Resultados dos Marcadores

2. Resultados dos Marcadores

Após a realização da imunohistoquímica para todas as pacientes, temos o painel de coloração demonstrado abaixo.

Na Figura 3 temos as imagens referentes as colorações do Grupo II. As imagens da lâmina do p^16INK4a e do Ki-67 com coloração 2+, e ausência de reação do HLA-G.

Figura 1. Imagens de lesões com displasia de baixo grau, em campo com aumento de 400x

Nota: A. imagem em HE; B. imunorreação do p^16INK4a; C. imunorreação do ki-67; D. Ausência de imunorreação do HLA-G.

Na Figura 4 temos as imagens referentes as colorações do grupo III. As imagens da lâmina do p^16INK4a e do Ki-67 com coloração 2+, e ausência de reação do HLA-G.

Figura 2. Imagens de lesões com displasia de alto grau, em campo com aumento de 400x

Nota: A. imagem em HE; B. imunorreação do p^16INK4a; C. imunorreação do ki-67; D. ausência de imunorreação do HLA-G.

Na Figura 5 temos as imagens referentes as colorações do grupo III. As imagens da lâmina do p^16INK4a, Ki-67 e HLA-G com coloração 2+.

Figura 3. Imagens de lesões com carcinoma, em campo com aumento de 400x

Nota: A. imagem em HE; B. imunorreação do p^16INK4a; C. imunorreação do ki-67; D. imunorreação do HLA-G.

Os resultados quanto aos testes de imunohistoquimicos estão apresentados na tebela 2.

Tabela 2. Resultado imunohístoquimico do p^16INK4a, Ki-67 e HLA-G

p16INK4a

Com relação aos marcadores tumorais e a imunohistoquímica, a positividade e a prevalência do p^16INK4a nos diferentes grupos é apresentada na Tabela 2. Os dados entre os grupos mostrou crescente de positividade, e se mostrou mais prevalente com 2+ de coloração nos grupos III e IV.

Ainda em relação ao p^16INK4a, numa análise detalhada, quando comparamos as mulheres com displasia de alto grau e carcinoma, com o grupo de displasia de baixo grau, houve diferença estatística de coloração de imunohistoquímica sendo fortemente positiva com p<0,001. E quando comparamos o grupo I com o grupo II não obtivemos significância, p=0,124; Assim como comparamos o grupo III x grupo IV, p=1 (Tabela 3).

Tabela 3. Análise entre os grupos

Grupos sob comparação Valor de p⁽¹⁾

p^16INK4a Ki-67

Controle x Displasia de baixo grau 0,124 1,000

Controle x Displasia de alto grau <0,001 <0,002

Controle x Carcinoma <0,001 <0,001

Displasia de baixo grau x Displasia de alto grau <0,001 <0,001

Displasia de baixo grau x Carcinoma <0,001 <0,001

Displasia de alto grau x Carcinoma 1,000 0,763

(1) Nível de significância pelo teste exato de Fisher; p<0,008.

Análise do Ki-67

Na análise do Ki-67, obtivemos resultados semelhantes ao p^16INK4a. Os grupos III e IV tiveram maior prevalência na intensidade 2+ na imunohistoquímica. No grupo controle e em mulheres com displasia de baixo grau, não houve nenhuma paciente com coloração intensa (2+).

Quanto a comparação entre os grupos, houve diferença estatística nas pacientes do grupo I e II quando comparadas as mulheres do grupo III e IV quanto a positividade deste marcador (p<0,001). Tabela 2. E não houve diferença quando comparamos entre os grupos I e II, p =1 e entre os grupos III e IV, p = 0,763 (Tabela 3).

Análise do HLA-G

Para o marcador HLA-G os testes não são aplicáveis pois obtivemos apenas 3 resultados positivos. O teste não apresenta poder de discriminação entre os grupos avaliados (Tabela 2).

Discussão

Neoplasia de colo do útero é o mais comum tumor ginecológico que afeta mulheres abaixo de 40 anos. De acordo com o National Cancer Institute - EUA, acomete principalmente mulheres jovens com intenção de gestação e vida sexual ativa,^26-27 conforme observamos também em nosso estudo.

O diagóstico precoce destas lesões de colo uterino evitaria tratamentos invasivos com consequentes disfunções urinárias e sexuais, assim como na fertilidade.^28-30 Em dois estudos prospectivos e randomizados, as mulheres que

realizaram intervenção cirúrgica para tratamento oncoginecológico tiveram uma piora na qualidade de vida sexual.^31-32 Em outro estudo prospectivo italiano de Ditto et al.,³⁰ acompanharam as mulheres que realizaram tratamento cirúrgico do colo uterino por neoplasia, e somente, 44% delas que tinham a intenção de gestação conseguiram ter filhos. No nosso estudo as mulheres com displasia de baixo e alto grau tinham em média 35 anos, sendo que 25/37 (67,5%) delas realizaram procedimento invasivo a partir do diagnóstico.

