RESULTADOS DA ANÁLISE DO ÍNDICE ANGIOGÊNICO

A avaliação dos espécimes imunomarcados com o anticorpo anti-CD34 revelou imunoexpressão deste epítopo em células individuais e grupos de células endoteliais com lúmen vascular distinto. A análise do índice angiogênico, por meio da MVC, demonstrou, para o grupo dos APs, valores médios que variaram de 19,8 a 87,6, com uma média de 40,4 microvasos (Figuras 17, 18 e 19). Em relação aos CACs, foram observados valores médios que variaram de 7,8 a 52,8, com uma média de 21,2 microvasos (Figuras 20, 21 e 22). Para os CMEs, os valores médios variaram de 21,2 a 127,4, com uma média de 66,5 microvasos (Figuras 23, 24 e 25). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis revelou existir diferença estatisticamente significativa entre os grupos, com maiores índices angiogênicos em CMEs e menores em CACs (p < 0,001) (Tabela 5) (Gráfico 2).

Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o índice angiogênico (CD34), em relação aos grupos de neoplasias de glândulas salivares. Natal, RN – 2012.

Grupos N Mediana Q25-Q75 Média dos

postos

KW P

Adenoma pleomórfico 20 36,00 25,40 - 48,50 29,35 22,059 < 0,001 Carcinoma adenóide cístico 20 19,60 12,85 - 27,65 14,58

Carcinoma mucoepidermóide 10 61,10 48,75 - 80,05 39,65 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Gráfico 2. Box-plot relativo à quantidade de microvasos (CD34) nos APs, CACs e CMEs. Natal, RN – 2012.

A distribuição dos casos de acordo com os subtipos histológicos dos APs e CACs e os valores médio, mínimo e máximo dos índices angiogênicos (CD34) é apresentada nas Tabelas 6 e 7. Por sua vez, a distribuição dos casos de acordo com a gradação histológica de malignidade dos CMEs e os valores médio, mínimo e máximo dos índices angiogênicos (CD34) é apresentada na Tabela 8. Em virtude do pequeno número de casos no subtipo histológico celular dos APs e sólido dos CACs, bem como nos CMEs de alto grau e de grau intermediário, não foi possível realizar a análise estatística de possíveis diferenças nos índices angiogênicos (CD34) entre os diversos subtipos histológicos/ graus histológicos destes tumores de glândula salivar.

Tabela 6. Tamanho da amostra, média e valores máximo e mínimo do índice angiogênico (CD34) em relação aos subtipos histológicos dos APs. Natal, RN – 2012.

Subtipos histológicos N Média Valor mínimo Valor máximo

Clássico 14 38,3 19,8 69,8

Celular 2 65,9 44,2 87,6

Mixóide 4 35,3 20,4 71,4

Tabela 7. Tamanho da amostra, média e valores máximo e mínimo do índice angiogênico (CD34) em relação aos subtipos histológicos dos CACs. Natal, RN – 2012.

Subtipos histológicos N Média Valor mínimo Valor máximo

Tubular 5 24,3 13,0 36,8

Cribriforme 13 21,1 7,8 52,8

Sólido 2 14,6 12,8 16,4

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Tabela 8. Tamanho da amostra, média e valores máximo e mínimo do índice angiogênico (CD34) em relação aos graus histológicos de malignidade dos CMEs. Natal, RN – 2012.

Grau histológico N Média Valor mínimo Valor máximo

Baixo grau 6 61,4 21,2 115,6

Grau intermediário 2 96,6 65,8 127,4

Alto grau 2 51,6 41,4 61,8

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Foram analisadas possíveis correlações entre o índice angiogênico (CD34) e os escores de expressão de GLUT-1 nos APs, CACs e CMEs. Para todos os grupos estudados, não foram constatadas correlações significativas entre a quantidade de microvasos e a expressão de GLUT-1 (Tabela 9). De forma similar, a análise conjunta dos 50 casos de neoplasias de glândulas salivares demonstrou não haver correlações significativas entre o índice angiogênico e os escores de expressão de GLUT-1 (r = 0,211; p = 0,141).

