de reacção de 2 ml
Color Compensation Set (Roche Diagnostics, Cat. N°: 2 158 850) para a criação de um arquivo Crosstalk Color Compensation para o instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 ou LightCycler® 2.0
LightCycler® Multicolor Demo Set (Cat. N°: 03 624 854 001) para o
instrumento LightCycler® 2.0
Capilares LightCycler®(20 µl) LightCycler® Cooling Block
Instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 (versão 3.5 do software) ou
LightCycler® 2.0 (versão 4.0 do software)
LightCycler® Capping Tool
4. Medidas gerais de segurança
O utilizador deve ter sempre em atenção o seguinte:Utilizar pontas de pipetas estéreis com filtros.
Armazenar, purificar e acrescentar à reacção os materiais positivos (amostras, controlos, produtos de amplificação) separados fisicamente dos restantes reagentes.
Antes de iniciar o teste, descongelar totalmente todos os componentes à temperatura ambiente.
Em seguida, misturar completamente e centrifugar brevemente os componentes.
5. Informações acerca do agente patogénico
As bactérias do género Chlamydia (C.) possuem a nível mundial um grande significado epidemiológico. A Chlamydia trachomatis (serotipos D - L) é um dos agentes patogénicos mundialmente mais frequentes em doenças sexualmente transmissíveis (STD - sexually transmitted diseases). Os 16 serotipos da C. trachomatis provocam diferentes doenças. Os serotipos A - C provocam o tracoma, uma doença recidivante crónica das conjuntivas e da córnea propagada nas regiões trópicas. Os serotipos D - K causam infecções urogenitais sexualmente transmissíveis e infecções dos olhos, assim como infecções em recém-nascidos após transmissão perinatal. Os serotipos LGV I - III causam o linfogranuloma venéreo, uma doença sexualmente transmissível que aparece principalmente nas regiões trópicas. O tracoma aparece quase exclusivamente em países tropicais com condições de higiene precárias. Ele representa a doença ocular mais frequente a nível mundial e é, depois das cataratas, a segunda causa mais frequente da cegueira. Supõe-se que cerca de 150 milhões de pessoas estejam infectadas. Em cerca de seis milhões dos infectados, a doença provocou cegueira. Nos países industrializados, as clamídias são os agentes patogénicos bacterianos mais frequentes das infecções urogenitais. Na Alemanha, estima-se o número de novas infecções genitais em cerca de 300.000 por ano. A incidência do linfogranuloma venéreo (linfogranuloma inguinal, doença de Durand-Nicolas-Favre) diminui mundialmente. Esta doença sexualmente transmissível ainda é endémica na Ásia, África, América do Sul e em partes do Caribe.
6. Princípio da PCR em Tempo Real (Real-Time
PCR)
No diagnóstico por meio de reacção de polimerização em cadeia (PCR), são amplificadas regiões específicas do genoma do agente patogénico. A detecção do material amplificado efectua-se com a ajuda de corantes fluorescentes na PCR em Tempo Real. Estes estão acoplados geralmente a
sondas oligonucleotídicas que se ligam especificamente ao material amplificado pela PCR. A detecção das intensidades de fluorescência no decorrer da PCR em Tempo Real possibilita a detecção e a quantificação dos produtos sem ter que se voltar a abrir os tubos das amostras depois de concluída a PCR (Mackay, 2004).
7. Descrição do produto
O artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit é um sistema pronto a utilizar para a detecção de ADN do C. trachomatis através da reacção de polimerização em cadeia (PCR) no instrumento LightCycler®. A C. trachomatis Plus LC Master contém os reagentes e enzimas para a amplificação específica de uma região de 106 pb do genoma do C. trachomatis e uma região de 111 pb do genoma do plasmídeo críptico do C. trachomatis, assim como para a detecção directa do material amplificado com o instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 ou LightCycler® 2.0. Ao mesmo tempo, o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit
contém um segundo sistema heterólogo de amplificação para a comprovação de uma possível inibição da PCR.
Produto da PCR Opção do canal de fluorescência
Instrumento LightCycler®
1.1/1.2/1.5 Instrumento LightCycler® 2.0
C. trachomatis F1 530
C. trachomatis Plus IC F3/Back-F1 705/Back 530
A amplificação e detecção destes Controlos internos (IC) não reduz o limite de detecção da PCR analítica do C. trachomatis (ver capítulo 11.1 Sensibilidade analítica). É fornecido um controlo positivo externo (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control).
8. Protocolo
8.1 Pré-analítica: colheita, conservação e transporte de
amostras
Atenção: Todas as amostras devem ser manuseadas como potencialmente infecciosas.
Só é permitida a utilização de materiais de amostras que respeitem imprescindivelmente as seguintes regras e regulamentos relativos à colheita, conservação e transporte:
1. Urina (mulheres e homens).
2. Raspagens oculares, endocervicais e uretrais. 3. Esperma.
Para garantir uma elevada qualidade de amostras, o transporte das mesmas para o laboratório de pesquisa deve ser efectuado o mais rapidamente possível. As amostras devem ser transportadas de acordo com as condições de temperatura indicadas.
8.1.1 Colheita de amostras
1. Amostras de urina
O/A paciente não pode ter urinado nas duas horas anteriores.
Colher 5 a 30 ml do primeiro jacto de urina num recipiente de propileno limpo sem conservantes. Não utilizar amostras de urina que tenham sido colhidas em recipientes com conservantes. Fechar e etiquetar o recipiente da amostra. Cumprir os regulamentos relativos à conservação e ao transporte.
2. Amostras de raspagem
Para colher amostras de raspagem oculares, endocervicais e uretrais, utilizar os seguintes materiais:
Utilizar exclusivamente zaragatoas de raspagem com extremidades de Dacron®, raiom ou alginato de cálcio, com hastes de plástico. Não utilizar
zaragatoa de raspagem com haste de alumínio ou de madeira.
Amostras de raspagem do olho, endocervicais e uretrais podem ser colhidas e transportadas em 1 a 3 ml dos seguintes médiuns:
AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation)
Cervical Sampler (Digene Corporation)
STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.)
2SP CTM (Bartels, Inc.)
Bartels ClamTrans™ CTM (Bartels, Inc.)
Mastazyme Chlamydia set de zaragatoas de raspagem (MAST DIAGNOSTICA)
Mastazyme Chlamydia meio de transporte (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA™ Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) MicroTrak II Chlamydia EIA Specimen Collection Kit (Trinity Biotech) Deixar a zaragatoa no meio de transporte da cultura. Fechar e etiquetar o
recipiente da amostra. Seguir os regulamentos relativos à conservação e ao transporte*.