Nas mulheres acima de 40 anos, onde encontramos um pico de incidência para o diagnóstico de câncer de colo uterino, faz-se a necessidade de rastreamento com busca ativa para realizar o exame preventivo.³³ Oliveira et al.³⁴ demonstraram que a maioria destas mulheres não procuram atendimento médico por vergonha do exame preventivo. As pacientes do nosso estudo com câncer apresentavam a média de idade acima de 40 anos, o que sugere a falta de bons programas de rastreamento na nossa população.

Apenas a infecção por HPV não é condição suficiente para que a mulher desenvolva lesão de colo uterino. Moscicki et al.³⁵ num estudo de coorte, prospectivo, com seguimento de 50 meses, relataram que das 496 mulheres com o vírus do HPV, apenas 109 desenvolveram lesão neoplásica de colo de útero.

Das lesões de colo uterino, somente a minoria apresenta uma progressão para câncer. 80 a 90% das infecções causadas pelo HPV são transitórias, sendo eliminadas espontaneamente pelo organismo em cerca de 10 a 18 meses.^36-38 Em trabalhos prospectivos e randomizados, Skapa et al.³⁹ e Moscicki et al.⁴⁰ demonstraram que a taxa de progressão não passa de 19%. O uso de hormônio anticoncepcional e os subtipos 16 e 18 do HPV contribuiram para a não regressão destas lesões.⁴⁰ Ainda para um maior entendimento de quais mulheres terão essa progressão para lesões invasoras, iniciou-se uma busca por novos métodos e marcadores.^41-42

Um destes marcadores é o p^16INK4a. No epitélio cervical normal a expressão dele é ausente ou focalmente positivo em alguns casos de ASC e LIEBG.⁴³ Como também em nosso grupo controle onde o p^16INK4a foi negativo em todas as pacientes.

Por outro lado, todas as mulheres com carcinoma invasor de colo de útero tiveram p^16INK4a positivo, sendo 91,3% (21/23) consideradas fortemente positiva (2+). Assim como em outros estudos, a forte imunocoloração (>50%) do p^16INK4a em biópsias de

displasia de alto grau e carcinoma invasor, sugere que o p16 é um marcador de progressão para a carcinogêse cervical.^43-48

A maior heterogenicidade da imunocoloração do p^16INK4a está nas mulheres com LIEBG e LIEAG, e por esta razão está sendo avaliado como um marcador de progressão das lesões cervicais iniciais.⁴⁹ Em metanálise realizado por Tornesello et al.,⁷ sugere-se que naqueles casos de displasia de baixo grau em que temos o marcador p^16INK4a positivo, devemos fazer acompanhamento mais próximo para avaliar progressão. Em nosso estudo, 86% do grupo II e 100% do grupo III tinham o p^16INK4a positivo. Caso estas pacientes fizessem parte de um programa de prevenção com provas imunohistoquímicas com o p^16INK4a provavelmente algumas delas não seriam submetidas a tratamentos invasivos.

Apesar da alta prevalência deste marcador, Tsoumpou et al.⁵⁰ criticaram a falta de padronização da imunocoloração do p^16INK4a. Embora vários estudos correlacionam a intensidade da imunorreação do marcador com a lesão, não existe uma estratificação da positividade de coloração.⁵⁰ Pelo baixo número de pacientes, optamos por estratificar a coloração como positiva em apenas dois grupos (de 5 a 50%, e 51 a 100%).

Lesnikova et al.,⁴⁶ num estudo randomizado, com 796 pacientes, utilizaram protocolo de positividade na imunohistoquímica para o p^16INK4a com escore de 0 a 8 pontos. Esta pontuação estava de acordo com a intensidade e a percentagem de células coradas. O resultado, mostrou que as pacientes que tinham carcinoma invasor do colo de útero, ganharam os maiores escores (98,5%).⁴⁶ Embora não tenhamos em nosso estudo um número elevado de casos para subdividir as pacientes em 8 escores, quando estratificamos a coloração do marcador e comparamos os grupos obtivemos diferença estatística entre grupos II e III (p<0,001). Pela análise dos nossos dados, sugerimos que as 4 pacientes com displasia de baixo grau (4/15), com marcador fortemente positivo, requerem um monitoramente mais próximo. Da mesma forma, por termos apenas uma paciente (1/22) do grupo III com um p16 fracamente positivo, nos sugere que esta paciente poderia evoluir para regressão da lesão sem necessitar de um procedimento cirúrgico.

Outro marcador avaliado foi o Ki-67, uma proteína nuclear que esta presente em células com intensa proliferação celular. Naquelas pacientes em estágio mais avançado da doença, os valores de ki-67 também são mais elevados.⁵¹ O Prunoiu et al.,⁵¹ concluiram que o Ki-67 pode ser considerado um fator prognóstico da doença.

