UNIVERSIDADE POSITIVO
FABIO ROBERTO FIN
ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA DO P
16INK4A, KI-67 E HLA-G EM NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS E NO CÂNCER DE
COLO UTERINO
CURITIBA 2016
FABIO ROBERTO FIN
ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA DO P
16INK4A, KI-67 E HLA-G EM NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS E NO CÂNCER DE
COLO UTERINO
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial, do Programa de Mestrado Profissional em Biotecnologia Industrial da Universidade Positivo.
Orientador: Marcelo de Paula Loureiro Coorientadora: Thais Andrade Costa Casagrande
CURITIBA 2016
F491 Fin, Fabio Roberto.
Análise imunohistoquímico do p16INK4A, Ki-67 e HLA-G em neoplasias intraepiteliais cervicais e no câncer de colo uterino / Fabio Roberto Fin. ― Curitiba : Universidade Positivo, 2016.
76 f. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Positivo, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, 2016.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Paula Loureiro.
Coorientadora: Profa. Dra. Thais Andrade Costa Casagrande.
1. Biotecnologia. 2. Colo uterino - Câncer. 3. Neoplasia
intraepitelial cervical. I. Loureiro, Marcelo de Paula. II. Casagrande, Thais Andrade Costa. III. Título.
CDU 575
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Universidade Positivo e toda a equipe do Mestrado Profissional em Biotecnologia Industrial, pela oportunidade concedida a pesquisa e para a realização de um sonho.
Aos meus pais, Gian e Heloisa que sempre me apoiaram e acreditaram em meus projetos.
A minha esposa, Grazielle, pela paciência, amizade, conversas, leituras.
Obrigado pelo amor incondicional e pelas palavras de carinho em todos os momentos.
Ao meu filho, João Pedro, simplesmente obrigado por existir, pois sem você a vontade de seguir em frente com certeza não seria a mesma.
A minha irmã Andréa, mesmo sendo totalmente leiga neste assunto muito me auxíliou pela leitura e revisão.
Ao Prof. Dr. Marcelo Loureiro, meu orientador, incentivador e exemplo na pesquisa e em caráter. Sempre presente, agradeço muito pela orientação, ensinamentos, amizade e incentivo. Obrigado por confiar em meu trabalho, mesmo sendo algo que parecia distante, sempre me apoiou.
À Prof. Dr.a Thaís Casagrande, uma pessoa que sempre me incentivou, e que com seus ensinamentos me auxiliou ao entendimento sobre metodologia e imunohistoquímica.
A toda quipe do laboratório CITOLAB, especialmente a Dr.a Teresa Cavalcanti, pelos ensinamentos, auxílios e disponibilidade na realização das imunohistoquímicas.
Ao Dr. Giovane Loddo, pelos ensinamentos e auxílio com os materiais de biópsias.
Aos colegas de trabalho, Dr. Marciano Anghinoni e ao Dr. Eurico Campos, pela compreensão, incentivo e apoio nos momentos difíceis.
Ao acadêmicos da Faculdade Evangélica do Paraná, Guilherme e Raphaella, que me auxiliaram na coleta dos dados.
Ao Prof. Dr. Paolo Salvalaggio, pelas considerações, críticas e sugestões na banca de qualificação deste tabalho, contribuindo para a melhoria do mesmo.
Aos funcionários e diretores do Hospital São Vicente.
A todas as pacientes, motivo pela realização deste trabalho.
RESUMO
A infecção persistente pelo papilomavírus humano (HPV) é o principal fator de risco para o câncer do colo uterino e suas lesões precursoras. Entretanto somente uma pequena parcela das mulheres com HPV desenvolverão displasia de alto grau e câncer de colo de útero. Baseado nesta carcinogênese, a identificação de novos marcadores tumorais que permitam monitorar eventos associados a progressão tumoral, poderá melhorar a detecção de lesões com maior risco de progredirem.