Utilizar um processo recomendado para a colheita de células epiteliais cilíndricas e pavimentosas após a eliminação do muco cervical.
* Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W.
3. Amostras de esperma*
A colheita da amostra deve ser feita de dois a quatro dias após a ultima ejaculação.
A amostra de esperma deve ser colhida no mesmo dia do envio para o laboratório.
Sob utilização de procedimentos rotineiros de laboratório, a amostra de esperma pode ser colhida de um dos seguintes modos:
através da masturbação directamente para um recipiente estéril, limpo e seco. Certifique-se de que toda a amostra alcance directamente o recipiente. Caso se perca um pouco de amostra, deve ser feita uma anotação no protocolo de colheita.
através da masturbação sob utilização de um preservativo. Retire o preservativo após a ejaculação. É importante que ele seja seguramente fechado com um elástico para que a amostra de esperma fique retida no preservativo. Logo após, coloque o preservativo em um recipiente de transporte.
Importante: Somente utilize recipientes de amostra sem conservante ou preservativo sem espermicida e sem aditivos artificiais (por exemplo: corante).
Coloque a amostra de esperma durante 30 a 45 minutos no escuro (em uma gaveta ou um armário de parede, por exemplo) até que ela se torne liquefeita.
Directamente após a liquefação, congele a amostra em um tubo criogénico a -20°C ou a uma temperatura inferior.
* Referências:
1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine (http://uuhsc.utah.edu/andrology/).
8.1.2 Conservação de amostras
A eficácia do teste pode ser prejudicada pela congelação repetida ou por uma conservação mais longa da amostra.
1. Amostras de urina
Se as amostras de urina forem analisadas num período de 24 horas, elas podem ser conservadas à temperatura ambiente (19 a 23°C). Para uma análise realizada sete dias após a colheita, as amostras devem ser conservadas no frigorífico a uma temperatura de 2 a 8°C. As amostras de urina que não puderem ser analisadas num período de sete dias devem ser conservadas a -20°C, ou menos, num período de até 30 dias.
2. Amostras de raspagem
As amostras devem ser conservadas a uma temperatura de 2 a 8°C (se as amostras de raspagem tiverem que ser enviadas para um laboratório de pesquisa, elas devem ser despachadas o mais rápido possível após a colheita, de acordo com as instruções do laboratório para o transporte de amostras de clamídia).
Amostras de raspagem que não forem directamente testadas após a entrada no laboratório devem ser conservadas a uma temperatura de 2 a 8°C e analisadas num período de sete dias. Amostras de raspagem que não puderem ser analisadas num período de sete dias após a colheita devem ser conservadas a -20°C, ou menos, e testadas num período de 30 dias após a data de colheita.
3. Amostras de esperma
As amostras devem ser conservadas a -20°C ou temperaturas abaixo desta.
Amostras de esperma que não forem testadas directamente após a entrada no laboratório devem ser conservadas a -20°C ou temperaturas abaixo desta e testadas num período de 30 dias após a data de colheita.
8.1.3 Transporte de amostras
1. Amostras de urina
Amostras de urina a serem enviadas devem ser conservadas no frigorífico (2°a 8°C) até o envio. As amostras devem ser enviadas de acordo com os regulamentos locais e estatais relativos ao transporte de materiais infecciosos*.
2. Amostras de raspagem
As amostras têm de ser transportadas refrigeradas.
Se as amostras de raspagem tiverem que ser enviadas para um laboratório, elas devem ser despachadas o mais rápido possível após a colheita, de acordo com as instruções do laboratório para o transporte refrigerado. As amostras devem ser enviadas de acordo com os regulamentos locais e estatais relativos ao transporte de materiais infecciosos*.
3. Amostras de esperma
Se as amostras de esperma tiverem que ser enviadas para um laboratório de pesquisa, elas devem ser despachadas no mesmo dia após a colheita, de acordo com as instruções do laboratório para o transporte de amostras de clamídia.
Além disso, considere que as amostras de esperma devem ser enviadas refrigeradas. As amostras devem ser enviadas de acordo com os regulamentos locais e estatais relativos ao transporte de materiais infecciosos*.
8.2 Isolamento de ADN
Os kits de isolamento de ADN podem ser fornecidos por diversos fabricantes. Em função do protocolo do fabricante seleccionado, recolha o volume de amostra indicado para a purificação e efectue o isolamento de ADN conforme as instruções do fabricante. Os seguintes kits de isolamento são recomendados:
Material de
Amostra Kit de purificação Número de Catálogo Fabricante Carrier ARN
Urina,
raspagens QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) 52 904 QIAGEN contém Esperma,
raspagens QIAamp DNA Mini Kit (50) 51 304 QIAGEN não contém
A adição de Carrier-ARN é de grande importância para a eficiência e, com isso, para o rendimento do ADN/ARN. Caso o kit de isolamento utilizado não contenha Carrier-ARN, recomenda-se imprescindivelmente a adição de Carrier-ARN (RNA-Homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, Cat. No. 27-4110-01) para a extracção dos ácidos nucleicos de líquidos biológicos sem células ou de materiais com pequena quantidade de ADN/ARN (p. ex. líquido céfalo-raquidiano). Por favor, siga as seguintes instruções:
a) Para isso, ressuspenda o Carrier-ARN liofilizado em tampão de eluição (não em tampão de lise) do kit de isolamento (p. ex. tampão AE do QIAamp DNA Mini Kit) e crie uma diluição com uma concentração de 1 µg/µl. De acordo com a quantidade exigida, divida a solução de Carrier-ARN em alíquotas que devem ser armazenadas a -20°C. Evite a repetida descongelação (> 2 x) de uma alíquota de Carrier-ARN.
b) Por purificação, deve ser adicionado 1 µg de Carrier-ARN por 100 µl de tampão de lise. Se o protocolo de extracção prevê, por exemplo, 200 µl de tampão de lise por amostra purificada, então adicione 2 µl do Carrier-ARN (1 µg/µl) directamente ao tampão de lise. Antes de iniciar qualquer purificação, deve ser feita uma mistura nova de tampão de lise e Carrier-ARN (e, se for o caso Controlo interno, ver
capítulo 8.3 Controlo interno) de acordo com o seguinte esquema de pipetagem.