Tabela 9. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) para o índice angiogênico (CD34) em relação aos escores de expressão de GLUT-1 nos APs, CACs e CMEs. Natal, RN – 2012.

Grupos N R P

Adenoma pleomórfico

CD34 x GLUT-1 20 0,282 0,228

Carcinoma adenóide cístico

CD34 x GLUT-1 20 0,186 0,433

Carcinoma mucoepidermóide

CD34 x GLUT-1 10 - 0,450 0,192

Figura 17. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no AP padrão clássico. (ENVISION, 400X)

Figura 18. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no AP padrão mixóide. (ENVISION, 400X)

Figura 19. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no AP padrão celular. (ENVISION, 400X)

Figura 20. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no CAC padrão cribriforme. (ENVISION, 400X)

Figura 21. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no CAC padrão tubular. (ENVISION, 400X)

Figura 22. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no CAC padrão sólido. (ENVISION, 400X)

Figura 23. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no CME de baixo grau. (ENVISION, 400X)

Figura 24. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no CME de grau intermediário. (ENVISION, 400X)

Figura 25. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação pelo CD34 no CME de alto grau. (ENVISION, 400X)

6 DISCUSSÃO

Tumores de glândulas salivares compõem um grupo vasto de neoplasias benignas e malignas. Dentro deste grupo, o Adenoma Pleomórfico é de longe o tumor mais frequente. Entre os malignos, o Carcinoma Adenóide Cístico e Carcinoma Mucoepidermóide são os tumores de maior incidência, havendo, entretanto, uma alternância na liderança entre estas duas neoplasias em estudos epidemiológicos com muitos casos. Em virtude de seus aspectos histológicos diversos, características clínicas e comportamento biológico, as neoplasias de glândulas salivares são alvo de pesquisas que buscam elaborar uma melhor classificação, predizer o prognóstico e aperfeiçoar as modalidades terapêuticas para este grupo de patologias (GOODE; EL-NAGGAR, 2005; SOPRANI et al., 2007; SPEIGHT, 2007; ARAÚJO et al. 2008; ITO et al., 2009; KRUSCHEWSKY et al. 2011).

O AP representa cerca de 60% de todas as neoplasias das glândulas salivares (EVESON et al. 2005). É um tumor benigno composto por células epiteliais e mioepiteliais arranjadas em padrões morfológicos variados. Possui, na maioria das vezes, crescimento lento e indolor. Quanto ao segmento clínico, geralmente é inofensivo, havendo, entretanto, relatos de recidiva e, em casos esporádicos, transformação maligna para tumores agressivos (PRADO; TAVEIRA, 2006; ARAÚJO et al. 2008; SOARES et al. 2012).

O CAC é um dos tumores malignos mais incidentes em glândulas salivares, compreendendo cerca de 10% de todos os tumores que acometem estas estruturas. Esta neoplasia é alvo de atenção devido ao seu aspecto microscópico, comportamento biológico agressivo representado por índice frequente de recidiva e disseminação sistêmica, que pode ser descoberta anos depois da retirada do tumor, comprometendo, desta forma, o prognóstico do paciente (Del NEGRO et al. 2007; BIANCHI et al. 2008; COSTA et al. 2010).

O CME é apontado como o tumor maligno mais frequente das glândulas salivares, representando cerca de 12 a 30% de todos os tumores deste grupo, sendo mais incidente em glândula salivar menor, onde cerca de 50% dos tumores recebem esse diagnóstico histopatológico. É composto por células mucosas, intermediárias e epidermóides em proporções variadas. Tem comportamento agressivo, com invasão local e metástases distantes, em alguns casos (GOODE; AUCLAIR; ELLIS, 1998; LIMA et al. 2005; OLIVEIRA et al. 2009; KRUSCHEWSKY et al. 2011).