O objetivo deste estudo é analisar a expressão de três marcadores, p16INK4a, Ki-67 e HLA-G nas lesões de colo de útero com displasia de baixo e alto grau, nos pacientes com carcinoma invasor, e nas mulheres com colo de útero sem lesão. Foi realizado estudo retrospectivo com 70 mulheres, divididas em 4 grupos: I: 10 mulheres sem lesão de colo uterino; II: 15 com displasia de baixo grau; III: 22 com displasia de alto grau; IV: 23 com carcinoma invasor. Estas biópsias foram avaliadas através de estudos imunohistoquímicos, por meio da expressão da proteína p16INK4a,, HLA-G e o Ki 67.
Resultados: em relação a positividade do p16INK4a, 21/22 (95,5%) das pacientes com displasia de alto grau e 21/23 (91,3%) com carcinoma de colo uterino tinham o p16INK4a positivo 2+, e encontrado somente 4/15 (26,7%) das pacientes com displasia de baixo grau (p<0,001). Para o marcador Ki-67, a positividade foi estatisticamente significativa para os grupos III e IV (13/22 e 15/23 respectivamente) quando comparados com o grupo I e II (0/10 e 4/15 respectivamente). Em relação ao marcador HLA-G não houve expressão nas amostras estudadas.Conclusão: Os marcadores imunohistoquímicos p16INK4a e Ki-67 quando presentes em biópsias de colo uterino estão relacionados com maior probabilidade de desenvolvimento de neoplasia maligna.
Palavras-chave: Câncer do colo uterino. Neoplasia intraepitelial cervical. p16INK4a, Ki-67, HLA-G.
ABSTRACT
Persistent infection with human papillomavirus (HPV) is the main risk factor for cervical cancer and its precursor lesions. However only a small portion of women with HPV will develop dysplasia and high-grade cervical cancer. Based on this carcinogenesis, the identification of new tumor markers which allow to monitor events associated with tumor progression may improve the detection of lesions with greater risk to progress.
The objective of this study is to analyze the expression of three markers, p16INK4a, Ki-67 and HLA-G in cervical lesions with low dysplasia and high-grade, in patients with carcinoma, and in women with cervical uninjured. A retrospective study of 70 women divided into four groups: I: 10 women without cervical lesions; II: 15 with low-grade dysplasia; III: 22 with high-grade dysplasia; IV: 23 with carcinoma. These biopsies were assessed by immunohistochemical studies by means of expression of p16INK4a protein, HLA-G and the Ki 67. Results: regarding the positivity of p16INK4a, 21/22 (95.5%) of patients with high dysplasia degree and 21/23 (91.3%) with cervical cancer had a positive p16INK4a 2+, and found only 4/15 (26.7%) of patients with low-grade dysplasia (p <0.001). For the Ki-67 marker positivity was statistically significant for the groups III and IV (13/22 and 15/23 respectively) compared with the group I and II (0/10 and 4/15 respectively). Regarding to HLA-G label there was no expression in all samples. Conclusions: The immunohistochemical markers p16INK4a and Ki-67 as present in cervical biopsies are associated with increased likelihood of developing.