Número de amostras 1 12
Tampão de lise p. ex. 200 µl p. ex. 2400 µl
Carrier-ARN (1 µg/µl) 2 µl 24 µl
Volume Total 202 µl 2424 µl
Volume para a purificação 200 µl cada 200 µl
c) Utilize a mistura de tampão de lise e Carrier-ARN para a purificação logo após a preparação. Não é possível conservar a mistura.
A adição de Carrier-ARN é de grande importância para a eficiência e, com isso, para o rendimento do ADN/ARN. Para obter uma estabilidade maior do Carrier-ARN QIAamp Viral RNA Mini Kit fornecido, recomendamos o procedimento a seguir, diferente do indicado nas instruções do kit de isolamento:
a. Antes da primeira utilização do kit de isolamento, ressuspenda o Carrier-ARN liofilizado em 310 µl de tampão AE ou AVE (tampão de eluição, concentração final 1 µg/µl, não utilizar tampão de lise) e, de acordo com a quantidade exigida, divida esta solução de Carrier-ARN em alíquotas que devem ser armazenadas a -20°C. Evite a repetida descongelação (> 2 x) de uma alíquota de Carrier-ARN.
b. Antes de iniciar qualquer purificação, deve ser feita uma mistura nova de tampão de lise e Carrier-ARN (e, se for o caso Controlo interno, ver capítulo 8.3 Controlo interno) de acordo com o seguinte esquema de pipetagem.
Número de amostras 1 12
Tampão de lise AVL 560 µl 6720 µl
Carrier-ARN (1 µg/µl) 5,6 µl 67,2 µl
Volume Total 565,6 µl 6787,2 µl
Volume para a purificação 560 µl cada 560 µl
c. Utilize a mistura de tampão de lise e Carrier-ARN para a purificação logo após a preparação. Não é possível conservar a mistura.
Em caso de purificação automática, recomenda-se o uso do seguinte sistema:
Material de
amostra Sistema de purificação Número de Catálogo purificação Kit de Número de Catálogo Fabricante Urina, raspagens, esperma MagNA Pure LC Instrument 12 236 931 001 MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III (Bacteria,
Fungi)
03 264 785 001 Diagnostics Roche
Nas purificações com tampões de lavagem que contêm etanol, efectuar sempre, antes da eluição, uma centrifugação adicional (três minutos, 16.000 x g) para a eliminação dos resíduos de etanol. Isto evita possíveis inibições da PCR.
O artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit não deverá ser utilizado em conjunto com procedimentos de purificação que utilizam fenol como base.
Importante: O Controlo interno do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit pode ser adicionado directamente na fase de purificação (ver capítulo 8.3 Controlo interno).
8.2.1 Recomendações para a purificação das amostras de urina
com o QIAamp Viral RNA Mini Kit
O tampão AVL contido no QIAamp Viral RNA Mini Kit foi desenvolvido especialmente para inactivar o grande número de inibidores presentes na urina. Por isso, recomendamos expressamente a utilização do protocolo do QIAamp Viral RNA Mini Kit para a extracção de ADN celular, bacteriano ou viral da urina.
Equilibre as amostras à temperatura ambiente (19 a 23°C).
Muitas vezes, na urina, está contida apenas uma pequena quantidade de bactérias e por isto recomendamos a concentração do material de análise. Para este fim, as amostras de urina (5 a 30 ml) a serem analisadas são centrifugadas durante 15 a 20 min com a capacidade máxima (18.000 x g) do aparelho (alternativa: 30
minutos a 3.000 x g). O sobrenadante é decantado e o precipitado é totalmente ressuspenso através da mistura no vórtex em intervalos de 15 a 30 segundos em 1.200 µl de 1 x PBS.
140 µl da amostra desta forma preparada devem ser adicionados para o isolamento de ADN.
Siga as instruções do Spin Protocolo QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) a partir do passo 1. É indispensável efectuar o passo opcional 9a do protocolo de
eliminação de resíduos de etanol (16.000 x g, três minutos). É recomendado um volume de eluição de 60 µl.
8.2.2 Recomendações para a purificação das amostras de
raspagem e esperma com o QIAamp DNA Mini Kit
Equilibre as amostras à temperatura ambiente (19 a 23°C).
Amostras de raspagem que são conservadas num meio para transporte devem ser bem misturadas no vórtex.
Retire com cuidado a tampa do tubo de amostra e certifique-se de que as luvas não foram contaminadas. Luvas contaminadas devem ser trocadas antes que a próxima amostra seja manuseada.
Pressione a zaragatoa contra a parede do tubo de reacção para retirar o excesso de líquido. Retire, com a zaragatoa, os possíveis restos de secreção contidos na amostra e pressione a mesma novamente contra a parede do tubo de reacção para retirar o excesso de líquido contido na secreção. Retire e elimine a zaragatoa com os restos de secreção.
Pipete 200 µl do meio de transporte juntamente com 180 µl de tampão ATL em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml e misture bem no vórtex.
As zaragatoas são transferidas directamente para tubos de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml e misturadas no vórtex com 180 µl de tampão ATL durante 15 a 30 segundos. Como alternativa, ponha 200 µl de tampão ATL no tubo para transporte e misture a zaragatoa no vórtex por 15 a 30 segundos no tubo. Logo após, transfira 180 µl
em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml. Pressione a zaragatoa contra a parede do tubo de reacção para retirar o líquido nela contido. Por fim, retire e elimine a zaragatoa.
Para a extracção de ADN das amostras de esperma, dilua 60 µl de material de amostra com 140 µl de 1 x PBS em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml. Depois de misturar cuidadosamente no vórtex, pipete 100 µl da diluição para 180 µl de tampão ATL. Misture-os em intervalMisture-os de vórtex de 15 a 30 segundMisture-os.
Adicione por amostra 20 µl de proteinase K, misture a mesma no vórtex e incube-a a 56°C por 15 minutos (raspagem) ou durante 1 a 12 horas (esperma). Misture ocasionalmente a amostra no vórtex durante a incubação ou coloque-a num misturador térmico. Lembre-se de que deve Lembre-ser utilizada a proteinaLembre-se K. A proteaLembre-se da QIAGEN tem uma actividade reduzida na presença do tampão ATL.
Na utilização de zaragatoa, pressione o líquido desta contra a parede do tubo de reacção. Retire e elimine a zaragatoa.