A classificação histológica, principalmente de tumores malignos, tem se revelado importante ferramenta para predizer o prognóstico dos mesmos. Os APs são graduados histologicamente clássico, mixóide e celular. Na maioria das vezes, esse tumor, independente

do seu padrão histológico, tem bom prognóstico, embora existam relatos de recidiva em casos esporádicos (EVESON et al. 2005; SPEIGHT, 2007; ITO et al. 2009).

Os CACs, com base na morfologia predominante (tubular, cribriforme e sólido) são graduados em grau I, II e III. Geralmente, os tumores grau II e III exibem pior prognóstico (EL-NAGGAR; HUVOS, 2005; COSTA et al. 2010). O CME é graduado em baixo, grau intermediário e alto grau de malignidade de acordo com a quantidade de células mucosas, intermediárias e epidermóides, bem como a quantidade de espaços císticos, presença de invasão, necrose, mitoses e anaplasia presentes na lesão. À semelhança dos CACs, quanto maior a gradação histológica do CME mais desfavorável é o prognóstico (AUCLAIR; GOODE; ELLIS, 1992; GOODE; AUCLAIR; ELLIS, 1998; EL-NAGGAR; HUVOS, 2005). No presente estudo, foram incluídos casos de APs, CACs e CMEs, os quais exibiam seus subtipos histológicos característicos. Os APs apresentavam, predominantemente, o padrão clássico, seguido do subtipo mixóide e do celular. Os CACs exibiram mais frequentemente o padrão cribriforme, seguido do tubular e sólido. Com relação aos CMEs os tipos histológicos encontrados foram, em ordem decrescente de frequência, baixo, intermediário e alto grau de malignidade.

Tumores benignos e malignos se desenvolvem em múltiplas etapas, as quais são importantes para a sua progressão indo desde células molecularmente alteradas, até tumores clinicamente visíveis (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; BELL et al., 2008; MARQUES et al. 2008). Dentre os fatores essenciais para a tumorigênese, destaca-se a angiogênese, processo complexo onde células tumorais adquirem a capacidade de liberar fatores pró- angiogênicos (VOLPERT; DAMERON; BOUCK, 1997; NETTO et al. 2008; ELLEDGE, 2009).

Estudos com enfoque na angiogênese tumoral visam associar a quantidade de vasos existentes no tumor com o seu comportamento clínico/biológico. Alguns destes estudos consideram o tipo ou subtipo histológico do tumor e a quantidade de vasos que a lesão tumoral foi capaz de induzir. Geralmente, tumores de grau histológico mais alto revelam maior formação de vasos e, consequentemente, pior prognóstico (GASPARINI; HARRIS, 1995; GONG et al., 2005; KOLEV et al., 2007; JOBIM et al. 2008; YAN et al., 2008).

Estudos em carcinomas de mama, laringe, endométrio, entre outros, revelam uma associação positiva entre a maior formação de vasos e tumores com gradação histológica mais elevada (GRUDZINSKI et al. 2006; MARIONE et al. 2011). A mesma associação tem sido verificada em alguns estudos em tumores de glândulas salivares (ZHANG; PENG; CHEN, 2005; SHI et al. 2007; COSTA et al. 2008; SHIEH et al. 2009; CARDOSO et al. 2009). Vale

citar ainda, que estes estudos vêm auxiliando a formular quimioterápicos que possam interferir diretamente e localmente nesse processo, auxiliando no tratamento dessas doenças (DALLES et al. 2003; FONSATTI et al. 2010).

Outra característica a ser ressaltada, com relação à tumorigênese, é a capacidade que células tumorais têm de alterar seu metabolismo energético, passando de aerobiose para anaerobiose, mesmo que haja considerável demanda de oxigênio para o suprimento da massa tumoral. Alguns estudos tem buscado enfatizar esta característica em certos tumores, procurando correlacioná-la ao prognóstico dos mesmos e, para esta finalidade, o marcador que se destaca é a GLUT-1 (MATSUZU et al. 2004; ENDO et al. 2007; AYALA et al. 2010; COOK; FIGG, 2010).