Keywords: Cervical cancer. Cervical intraepithelial neoplasia. HLA-G. Ki-67. p16INK4a.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATA - Ácido tricloro acético
CDK - Kinases dependentes de ciclina CEC - Carcinoma espinocelular
CO - Colpocitologia oncótica
HLA - Antígeno leucocitário humano HPV - Papiloma vírus humano HSV - Hospital São Vicente IHQ - Imunohistoquímica LIEAG - Displasia de alto grau LIEBG - Displasia de baixo grau
NIC - Neoplasias intraepiteliais cervicais NK - Natural killer
pRb - Proteína do retinoblastoma UK - United Kingdom
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Imagens de lesões com displasia de baixo grau, em campo com
aumento de 400x ... 41 Figura 2. Imagens de lesões com displasia de alto grau, em campo com
aumento de 400x ... 42 Figura 3. Imagens de lesões com carcinoma, em campo com aumento
de 400x ... 43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados epidemiológicos ... 39 Tabela 2. Resultado imunohístoquimico do p16INK4a, Ki-67 e HLA-G ... 44 Tabela 3. Análise entre os grupos ... 45
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 10
CAPÍTULO 1 - BIOMARCADORES NA CARCINOGÊNESE DO COLO UTERINO - USO CLÍNICO ... 14
CAPÍTULO 2 - ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA DO P16ink4a, Ki-67 E HLA-G EM NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS E NO CÂNCER DE COLO UTERINO ... 30
CONCLUSÕES FINAIS ... 58
REFERÊNCIAS ... 59
ANEXOS ... 74
1 INTRODUÇÃO
O câncer de colo do útero é o terceiro mais comum entre mulheres no mundo sendo responsável, anualmente, por cerca de 530 mil casos novos e pelo óbito de aproximadamente 270 mil mulheres. No Brasil, para 2016, são esperados 16.340 casos, sendo a terceira neoplasia maligna mais frequente. Quase 80% dos casos novos ocorrem em países em desenvolvimento onde, em algumas regiões, é o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres (INCA, 2016; ICO, 2015; WHO, 2015).
O câncer de colo uterino é uma lesão prevenível, diferentemente de outros tipos de câncer, uma vez que se trata de uma patologia com longos períodos de lesões precursoras (MUÑOZ et al., 2003). A implantação de um sistema de rastreamento baseado principalmente na aplicação da colpocitologia oncótica (CO), associado a técnicas de detecção do papiloma vírus humano (HPV) levou à queda na incidência e mortalidade do câncer de colo uterino (DENNY, 2005). Isto ocorreu principalmente em países com programas efetivos de rastreamento. Infelizmente em países aonde não há boa vigilância, as taxas de incidência chegam a ser maiores que o câncer de mama (INCA, 2016; WHO, 2015).
Através dos programas de rastreamento e com o advento de técnicas biomoleculares que permitiram a identificação do HPV, estabeleceu o fator causal para este vírus na evolução das neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC), que são as lesões precursoras, até o desenvolvimento do câncer (WACHOLDER, 2003). O papel da detecção viral nos programas de rastreamento é hoje considerado o método adequado para auxílio no diagnóstico da NIC, quando associado à CO (SYRJANEN et al., 2005; SARIAN et al., 2005; BRAGANÇA et al., 2005; Longatto-Filho et al., 2006;
GONTIJO et al., 2007; KOLIOPOULOS et al., 2007; WRIGHT et al., 2015).
Alguns países adotaram o teste do HPV como rotina, e a grande vantagem é a alta sensibilidade em identificar quais mulheres são portadoras do vírus, e com isto fazer uma vigilância ativa a fim de se evitar a transformação para câncer (CERVICAL CANCER SCREENING IN THE NETHERLANDS, 2016; NATIONAL CERVICAL SCREENING PROGRAM, 2016). A desvantagem destes testes é a baixa especificidade nas infecções transitórias não as diferenciando das persistentes (CUZICK et al, 2006;
TORNESELLO et al, 2013). As infecções transitórias são aquelas em que não há lesões clínicas aparentes. Já as infecções persistenstes são aquelas com maior risco
de progressão para carcinoma invasor (ZUR HAUSEN, 2002; BURD, 2003; EILEEN, 2003).
No Brasil a citologia cervicovaginal e a colposcopia são os exames de rastreamento adotados por ter menor custo quando comparados às técnicas de biologia molecular (captura do HPV). A coleta do material é realizada de forma tríplice, ou seja, de células do fundo de saco vaginal, da ectocérvice e da endocérvice. A colposcopia possibilita avaliar a extensão e a gravidade da lesão, auxilia no diagnóstico definitivo e na conduta apropriada (DEXEUS; CARARACH; DEXEUS, 2002, INCA, 2016).