Centrifugue rapidamente o tubo de reacção de 1,5 ml para evitar contaminações cruzadas por respingamento do líquido das amostras contido na parte interior da tampa ao abrir o tubo.
Acrescente 200 µl do tampão AL, misture intensamente por 15 segundos no vórtex e incube a amostra por 10 minutos a 70°C. Centrifugue rapidamente os tubos de reacção de 1,5 ml para evitar contaminações cruzadas por respingamento do líquido das amostras contido na parte interior da tampa ao abrir o tubo. É muito importante misturar intensamente amostra e tampão AL a fim de se obter uma solução homogénea.
Adicione 200 µl de etanol (96 - 100 %) à amostra e misture-a novamente no vórtex por 15 segundos. Centrifugue rapidamente, por fim, os tubos de reacção para evitar contaminações cruzadas.
Adicione 500 µl da mistura (inclusive o precipitado) cuidadosamente – sem molhar a borda do recipiente na coluna QIAamp (em um Collection Tube de 2 ml). Feche a tampa com cuidado e centrifugue por um minuto a 6.000 x g (8.000 rpm). Coloque a coluna QIAamp em um Collection Tube de 2 ml como recipiente de coleta e elimine o
recipiente usado junto com o filtrado. Feche todas as colunas para evitar a formação de aerossóis durante a centrifugação.
Repita o último passo colocando toda o resto da mistura de amostra na coluna.
Abra cuidadosamente a coluna QIAamp e acrescente 500 µl de tampão AW1 sem molhar a borda. Feche a tampa com cuidado e centrifugue por um minuto a 6.000 x g (8.000 rpm). Coloque a coluna QIAamp em um Collection Tube de 2 ml como recipiente de coleta e elimine o recipiente usado junto com o filtrado.
Abra cuidadosamente a coluna QIAamp e acrescente 500 µl de tampão AW2 sem molhar a borda. Feche a tampa com cuidado e centrifugue por três minutos na intensidade máxima (p. ex. 16.000 x g). Elimine o Collection Tube usado junto com a descarga e coloque a coluna QIAamp em um Collection Tube de 2 ml como recipiente de coleta. Centrifugue por três minutos na intensidade máxima (p. ex. 16.000 x g). Coloque, por fim, a coluna QIAamp em um Collection Tube limpo de 1,5 ml como recipiente de coleta e elimine o recipiente usado junto com o filtrado.
Abra cuidadosamente a coluna QIAamp e acrescente 50 µl de tampão AE na coluna QIAamp. Incube por um minuto e centrifugue, por fim, a coluna por um minuto a 6.000 x g (8.000 rpm).
8.2.3 Recomendações para a purificação das amostras
liofilizadas ou sublimadas com o QIAamp DNA Mini Kit
Equilibre as amostras à temperatura ambiente (19 a 23°C).
Ressuspenda cuidadosamente a amostra liofilizada ou sublimada em 500 µl de 1 x PBS através de leves movimentos com a mão. Incube a amostra durante pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente para que ela se dissolva completamente. Use para isto um misturador (p. ex. misturador térmico).
Pipete 200 µl da amostra dissolvida para 360 µl de tampão ATL em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml e misture cuidadosamente no vórtex.
Adicione à amostra 20 µl de proteinase K, misture a mesma no vórtex e incube-a a 56°C durante 1 a 12 horas. Misture, ocasionalmente, a amostra no vórtex durante a incubação ou coloque-a num misturador térmico. Lembre-se de que deve ser utilizada a proteinase K. A protease da QIAGEN tem uma actividade reduzida na presença do tampão ATL.
Centrifugue brevemente os tubos de reação de 1,5 ml para evitar contaminações cruzadas através do derramamento de líquidos de amostra na parte interna da tampa ao abrir o tubo.
Adicione 400 µl de tampão AL à amostra, misture fortemente durante 15 segundos no vórtex e incube a amostra durante 10 minutos a 70°C.
Adicione 400 µl de etanol (96 a 100 %) à amostra e misture novamente no vórtex durante 15 segundos.
Coloque cuidadosamente 700ml da mistura (inclusive o precipitado) na coluna QIAamp sem deixar molhar a borda superior. Feche a tampa e centrifugue durante um minuto a 6.000 x g (8.000 rpm). Logo após, coloque a coluna QIAamp em um Collection Tube de 2 ml limpo (contido no kit) e exclua o Collection Tube utilizado juntamente com o filtrado. Repita este passo ao colocar o resto da solução da mistura da amostra na coluna.
Siga o “Tissue Protocol” (QIAamp DNA Mini Kit e QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, página 35) a partir do passo 6. É indispensável efectuar o passo opcional 7a do protocolo de
eliminação de resíduos de etanol (16.000 x g, três minutos). É recomendado um volume de eluição de 50 µl do tampão AE.
8.3 Controlo interno
É fornecido um Controlo interno (C. trachomatis Plus LC IC) com o qual se tem a possibilidade de controlar não só a purificação do ADN como também uma possível inibição da PCR (ver Fig. 1). Para este fim, adicione o Controlo interno numa relação de 0,1 µl por 1 µl do volume de eluição na purificação. Se utilizar, por exemplo, o QIAamp DNA Mini Kit e eluir o ADN
em 200 µl de tampão de AE, então adicione 20 µl de Controlo interno. Se, p. ex., eluir em 100 µl, então adicione respectivamente 10 µl. A quantidade de
Controlo interno acrescentada depende apenas do volume de eluição. O Controlo interno e eventualmente o Carrier-ARN (ver capítulo 8.2 Isolamento
de ADN) podem ser acrescentados apenas a uma mistura de tampão de lise e amostra ou directamente ao tampão de lise
O Controlo interno não pode ser adicionado directamente à amostra. Ter em
atenção que a mistura do Controlo interno com o tampão de lise/Carrier-ARN deverá ser utilizada logo após ser preparada. A conservação da mistura à temperatura ambiente ou no frigorífico pode em poucas horas desactivar o
Controlo interno e diminuir a eficiência da purificação. Não pipetar o Controlo interno e o Carrier-ARN directamente na amostra.
Para a purificação ser considerada eficaz, o valor Ct dos Controlos internos tem que ser Ct = 27 ± 3 (método de análise: Second Derivative Maximum). A dispersão indicada é causada através da variação do aparelho e da purificação. Um desvio maior aponta para problemas na purificação. Neste caso, ela tem que ser analisada e eventualmente revalidada. Se houver dúvidas ou problemas, contacte o nosso suporte técnico.