Em nosso estudo, também demonstramos que o Ki-67 é mais comumente positivo nos grupos LIEAG (13/22) e carcinoma (15/23), p<0,001. Nenhuma das pacientes do grupo I e II encontramos o valor 2+, e apenas 9/22 pacientes com displasia de alto grau encontramos marcador negativo ou uma cruz (+), o que nos favorece uma tendência prognóstica deste marcador (p<0,001).

Assim como Prunoiu et al.,⁵¹ outros autores também mostraram que o Ki-67 tem um valor prognóstico forte e independente para a progressão. Kruse et al.,⁵² Panjkovic e Ivkovic-Kapicl²⁰ e Mimica et al.⁵³ demonstraram o Ki-67 em displasia de alto grau e superexpresso (imunocoloração acima de 50%) em carcinomas de colo de útero.

Hanprasertpong et al.⁵⁴ também mostraram a positividade do Ki-67 em relação a progressão da doença. Em uma análise com 235 pacientes e acompanhamento acima de 5 anos, demonstrou que o ki-67 é um marcador de sobrevida livre de doença.⁵⁴ Entretanto Hanprasertpong et al.⁵⁴ e Ancuta et al.,⁵⁵, sugerem que o marcador tem mais valor para avaliação de recidiva e principalmente naqueles casos em que as mulheres realizaram radioterapia prévia.

Sari Aslani et al.⁴⁵ sugerem que o Ki-67 seja útil para mulheres com ASCUS e com NIC II para avaliar a progressão da doença, com valores preditivos positivos de 73,3 e preditivo negativo de 97,8%.

Nosso estudo não nos possibilitou avaliar chance de recidiva por ser um estudo transversal. Outra limitação foi não avaliarmos as mulheres com ASCUS e NIC II, por não subdividirmos nestes grupos e termos um número pequeno de casos. Mas assim como Reuschenbach M et al.⁵⁶ entendemos que o Ki-67 é um marcador simples, reprodutível e acessível.

Último marcador analisado é o HLA-G. Entre alguns tumores que afetam as mulheres, o carcinoma de ovário expressa o HLA-G em 61% das espécimes (45/74),⁵⁷ adenocarcinoma de endométrio em 55% (24/44),⁵⁸ e o câncer de mama em 39% (14/36).⁵⁹

Com relação ao colo uterino, Dong et al.⁶⁰ utilizando a imunohistoquímica e o marcador HLA-G, HC/mAb HGY concluiram que a expressão do HLA-G é associado não apenas ao progresso da doença, mas também à infecão pelo HPV.

Já Zheng et al.,⁶¹ utilizaram imunohistoquímica através do teste de Elisa e o marcador IHC/mAb 4H84, assim como Li et al.²² Nestas mulheres, quanto pior era o

estadiamento para o câncer, mais se encontrava positividade do HLA-G. No trabalho de Li et al.²² o estudo contou com 167 mulheres, e o marcador HLA-G não se expressou em mulheres sem lesão de colo uterino. Entretanto o marcador foi positivo naquelas com displasia de alto grau em 35%, e em 62,8% nas mulheres com carcinoma invasor.

Já no estudo realizado por Silva et al.,⁶² além da imunohistoquímica, também se utilizou análise molecular. Em 105 mulheres sexualmente ativas, identificaram uma associação positiva do HLA-G com mulheres portadoras de lesão de alto grau e câncer de colo de útero quando comparadas às mulheres sem lesão. Esta forte relação estava relacionada ao polimorfismo do HLA-G, alteração genética imposta pela lesão no gene HLA-G.⁶²

Em nosso estudo não houve positividade do marcador HLA-G nas amostras de colo uterino. O antígeno do teste do marcador utilizado tem característica de ter menor custo em relação aos testes moleculares do HLA-G realizados por Yang et al.⁶³ O custo inviabiliza o uso rotineiro destes testes, uma vez que buscamos o HLA-G. Isto pode ser explicado pela falta de padronização dos antígenos – anticorpos e da diluição do anticorpo do teste de imunohistoquímica utilizados. Vermeulen et al.⁶⁷ relatam que em alguns casos de lesões pré malignas e malignas, ocorre mutação genética em um alelo do HLA na região 6p2.3, que não tem imunorreação com a porção G do HLA.

O uso de diferentes antígenos – anticorpos HLA-G e a diferença na diluição podem ser responsáveis pela discrepância dos resultados encontrados nestes estudos. Assim como na metanálise de Gimenes et al.⁶⁸ sugerimos a padronização dos testes de HLA-G e desenvolvimento de mais estudos para fins de triagem diagnóstica.

Na literatura ainda há um consenso para as mulheres com displasia de alto grau realizarem um procedimento cirúrgico afim de tratamento destas lesões, mesmo conhecendo os riscos de afetar a qualidade de vida gestacional e sexual destas mulheres. Entretando esta busca por novos marcadores que evitem estes traumas

tem evoluído. Nosso trabalho abre a possibilidade de continuarmos estudando na busca e aprimoramento dos testes de rastreamento populacional.

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