Aproximadamente mais de 200 subtipos do vírus já foram identificados, sendo 85 os genótipos bem caracterizados que infectam a mucosa genital. Os HPVs podem infectar as células do epitélio basal da pele e mucosas. Os tipos mucosotrópicos infectam a boca, trato respiratório e epitélio anogenital (EILEEN, 2003; NARISAWA;
KIYONO, 2007). Nos casos de câncer cervical, 70% são do subtipo 16 e 18, estes considerados como HPV de alto risco. Além destes ainda são considerados como alto risco oncogênico, porém de menor expressão, outros 15 subtipos (CLIFFORD et al., 2003;
DIDELOT-ROUSSEAU et al., 2006; LIZANO; BERUMEN; GARRANCÁ, 2009).
O HPV tem ciclo celular exclusivamente intraepitelial, utilizando a diferenciação tecidual para completar seu ciclo de vida. Inicialmente infecta as células da camada basal do epitélio do colo do útero, com potencial de divisão por meio de microtraumas no epitélio e posteriormente se expressa nas camadas intermediárias onde ocorre sua replicação. Quando a infecção pelo HPV chega a causar alteração no epitélio do colo do útero, denomina-se de neoplasia intraepitelial cervical (MÜNGER et al., 2004;
YUGAWA; KIYONO, 2009).
As lesões precursoras chamadas de neoplasia intraepitelial cervical são tradicionalmente classificadas em I, II e III. São graduadas conforme a proporção da espessura do epitélio acometido por células neoplásicas. Em 1967, Richart (1968) propôs a seguinte classificação histopatológica para neoplasia intraepitelial cervical escamosa (NIC):
NIC 1: lesões correspondentes à displasia leve, com células atípicas indiferenciadas ou pouco diferenciadas mitoticamente ativas, comprometendo não mais do que o 1/3 basal do epitélio;
NIC 2: lesões correspondentes à displasia moderada, com comprometimento de mais de 1/3 até 2/3 basais do epitélio;
NIC 3: lesões correspondentes à displasia acentuada ou carcinoma in situ, com comprometimento de mais de 2/3 até toda espessura do epitélio sem ultrapassar a membrana basal.
Atualmente, a nomenclatura citológica é normatizada pelo Sistema de Bethesda em sua versão de 2001. O Sistema classifica as anormalidades celulares cervicais em quatro categorias: atipias de células escamosas (ASC) e lesão intraepitelial de baixo grau (LIEBG), que correspondem a NIC I; lesão intraepitelial de alto grau (LIEAG), corresponde a NIC II e III, e carcinoma de células escamosas (CEC). (SOLOMON et al., 2002).
Somente 9% das mulheres com displasia de baixo grau (LIEBG) podem evoluir para LIEAG e menos de 1% tem evolução para câncer. Das mulheres com displasia de alto grau (LIEAG), 5 a 19% podem evoluir para câncer (ÖSTOR, 1993;
MOSCICKI et al., 2010; SKAPA et al., 2013).
O tratamento padrão para todas as LIEAG são técnicas cirúrgicas invasivas e que consistem em conização e avaliação do espécime cirúrgico. Caso na análise microscópica da peça ressecada vier lesão displásica e as margens estiverem livres, esta paciente será considereda tratada. (MASSAD et al., 2013).
Entretanto estes procedimentos cirúrgicos apresentam um índice de recidiva de até 25%, e de complicações como de estenose de colo uterino de 8 a 16% (PENNA et al., 2005; Houlard et al., 2002) e 2% de infertilidade (SPRACKLEN et al., 2013).
Além disto, pode-se encontrar doença residual em até 30% dos espécimes de histerectomia realizadas após a conização (FLANNELLY et al., 2001, LIN et al., 2001;
PARK et al., 2007, YONEDA et al., 2015). Somado a estas complicações, na série do Grimm et al. (2015), as mulheres que eram submetidas a qualquer procedimento cirúrgico relataram uma piora na qualidade de vida sexual, com desinteresse pelo sexo, desconforto e dor no ato sexual.