O Controlo interno pode ser utilizado, opcionalmente, exclusivamente para o controlo de uma possível inibição da PCR (ver Fig. 2). Para isso, adicione, para cada preparação, 1 µl de Controlo interno e 2 µl de
C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol directamente a 13 µl de
C. trachomatis Plus LC Master. Utilize para cada reacção de PCR 15 µl da
Master Mix* desta forma produzida e adicione, em seguida, 10 µl de amostra
purificada. Se tiver que preparar um ensaio com várias amostras, então aumente as quantidades necessárias de C. trachomatis Plus LC Master, de
* O aumento de volume causado através da adição do Controlo interno é desprezável na
C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol e de Controlo interno proporcionalmente
ao número de amostras (ver capítulo 8.4 Preparação da PCR).
8.4 Preparação da PCR
Certifique-se de que o Cooling Block com o adaptador nele contido (acessório do equipamento LightCycler®) tenha sido pré-refrigerado a aproximadamente
+4°C. Coloque para as reacções planeadas a quantidade necessária de capilares LightCycler® no adaptador do Cooling Block. Certifique-se de que sejam introduzidos, por ensaio de PCR, no mínimo um controlo positivo, assim como um controlo negativo (Water, PCR grade). Todos os reagentes devem ser totalmente descongelados à temperatura ambiente, bem misturados (pipetando para cima e para baixo várias vezes ou misturando brevemente no vórtex) e em seguida centrifugados antes do início do teste. Se desejar controlar, com o Controlo interno, não só a purificação do ADN como também uma possível inibição da PCR, o Controlo interno já deverá ter sido introduzido previamente na fase de purificação (ver capítulo 8.3 Controlo interno). Neste caso, utilize o seguinte esquema de pipetagem (ver também o esquema reproduzido na Fig. 1):
Quantidade de Amostras 1 12
C. trachomatis Plus LC Master 13 µl 156 µl
C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl
C. trachomatis Plus LC IC 0 µl 0 µl
1. Preparação da Master Mix
Volume Total 15 µl 180 µl
Master Mix 15 µl cada 15 µl
Amostra 10 µl cada 10 µl
2. Preparação da Reacção de
PCR Volume Total 25 µl cada 25 µl
Se desejar utilizar o Controlo interno exclusivamente para o controlo de uma inibição da PCR, então adicione-o directamente à C. trachomatis Plus
LC Master. Neste caso, utilize o seguinte esquema de pipetagem (ver
Quantidade de Amostras 1 12
C. trachomatis Plus LC Master 13 µl 156 µl
C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl
C. trachomatis Plus LC IC 1 µl 12 µl 1. Preparação
da Master Mix
Volume Total 16 µl* 192 µl*
Master Mix 15 µl* cada 15 µl*
Amostra 10 µl cada 10 µl
2. Preparação da Reacção de
PCR Volume Total 25 µl cada 25 µl
Pipete para o reservatório de plástico de cada capilar 15 µl da Master Mix. Em seguida, adicione 10 µl de eluído do isolamento de ADN. De forma correspondente, devem ser colocados, como controlo positivo, 10 µl de
C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control e, como controlo negativo, 10 µl
de água (Water, PCR grade). Tape os capilares. Para deslocar o volume preparado do reservatório de plástico para dentro dos capilares, centrifugue os adaptadores e os capilares nele contidos numa centrífuga de bancada durante dez segundos, no máximo a 400 x g (2.000 rpm).
* O aumento de volume causado através da adição do Controlo interno é desprezável na
Adição do
Controlo interno para a purificação
2 µl de Mg-Sol* purificação mistura de tampão de lise/amostra + 0,1 µl de IC* por 1 µl de volume de eluição 10 µl de amostrapurificada* 15 µl de Master Mix*
capilares de vidro
LightCycler®
13 µl de
artus
Master*
Fig. 1: Fluxo esquemático da operação para o controlo da purificação e da inibição da PCR.
*
Em cada passo de pipetagem, certifique-se, sempre, de que as soluções a serem utilizadas tenham sido totalmente descongeladas, bem misturadas e brevemente centrifugadas.
Adição do
Controlo interno para o artus Master
2 µl de Mg-Sol*
purificação
10 µl de amostra
purificada* 15 µl de Master Mix*
capilares de vidro LightCycler® 13 µl de artus Master* 16 µl de Master Mix* 1 µl de IC*
Fig. 2: Fluxo esquemático da operação para o controlo da inibição da PCR.
*Em cada passo de pipetagem, certifique-se, sempre, de que as soluções a serem utilizadas tenham sido totalmente descongeladas, bem misturadas e brevemente centrifugadas.
8.5 Programação dos instrumentos
LightCycler
®8.5.1 Programação do instrumento
LightCycler
®1.1/1.2/1.5
Para a detecção de ADN do C. trachomatis, crie no seu instrumento
LightCycler® 1.1/1.2/1.5 um perfil de temperatura com os seguintes três
passos (conforme as Fig. 3 a Fig. 5).
A. Activação inicial da enzima Hot Start Fig. 3
C. Amplificação do ADN Fig. 4
E. Refrigeração Fig. 5
Tenha especial atenção às configurações Analysis Mode, Cycle Program Data e Temperature Targets. Estas configurações estão
destacadas nas figuras com caixa a negro. As indicações sobre a programação do instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 encontram-se no
LightCycler Operator’s Manual.
Fig. 4: Amplificação do ADN.
8.5.2 Programação do instrumento
LightCycler
®2.0
Para a programação do ensaio de PCR com o instrumento LightCycler® 2.0,
activar a opção New do menu e seleccione então o ítem LightCycler
Experiment.
Logo a seguir, para a detecção de ADN do C. trachomatis, crie no seu instrumento LightCycler® 2.0 um perfil de temperatura com os seguintes três
passos (conforme as Fig. Fig. 6 a Fig. 8).
A. Activação inicial da enzima Hot Start Fig. 6
C. Amplificação do ADN Fig. 7
F. Refrigeração Fig. 8
Certifique-se de que antes seja introduzido o número de capilares preparados para este ensaio de PCR (Max. Seek Pos., ver Fig. 6).
Fig. 7: Amplificação do ADN.
Para introduzir as especificações das amostras, activar o ítem Samples. Primeiro introduza na janela Capillary View o número total de reacções de
PCR planeadas para o ensaio de PCR (Sample Count).