A GLUT-1 é a principal proteína transportadora de glicose encontrada em todas as células de órgãos e tecidos. Tem como função regular a entrada de glicose nas células, garantindo a homeostasia das reações bioquímicas necessárias ao funcionamento do organismo. Fisiologicamente, situações de demanda metabólica aumentada elevam os níveis de expressão desta proteína. Patologicamente, acredita-se que a sua alta expressão em algumas neoplasias, possa ser considerada um indício de progressão e agressividade tumoral (MACHADO; SCHAAN; SERAPHIN, 2006; CHOI et al. 2007; COOK; FIGG, 2010; THORENS; MUECKLER, 2010).

Os resultados da pesquisa de Ayala et al. (2010) em Carcinomas Epidermóides Orais, revelaram que houve alta expressão desta proteína em 135 dos 142 casos estudados. Dados semelhantes foram observados na pesquisa em sarcomas ósseos realizada por Endo et al. (2007) onde dos 67 casos estudados, 56 (83%) exibiram a superexpressão da referida proteína. Da mesma forma os estudos de Matsuzu et al. (2004) em tecidos normais e neoplásicos malignos de tireóide, mostraram que a expressão da GLUT-1 em tumores de tireóide é superior a encontrada em tecidos em estado de normalidade. Embora sejam evidenciadas na literatura algumas pesquisas avaliando a expressão da GLUT-1 em neoplasias, quando analisados os tumores de glândulas salivares, isto ainda é escasso (MORI et al. 2007; BONFITTO et al. 2010; DEMASI et al. 2010; COSTA et al. 2012).

Com base nestas observações, nesta pesquisa procurou-se verificar através da imuno- histoquímica o índice angiogênico avaliado pela expressão do CD-34 no estroma peri e intra- tumoral de uma série de casos de APs, CACs e CMEs, associando-o com a expressão da proteína GLUT-1 pelas células tumorais afim de correlacionar os achados da contagem microvascular ao metabolismo destas células e relacionar ao comportamento clínico das

lesões estudadas, expresso pelos diferentes graus histológicos apresentados por estas neoplasias.

Considerando os escores de expressão da GLUT-1 no parênquima das lesões, na presente pesquisa a maioria dos APs (40%) revelou expressão desta proteína em até 25% das células (escore 1). No grupo dos CACs (40%) e dos CMEs (80%), a maioria exibiu expressão desta proteína em mais de 50% das células tumorais (escore 3). A maioria das análises prévias sobre a expressão da GLUT-1 em tumores de glândulas salivares foram direcionadas ao estudo de alguns tipos de tumores particularmente, CACs e CMEs (BONFITTO et al.,2010; DEMASI et al., 2010).

Mori et al. (2007) estudaram a imunomarcação da GLUT-1 em nove diferentes tumores de glândulas salivares, representados por Mioepitelioma, Adenoma Pleomórfico, Carcinoma Adenóide Cístico, Carcinoma de Células Acinares, Carcinoma Epitelial Mioepitelial, Carcinoma Mioepitelial, Carcinoma Mucoepidemóide, Carcinoma do Ducto Salivar e Carcinossarcoma, além de fazer um estudo comparativo com tecido de glândula salivar normal. Nos seus resultados, a expressão da GLUT-1 nos tecidos normais de glândulas salivares foi negativa e maior em tumores malignos do que nos benignos.

A expressão da referida proteína no estudo de Mori et al. (2007) foi marcadamente elevada, principalmente, naqueles tumores considerados de alto grau de malignidade, tais como Carcinoma do Ducto Salivar e Carcinossarcoma. Ainda nos estudos de Mori et al. (2007) quando analisados somente APs, CACs e CMEs, o índice de expressão da GLUT-1 foi de 4.2, 9.1 e 10.5, respectivamente. Embora sejam metodologias diferentes, pode-se dizer que os resultados da presente pesquisa são condizentes com os dos autores citados acima, uma vez que na presente pesquisa foi evidenciada predominância de escore 1 em APs e escore 3 em CACs e CMEs.