Na tentativa de evitar procedimentos que tragam prejuízos na qualidade de vida, e para o melhor entendimento de quais destas mulheres que tem lesões precursoras e que poderão evoluir para carcinoma invasor, existem alguns marcadores imunohistoquímicos com potencial de aumentar a especificidade e auxiliar nos testes de rastreamento até hoje adotados (FREITAS; COIMBRA; LEITÃO, 2014). Atualmente,
80% das mulheres após o início da atividade sexual irão entrar em contato com o HPV. Devido a esta alta taxa de infecção pelo vírus, o teste de citologia oncótica e do HPV não estão sendo mais suficientes para especificar quais destas mulheres desenvolverão câncer (CASTELLSANGUE; BOSH; MUÑOZ, 2002, MOLDEN et al., 2006; WINER et al., 2011; PANATTO et al., 2012).
Alguns testes imunohistoquímicos são potenciais marcadores de câncer do colo do útero e representam uma alternativa suplementar ao teste citológico e detecção do HPV (PINTO et al., 2012; STANLEY, 2003). O estudo destes alvos moleculares permite identificar quais estariam envolvidos na carcinogênese cervical com o objetivo de melhorar o diagnóstico e tratamento (BROWN et al., 2012).
No intuito de se criar um painel imunohistoquímico para o auxílio do diagnóstico e prognóstico das pacientes com lesões intraepiteliais, destacam-se 3 marcadores:
O p16INK4a é um marcador promissor para diagnóstico de carcinogênese cervical, classificado como supressor de tumor; está localizado no cromossomo 9p21 e codifica uma proteína, que controla negativamente a progressão do ciclo celular nas fases G1/S (ROCCO; SIDRANSKY, 2001).
Já o outro marcador é o Ki-67, um antígeno marcador de proliferação celular.
O antigeno Ki-67 está presente somente em células que estão em divisão celular (fases G1, S, G2, M) (FONATSCH et al., 1991). A positividade deste marcador está associado ao vírus do HPV de alto grau (subtipos 16,18,31,33), e por este motivo auxilia no diagnóstico de lesões proliferativas (SINGH et al., 2014).
O terceiro marcador em estudo recentemente é o Antigeno Leucocitário Humano (HLA). A alteração do HLA classe I é um dos mecanismos mais frequentes utilizados pelas células tumorais para evitar os mecanismos anti tumorais da resposta imunológica (GARCIA-LORA; ALGARRA; GARRIDO, 2003; LI et al., 2012). A expressão do HLA-G é associada a doença com pior prognóstico, contribuindo para o progresso tumoral (YAN, 2011; Li et al., 2012).
O objetivo deste estudo é analisar a expressão destes 3 marcadores p16INK4a, Ki-67 e o HLA-G, procurando identificar suas prevalências nas lesões de colo de útero com displasia de baixo e alto grau, nos pacientes com carcinoma invasor, e nas mulheres com colo de útero sem lesão.
CAPÍTULO 1
BIOMARCADORES NA CARCINOGÊNESE DO COLO UTERINO - USO CLÍNICO
BIOMARCADORES NA CARCINOGÊNESE DO COLO UTERINO - USO CLÍNICO
Fabio Roberto Fin1 Marcelo De Paula Loureiro2 Thais Andrade Costa Casagrande2
1 Responsável pelo Departamento de Oncologia Ginecológica do Hospital São Vicente, Curitiba-PR;
2 Departamento do Mestrado de Biotecnologia da Universidade Positivo, Curitiba-PR
Email para correspondências: fabiofin@hotmail.com, tel: 41 96819796; Rua Saldanha Marinho 2167, CEP 80730-180, Curitiba, PR, Brasil;
Resumo
O objetivo desse artigo é discutir os principais biomarcadores que são alvos de oncoproteínas do HPV e suas avaliações para uso clínico na carcinogênese cervical.
Realizado uma revisão na literatura na base de dados do Pubmed e Cochrane entre os anos de 2000 a 2015. Num total de 1167 artigos, 1110 foram excluídos por não apresentarem suficiente correlação dos marcadores com a progressão de displasia para câncer do colo do útero. Devido às altas taxas de infecção por HPV nas mulheres, e uma mortalidade ligada ao diagnóstico tardio, o teste de citologia oncótica e do HPV não estão mais sendo suficientes para especificar quais pacientes desenvolverão câncer.