Logo a seguir, coordene os nomes das amostras no Sample Name. Além disto, seleccione através do Selected Channels o canal de
fluorescência 530 para a detecção da PCR analítica do C. trachomatis e 705 para a detecção da PCR do Controlo interno.
Para a definição dos padrões e para a coordenação das concentrações respectivas, seleccione na Analysis Type a opção Absolute Quantification. Ter em atenção que a função Enable Controls não deverá ser activada.
Sob o ítem Target Name, podem ser coordenados os canais de fluorescência 530 e 705 seleccionados às sequências a detectar (C. trachomatis ou Controlo interno). O preenchimento do campo Target
Name pode ser facilitado através da função Auto Copy... . A definição do Target Name serve para a obtenção de uma visualização melhor, mas
não é obrigatoriamente necessária para a análise dos dados.
O perfil de temperatura programado pode ser salvo no disco rígido do computador para ser utilizado novamente em outros ensaios. Para isto, activar a função Save As... do menu File. Na janela aberta em seguida, seleccione o subítem Run Templates do Templates and Macros e salve nesta pasta os dados com um nome apropriado.
Para iniciar o ensaio de PCR, mude para o ítem Run e active a função
Start Run (ver Fig. 9). O programa da PCR é iniciado depois de introduzir
Fig. 9: Início do ensaio da PCR.
9. Análise dos dados
9.1 Análise dos dados da PCR do instrumento
LightCycler
®1.1/1.2/1.5
Recomendamos a utilização da versão 3.5 do Software LightCycler® para a
análise dos dados da PCR obtidos com o instrumento
LightCycler® 1.1/1.2/1.5.
Nas análises multicolores, ocorrem interferências entre os canais de fluorescência. O software do instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 contém um
arquivo indicado como Color Compensation File que compensa estas interferências. Abra este arquivo antes, durante o ensaio de PCR ou logo a seguir, através da activação do botão Choose CCC File ou Select CC Data. Se não estiver instalado nenhum Color Compensation File, crie o arquivo levando em consideração as instruções do LightCycler Operator’s Manual. Após activação do Color Compensation File, aparecem nos canais de fluorescência F1, F2 e F3 sinais separados. Para a análise dos resultados da PCR que foram obtidos com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, seleccione as funções de perspectiva F1 para a PCR analítica do
Os seguintes resultados podem ser obtidos:
1. É detectado um sinal no canal de fluorescência F1.
O resultado da análise é positivo: A amostra contém ADN do
C. trachomatis.
Neste caso, a detecção de um sinal no canal F3/Back-F1 é secundária, pois elevadas concentrações iniciais de ADN do C. trachomatis (sinal positivo no canal F1) podem conduzir a uma redução ou até mesmo à ausência do sinal de fluorescência do Controlo interno no canal F3/Back-F1 (competição).
2. Não é detectado nenhum sinal no canal de fluorescência F1 e é detectado um sinal no canal F3/Back-F1 (sinal do Controlo interno). Na amostra, não é detectável nenhum ADN do C. trachomatis, por
isso ela pode ser considerada negativa.
No caso de PCR negativa do C. trachomatis, o sinal do Controlo interno detectado exclui a possibilidade de uma inibição da PCR.
3. Nenhum sinal é detectado, nem no canal F1 e nem no canal F3/Back-F1. Não é possível fazer uma avaliação diagnóstica.
Indicações sobre fontes de erros e suas eliminações estão especificadas no capítulo 10. Resolução de Problemas.
Exemplos de reacções de PCR positivas e negativas estão reproduzidos nas Fig. 10 e Fig. 11.
Fig. 10: Detecção dos Padrões de quantificação (C. trachomatis
Plus LC/RG Positive Control) no canal de fluorescência F1 do
instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5. NTC: non-template
control (controlo negativo).
Fig. 11: Detecção do Controlo interno (IC) no canal de fluorescência F3/Back-F1 do instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 no caso
de amplificação simultânea dos controlos positivos (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control). NTC:
9.2 Análise dos dados da PCR do instrumento
LightCycler
®2.0
Utilize a versão 4.0 do Software LightCycler® para a análise dos dados da PCR obtidos com o instrumento LightCycler® 2.0. Considerar também as indicações contidas no LightCycler® 2.0 Instrument Operator's Manual
Version 4.0.
Siga o esquema seguinte para a análise dos dados da PCR (ver Fig. 12): Active a função Analysis no menu e seleccione a opção Absolute
Quantification, com a qual todos os dados da PCR gerados com o artus
LC PCR Kit deverão ser analisadas.
A versão 4.0 do software LightCycler® contém um arquivo indicado como
Color Compensation File que compensa as interferências dos sinais entre
os canais de fluorescência. Abra este arquivo durante o ensaio de PCR ou logo a seguir através da activação do botão Color Comp (On/Off) e depois do Select Color Compensation (ver Fig. 12). Se não estiver instalado nenhum Color Compensation File, crie o arquivo levando em consideração as instruções do LightCycler Operator’s Manual.
Após activação do Color Compensation File, aparecem sinais separados em cada um dos canais de fluorescência. Para a análise dos resultados da PCR que foram obtidos com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, seleccione as funções de perspectiva 530 para a PCR analítica do
C. trachomatis ou, respectivamente, 705/Back 530 para a PCR do Controlo interno.
Na janela de análise, aparece uma avaliação automática das amostras. O resultado é dado como positive (vermelho), negative (verde) ou uncertain (amarelo). Ao clicar a opção Advanced, são mostrados adicionalmente os valores Ct. Por favor, verifique a avaliação automática controlando, na janela do gráfico, a existência de uma curva de amplificação.
Fig. 12: Ativação do Color Compensation File e escolha do canal de fluorescência.
Depois de finalizadas as definições das opções de análise, podem ser obtidos os seguintes resultados:
1. É detectado um sinal no canal de fluorescência 530.
O resultado da análise é positivo. A amostra contém ADN do
C. trachomatis.
Neste caso, a detecção de um sinal no canal 705/Back 530 é secundária, pois elevadas concentrações iniciais de ADN do C. trachomatis (sinal positivo no canal 530) podem conduzir a uma redução ou até mesmo à ausência do sinal de fluorescência do Controlo interno no canal 705/Back 530 (competição).
2. Não é detectado nenhum sinal no canal de fluorescência 530 e é detectado um sinal no canal 705/Back 530 (sinal do Controlo interno). Na amostra, não é detectável nenhum ADN do C. trachomatis, por
isso ela pode ser considerada negativa.