Bonfitto et al. (2010) compararam a imunoexpressão da GLUT-1 em CACs histologicamente convencionais e com áreas de transformação para alto grau, onde estas últimas áreas exibiram maior expressão para esta proteína. Da mesma forma, os estudos que abordam a expressão da GLUT-1 em CMEs, buscaram verificar se existe expressão diferencial da referida proteína nos subtipos histológicos deste tumor. Os resultados da pesquisa de Demasi et al. (2010) demonstraram que CMEs classificados como de alto grau de malignidade exibiram maior expressão da GLUT-1 do que os outros subtipos histológicos.

Não foi possível no presente trabalho, à semelhança dos estudos já citados, comparar a expressão da GLUT-1 considerando os diferentes graus histológicos de cada tumor, pelo fato

de existirem poucos casos do subtipo histológico celular em APs, sólido nos CACs, assim como o subtipo histológico intermediário e alto grau de malignidade em CMEs.

Com relação à localização da expressão da GLUT-1 nas células tumorais, foi identificado que, na grande maioria dos casos, houve imunomarcação citoplasmática. A marcação membranar foi evidenciada em áreas focais, em alguns casos, em todos os tumores. Quando se analisou a intensidade da imunomarcação, observou-se que nos APs, onde havia áreas de metaplasia escamosa, esta marcação foi muito mais forte, assim como nas células epidermóides dos CMEs e em áreas de necrose em CACs. Estas características estão de acordo com as do estudo de Mori et al. (2007) e Bonfitto et al. (2010).

Desequilíbrios nas proporções de fatores pró e anti-angiogênicos produzidos por células tumorais constituem a base da neoformação vascular neste grupo de doenças. Este processo pode ser causado tanto pelo aumento dos níveis de fatores angiogênicos quanto pela diminuição dos anti-angiogênicos, ou ainda alterações concomitantes em ambos os fatores. O resultado desta alteração é a ativação de células endoteliais quiescentes, estímulo de sua proliferação e metabolismo e, por conseguinte, a neoformação vascular (DALES et al., 2003; SILVA et al., 2007; MARIONE et al., 2010).

Considera-se que tal processo proporciona o desenvolvimento de metástases por aumentar a chance de células tumorais penetrarem no sistema vascular neoformado que tem membrana basal mais permeável e menos resistente (DALES et al. 2003; ROMANI et al., 2006; Yue et al., 2006). Corroborando estas afirmativas, estudos em alguns tumores, como por exemplo, carcinomas colorretais, gástricos e de mama evidenciaram que a alta MVD encontrada nos mesmos, está associada com prognóstico ruim, maior potencial metastático, bem como maiores chances de recidiva (GASPARINI; HARRIS, 1995; GONG et al., 2005; KOLEV et al., 2007; YAN et al., 2008).

Em consonância com os trabalhos citados anteriormente, Kademani et al. (2009) estudaram a angiogênese em carcinomas epidermóides orais através da imunomarcação pelo CD34, verificando que tumores em estágios iniciais, mas que apresentavam imunomarcação difusa para este marcador, estavam associados a maiores taxas de infiltração em linfonodos regionais e recidiva do que aqueles tumores que exibiam padrão de marcação focal.

Com base nos estudos descritos previamente, seria esperado que tumores malignos de origem em glândulas salivares, à semelhança de outros processos neoplásicos, apresentassem também uma maior angiogênese, principalmente o CAC e o CME que exibem altas taxas de infiltração nos tecidos, além de invasão vascular, neural e com certa frequência metástases distantes. De fato, no estudo in vitro de Zhang e Peng (2007), foi constatado que linhagens

celulares de CACs de glândulas salivares com alto potencial metastático exibiam maior habilidade para angiogênese do que as linhagens celulares com baixo potencial para metástase.