Análises detalhadas das oncoproteínas do HPV e suas interações com seus alvos celulares podem definir novos marcadores. O p16ink4a Ki-67, e HLA-G mostraram correlação em diagnosticar os graus de NIC, risco e progressão, assim como de fazer recomendação para manejo clínico das mulheres afetadas.
Palavras-chave: Câncer de colo uterino. Neoplasia intraepitelial cervical. Biomarcadores
Abstract
The main objective of this article to discuss the principal biomarkers that are oncoproteins targets of HPV and their evaluation for clinical use in cervical carcinogenesis. Conducted a review of the literature in the database of PubMed and Cochrane between 2000 and 2015. A total of 1167 articles, 1110 were excluded for not having sufficient correlation of biomarkers with the progression of dysplasia to cervical cancer. Due to the high rates of HPV infection in women, and mortality linked to late diagnosis, the cytology and HPV test are no longer sufficient to specify which patients will develop cancer. Detailed analysis of the HPV oncoproteins and their interactions with their cellular targets can define new biomarkers. p16ink4a Ki-67, and HLA-G correlated to diagnose degrees of NIC risk and progression, as well as to make recommendations for clinical management of the women affected.
Key words: Cervical cancer. Cervical intraepithelial neoplasia biomarkers.
Introdução
O câncer de colo do útero é o terceiro mais comum entre mulheres no mundo e por conta do diagnóstico tardio, é letal em torno de 50%. Uma vez que há prevenção para esta neoplasia, tornam-se obrigatório bons programas de rastreamento.1-3
O sistema de rastreamento é baseado em coletas de citologia oncótica associado a detecção do papiloma vírus humano (HPV). O HPV é o principal fator causal para a evolução de um epitélio normal ao desenvolvimento de lesões pré malignas e malignas do colo de útero. Quase metade das mulheres em idade reprodutiva e cerca de 80% dos adultos podem ser infectados pelo HPV ao longo de suas vidas.4-7
A infeção somente pelo HPV não significa que a mulher irá desenvolver a lesão. A presença de outros cofatores podem acelerar o aparecimento destes tumores. O tabagismo, multiplicidade de parceiros sexuais, multiparidade, iniciação sexual precoce, uso de contraceptivos orais por cinco anos ou mais, coinfecção por outros agentes infecciosos como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), Chlamydia trachomatis, vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) e imunossupressão adquirida após transplantes de órgãos estão relacionados ao aparecimento da neoplasia.1,8-10,
Além disso, há evidências de associação entre certos polimorfismos genéticos, particularmente os dos genes Antígeno Leucocitário Humano (HLA) de classe II, especialmente HLA – DRB1 e DQB1, os quais são associados à susceptibilidade genética à infecção por HPV e ao desenvolvimento de lesões malignas do colo do útero.11
Com todo este conhecimento, e devido às altas taxas de infecção por HPV nas mulheres atualmente, o teste de citologia oncótica e do HPV não estão mais sendo suficientes para especificar quais pacientes desenvolverão câncer.12
Na tentativa de se descobrir quais são as lesões precursoras de colo de útero que terão maior chance de se transformar em carcinoma invasor, e evitar procedimentos desnecessários, há alguns marcadores em estudo que podem ser avaliados através de imunohistoquímica. O objetivo deste artigo é discutir os possíveis biomarcadores que são alvos de oncoproteínas do HPV e sua avaliação para uso clínico na carcinogênese cervical.
Metodologia
Foi realizado uma revisão na literatura na base de dados do Pubmed e Cochrane entre os anos de 2000 a 2015. Para a pesquisa foi utilizada a estratégia de combinação de palavras "cervix cancer, neoplasic intraepithelial cervix AND biomarker cervix". Num total de 1167 artigos, 1110 foram excluídos por não apresentarem suficiente correlação dos biomarcadores com a progressão da displasia para câncer do colo de útero. Além disso, os biomarcadores escolhidos são aqueles já disponíveis para uso no Brasil.