No caso de PCR negativa do C. trachomatis, o sinal do Controlo interno detectado exclui a possibilidade de uma inibição da PCR.
3. Nenhum sinal é detectado, nem no canal 530 e nem no canal 705/Back 530.
Não é possível fazer uma avaliação diagnóstica.
Indicações sobre fontes de erros e suas eliminações estão especificadas no capítulo 10. Resolução de Problemas.
Exemplos de reacções de PCR positivas e negativas estão reproduzidos nas Fig. 13 e Fig. 14.
Fig. 13: Detecção do Controlo positivo(C. trachomatis Plus LC/RG
Positive Control) no canal de fluorescência 530 do
instrumento LightCycler® 2.0. NTC: non-template control
(controlo negativo).
Fig. 14: Detecção do Controlo interno (IC) no canal de fluorescência 705/Back 530 do instrumento LightCycler® 2.0 no caso de
amplificação simultânea dos Padrões de quantificação (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control). NTC:
10. Resolução de problemas
Ausência de sinal no canal de fluorescência F1 ou 530 no controlo positivo (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control):
A selecção do canal de fluorescência na análise dos dados da PCR não corresponde à indicação do protocolo.
Seleccione para a análise dos dados o canal de fluorescência F1 ou 530 para a PCR analítica do C. trachomatis e o canal de fluorescência F3-Back-F1 ou 705/Back 530 para a PCR do Controlo
interno.
A programação do perfil de temperatura do instrumento LightCycler®
1.1/1.2/1.5 ou LightCycler® 2.0 estava incorrecta.
Compare o perfil de temperatura com as indicações do protocolo (ver capítulo 8.5 Programação dos instrumentos LightCycler®).
Composição incorrecta da reacção de PCR.
Reveja os passos com ajuda do esquema de pipetagem (ver capítulo 8.4 Preparação da PCR) e, se for o caso, repita a PCR.
As condições de conservação para um ou mais componentes do kit não corresponderam às instruções do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit indicadas no capítulo 2. Conservação ou a data de validade foi excedida.
Por favor, reveja tanto as condições de conservação como também a data de validade (ver etiqueta no kit) dos reagentes e, se for o caso, utilize um novo kit.
Sinal do Controlo interno enfraquecido ou até mesmo a ausência do
mesmo (desvio maior que Ct = 27 ±±±± 3; método de análise: Second
Derivative Maximum
)
no canal de fluorescência F3/Back-F1 ou 705/Back530 em caso de ausência simultânea de um sinal no canal F1 ou 530: As condições da PCR não correspondem ao protocolo.
Reveja as condições da PCR (ver acima) e, se for o caso, repita a PCR com as configurações corrigidas.
A PCR foi inibida.
Certifique-se de que seja utilizado um dos nossos procedimentos de purificação recomendados (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN) e seja fiel às instruções do fabricante.
Certifique-se de que seja efectuado o passo recomendado da centrifugação adicional para completa eliminação de resíduos de etanol antes da eluição na purificação do ADN (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN).
Ocorreram perdas de ADN por causa da purificação.
Se o Controlo interno foi adicionado à purificação, a ausência do sinal do Controlo interno pode significar que ocorreram perdas de ADN por causa da purificação. Certifique-se de que seja utilizado um dos nossos procedimentos de purificação recomendados (ver capítulo 8.2 Isolamento de ADN) e seja fiel às instruções do fabricante.
As condições de conservação para um ou mais componentes do kit não corresponderam às instruções do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit indicadas no capítulo 2. Conservação ou a data de validade foi excedida.
Por favor, reveja tanto as condições de conservação como também a data de validade (ver etiqueta no kit) dos reagentes e, se for o caso, utilize um novo kit.
Sinais nos controlos negativos no canal de fluorescência 705/Back 530
ou F3/Back-F1 da PCR analítica.
Ocorreu uma contaminação durante a preparação da PCR.
Repita a PCR com reagentes ainda não utilizados em réplicas.
Tape cada tubo de PCR, se possível logo após a adição da amostra a ser analisada.
Pipete o controlo positivo sempre no fim.
Certifique-se que a superfície de trabalho e os aparelhos sejam desinfectados frequentemente.
Ocorreu uma contaminação por causa da purificação.
Repita a purificação e a PCR da amostra a ser analisada com reagentes ainda não utilizados.
Certifique-se que a superfície de trabalho e os aparelhos sejam desinfectados frequentemente.
Se houver dúvidas ou problemas, por favor contacte o nosso suporte técnico.
11. Especificações
11.1 Sensibilidade analítica
Para o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, foram determinados tanto o limite de detecção analítica quanto o limite de detecção analítica de acordo com a purificação (limite de sensibilidade). O limite de detecção analítica de acordo com a purificação foi determinado através de amostras clínicas positivas para o C. trachomatis e de acordo com o método de purificação utilizado. O limite de detecção analítica, por sua vez, é determinado sem amostras clínicas e independente do método de purificação relacionado com o serotipo com uma concentração determinada.
Para determinar a sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5, foi criada
uma série de diluições padrão do C. trachomatis serotipo E de 2,1 a 0,00066 cópias de equivalentes de genoma bacteriano do C. trachomatis/µl (egb/µl) e esta foi analisada com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. As análises foram efectuadas em três dias diferentes, contendo cada uma delas oito determinações. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o instrumento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 está,
desta forma, estabelecido em 0,1 egb/µl. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectadas 0,1 egb/µl.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 foi determinada com uma série de diluições padrão de serotipo C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 nominais C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem.
Estas foram submetidas a uma purificação com o QIAamp DSP Virus Kit (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. A sua avaliação gráfica está representada na Fig. 15. O limite de detecção analítica (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 e levando-se em consideração a
purificação está, desta forma, estabelecido em 200 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 200 egb/ml .
Análise de probit: C. trachomatis Plus (LightCycler®1.1/1.2/1.5)
Fig. 15: Sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) sob a utilização do equipamento
LightCycler® 1.1/1.2/1.5.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III [Bacteria, Fungi]) do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 foi determinada com uma série de diluições padrão
trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram submetidas a uma purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III (volume de extração: 100 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção analítica (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 e levando-se em consideração a
purificação está, desta forma, estabelecido em 500 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 500 egb/ml .