A grande maioria das pesquisas para verificação da angiogênese em processos neoplásicos tem sido realizada em material incluído em parafina. Para esta finalidade, alguns agentes que atuam como marcadores imuno-histoquímicos de vasos são utilizados mais frequentemente, como por exemplo, o CD105 e o CD34. No estudo de Cardoso et al. (2009), o CD105 foi correlacionado com um mal prognóstico em tumores de glândulas salivares, pelo fato de não exibir imunomarcação em tecido glandular normal, ser rara em APs e CACs (exceto nos casos onde foi confirmado metástase), ser muito mais frequente em Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau e maiores em CMEs. Ainda para estes autores, a célula mioepitelial exerceria papel anti-angiogênico, controlando a formação de novos vasos.

Neste contexto, destacam-se os achados reportados por Costa et al. (2008) que estudaram a angiogênese pela imunomarcação tanto do CD105 quanto pelo CD34, em tumores de glândulas salivares com e sem diferenciação mioepitelial, sendo eles o CAC e o Carcinoma Epitelial Mioepitelial e o CME. Os resultados deste estudo evidenciaram que a MVD foi menor no grupo dos tumores com diferenciação mioepitelial, entretanto, concluíram que o fenótipo anti-angiogênico das células mioepiteliais pode não ser o único fator responsável pela menor angiogênese nesses tumores, pois, nos carcinomas com diferenciação mioepitelial a região intratumoral, onde existe maior proximidade entre células tumorais e vasos, não exibia menor MVD do que a região peritumoral e os CACs que continham quantidade exuberante de células mioepiteliais não exibiram menor MVD que os demais tumores deste mesmo grupo.

Ainda no estudo de Costa et al. (2008), tanto o CD105, que marca células endotelais ativadas no processo de neovascularização, quanto o CD34 que marca vasos normais e em neoformação, exibiram menor marcação em todos os tumores com diferenciação mioepitelial quando comparados aos sem esta diferenciação.

Estudos prévios e isolados de grupos de CACs (ZHANG; PENG E CHEN, 2005) e CMEs (SHI et al. 2007; SHIEH et al. 2009), onde foram analisadas a intensidade da imunomarcação e a MVD utilizando o CD-34 e, comparando a angiogênese nestes tumores de acordo com sua gradação histológica, verificaram que os casos classificados como sólido no grupo dos CACs e de alto grau de malignidade no grupo dos CMEs, exibiam maior intensidade de imunomarcação bem como maior MVD, do que os outros subtipos histológicos evidenciados nestas neoplasias.

Levando em consideração a diferenciação dos tumores de glândulas salivares e a semelhança da pesquisa reportada por Costa et al. (2008), na presente pesquisa procurou-se verificar o índice angiogênico de tumores com e sem diferenciação mioepitelial, utilizando para isto o CD34. Diferente dos estudos anteriores, o índice angiogênico foi obtido através da MVC, a qual revelou que os CACs exibiram menor índice angiogênico do que os CMEs, com médias de 21,2 e 66,5 microvasos, respectivamente. Tais achados assemelham-se aos resultados da pesquisa de Luukkaa et al. (2009), no qual os CACs exibiram intensidade de imunomarcação e MVD menores do que os CMEs. Apesar de se tratarem de metodologias diferentes, pode-se dizer que os achados da presente pesquisa são condizentes com os resultados dos estudos previamente reportados.

A média de microvasos para os APs foi de 40,4 microvasos, sendo esta superior à média dos CACs. Este achado discorda em parte dos resultados encontrados na pesquisa reportada por Huang et al. (2010), na qual foi investigada a MVD em APs, CACs e CMEs. Nos resultados, APs e CACs exibiram MVD muito menor que CMEs, entretanto os APs exibiram MVD ligeiramente menor que os CACs.

No presente trabalho, a MVC maior em APs do que em CACs pode sugerir que, possivelmente, outros fatores influenciem na angiogênese em tumores de glândulas salivares, e não somente a sua diferenciação, ou ainda poderia ser um reflexo do tempo de desenvolvimento desses tumores, pois, geralmente APs são neoplasias que crescem mais