Para determinar a sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do instrumento LightCycler® 2.0, foi criada uma série de diluições padrão do serotipo E C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 cópias de equivalentes de genoma bacteriano do C. trachomatis/µl (egb/µl) e esta foi analisada com o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. As análises foram efectuadas em três dias diferentes, contendo cada uma delas oito determinações. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação com o instrumento LightCycler® 2.0 está, desta forma, estabelecido em 0,12 egb/µl. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 0,12 egb/µl.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 2.0 foi determinada com uma série de
diluições padrão do serotipo E C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 nominais
C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram
submetidas a uma purificação com o QIAamp DNA Mini Kit (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. A sua avaliação gráfica está representada na Fig. 16. O limite de detecção (p = 0,05) do
equipamento LightCycler® 2.0 e levando-se em consideração a purificação
está, desta forma, estabelecido em 350 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 350 egb/ml.
Análise de probit: C. trachomatis Plus (LightCycler®2.0)
Fig. 16: Sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit levando-se em consideração a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) sob utilização do equipamento
LightCycler® 2.0.
A sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação (MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III [Bacteria, Fungi]) do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 2.0 foi determinada com uma série de diluições padrão de serotipo E C. trachomatis de 2,1 a 0,00066 nominais C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram submetidas a uma purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. O limite de detecção analítica (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit utilizado em combinação
purificação está, desta forma, estabelecido em 400 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 400 egb/ml.
Para se obter a sensibilidade analítica levando-se em consideração a
purificação com o QIAamp Viral RNA Mini Kit do
artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do equipamento LightCycler® 1.1/1.2/1.5 , assim como do LightCycler® 2.0, pode-se utilizar
uma sensibilidade comparável, como a utilizada para o instrumento em questão com o QIAamp DNA Mini Kit, pois os valores médios de perda pela purificação em ambos os métodos de extração utilizados estão entre 0,3 e 1,8 %.
11.2 Especificidade
A especificidade do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit é, em primeiro lugar, garantida através da selecção dos iniciadores (primers) e das sondas, assim como da selecção de condições de reacção optimizadas. Os iniciadores (primers) e as sondas foram verificados mediante uma análise de comparação de sequência quanto a eventuais homologias com todas as sequências publicadas em bancos de genes. A detecção de todos os serotipos relevantes foi assegurada através de um alinhamento do banco de dados e de um ensaio de PCR no instrumento LightCycler® com os seguintes
Tabela 1: Teste da especificidade dos serotipos relevantes
Clamídia Serotipo Fonte de referência C. trachomatis (F1 ou. 530)
Controlo interno (F3/Back-F1 ou. 705/Back 530) C. trachomatis A ATCC¤ (VR-571B) + + C. trachomatis B ATCC¤ (VR-573) + +
C. trachomatis Ba ATCCprep 1) ¤ (VR-347, + +
C. trachomatis C ATCC¤ (VR-872) + + C. trachomatis D ATCC¤ (VR-885) + + C. trachomatis E ATCC¤ (VR-348B) + + C. trachomatis F ATCC¤ (VR-346) + + C. trachomatis G ATCC¤ (VR-878) + + C. trachomatis H ATCC¤ (VR-879B) + + C. trachomatis I ATCC¤ (VR-880) + + C. trachomatis J ATCC¤ (VR-886) + + C. trachomatis K ATCC¤ (VR-887) + + C. trachomatis LGV I ATCC¤ (VR-901B) + + C. trachomatis LGV II ATCC¤ (VR-902B) + + C. trachomatis LGV II ATCC¤ (VR-577) + +
C. trachomatis LGV III ATCC¤ (VR-903) + +
¤ ATCC: American Type Culture Collection
A validação da especificidade foi realizada com 100 diferentes amostras de raspagem, 30 de urina e 30 de esperma humanas negativas para o
C. trachomatis que não geraram sinal com os iniciadores (primers) e sondas
específicas para o C. trachomatis contidos na C. trachomatis Plus LC Master. Para a determinação da especificidade do artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit, foi examinado o grupo de controlo, citado na Tabela 2, em relação à existência de reacções cruzadas. Nenhum dos agentes patogénicos testados era reactivo.
Tabela 2: Teste da especificidade dos kits com possíveis agentes patogénicos inter-reactivos.
Grupo de controlo C. trachomatis (F1 ou. 530) Controlo interno (F3/Back-F1 ou. 705/Back 530) Escherichia coli - + Candida glabrata - + Candida albicans - + Chlamydia psittaci - + Chlamydia pneumoniae - + Neisseria gonorrhoeae - + Salmonella enteritides - + Salmonella typhimurium - + Staphylococcus aureus - + Streptococcus pyogenes - + Streptococcus pneumoniae - + Proteus mirabilis - + Proteus vulgaris - + Enterococus faecalis - + Enterobacter cloacea - + Klebsiella pneumoniae - + Haemophilus parainfluenzae - + Bordetella pertussis - + Acinetobacter spp. - + Gardnerella vaginalis - +
Vírus da herpes simples 1 e 2 - +
11.3 Precisão
Os dados de precisão para o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit sob a utilização do instrumento LightCycler® 2.0 possibilitam a averiguação da variância total do sistema de teste. Esta variância total compõe-se da Variabilidade Intra-Ensaio (variabilidade de amostras com a mesma concentração em um ensaio), da Variabilidade Inter-Ensaio (variabilidade devida à utilização de diversos aparelhos do mesmo tipo por pessoas diferentes do mesmo laboratório) e da Variabilidade Inter-Lote (variabilidade devida à utilização de diferentes lotes). Para este fim, apuram-se o desvio
padrão, a variância e o coeficiente de variação tanto para a PCR específica do agente patogénico como também para a de Controlo interno.
Estes dados foram apurados para o artus C. trachomatis Plus LC PCR Kit com serotipo E do C. trachomatis na concentração mais próxima do triplo do valor de limite de sensibilidade (2,1 egb/µl com purificação, 0,66 egb/µl sem purificação). As análises foram efectuadas contendo oito determinações. Os resultados do teste de precisão estão representados nos valores do Ct da curva de amplificação (Ct: threshold cycle, ver Tabela 3). De acordo com estes resultados, a flutuação estatística de uma amostra qualquer com a concentração determinada é de 3,95 % (Ct), 3,89 % (Ct) com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit e 3,47 % (Ct) com a purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III; para a detecção do Controlo interno é de 2,29 % (Ct), 3,48 % (Ct) com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit e 3,30 % (Ct) com a purificação com o MagNA Pure DNA Isolation Kit III. Estes valores baseiam-se na totalidade de cada um dos valores apurados nas variabilidades.