HPV Oncogênico/E6 e E7
O HPV exerce seu efeito sobre as células do colo uterino afetando a mitose, fase da divisão celular em que ocorre a divisão do material e a bipartição da célula.13-14 A integração do ácido desoxirribonucléico (DNA) do HPV (DNA-HPV) aos cromossomos humanos leva à perda de regulação do ciclo celular e à expressão de oncogenes virais, aumentando acentuadamente a proliferação das células e tornando muito mais frequente a progressão da neoplasia intraepitelial cervical (NIC).15-16
Atualmente há mais de 200 subtipos de HPV, e cada tipo viral tem um diferente potencial no desenvolvimento de tumores. Essa diferença esta relacionada com a expressão de dois oncogenes importantes, E6 e E7, os quais estão presentes em células neoplásicas HPV-positivas, sendo considerada imperativa para iniciar e manter o fenótipo maligno celular.17-18 Os oncogenes do HPV atuam em duas etapas distintas do ciclo celular: na regulação da entrada da célula em apoptose e no controle da passagem da fase G1 para S.19
A expressão desregulada dos oncogenes E6 e E7 provocam a transformação nas células replicativas basais e parabasais do epitélio infectado. Esta interação, contribui para a instabilidade cromossômica e confirma o papel do HPV na carcinogênese viral.18
Por este motivo, a pesquisa dos transcritos E6 e E7 de HPV de alto risco aumentaria a especificidade e a sensibilidade destes testes na triagem de lesões com maior chance de progredirem para carcinoma, quando comparada à simples detecção de DNA de HPV.19
Para mensurar estas oncoproteínas virais E6 e E7, utiliza-se testes que detectam a presença dos RNA mensageiros que codificam a síntese destas oncoproteínas necessárias para a transformação maligna.20
O RNAm das oncoproteínas E6/E7 como marcador de risco pode reduzir o número de mulheres referenciadas para monitoramento e seguimento mais cuidadoso, aumentando a especificidade da avaliação de mulheres com atipia de células escamosas (ASC) e lesão intraepitelial de baixo grau (LIEBG).21
Gene p53
A p53 atua como fator de transcrição para a proteína inibidora de ciclinas dependentes de quinase 1A, chamada p21, responsável pela inativação de enzimas (ciclinas) envolvidas na replicação do DNA e proliferação celular. A p53 também atua ativando outras enzimas que conduzem ao processo de morte celular programada, ou apoptose. Desta forma, o oncogene viral E6, ao se ligar e degradar a p53, impede a transcrição de p21, que inibiria a passagem da célula de G1 para S, ao mesmo tempo em que impede a morte de células com DNA alterado.16,22
Existe dificuldades em padronizar os diferentes escores da imunorreatividade do p53 em espécimes HPV-positivas e negativas de NIC e de câncer cervical. Uma das hipóteses levantadas, leva em conta a mutação do p53. O gene mutado teria maior meia vida do que o p53 selvagem, levando ao seu acúmulo no núcleo celular e sua conseqüente detecção imunohistoquímica em células neoplásicas. Por outro lado, a inativação do p53 pelo oncogene E6 do HPV de alto risco levaria a uma baixa expressão deste marcador em células neoplásicas infectadas pelo HPV. Os resultados dos estudos clínicos também são conflitantes com relação à expressão da p53 e à progressão de NIC.14,23-25
O p53 é detectado em 33,6 a 45,3% dos pacientes com carcinoma, entretanto o valor prognóstico é ainda incerto.26-27 Crowford et al.,26 relataram que está associado a um pior prognóstico no tumor primário, entretanto na recorrência esta associação não foi verdadeira.
Nikolau et al.27 em um estudo com 163 mulheres, obtiveram resultado negativo na imunohistoquímica (IHC) em biópsias do grupo controle. Em 29,5% dos casos, positivas para neoplasias intraepiteliais e em 49,2% das mulheres foram positivas
para carcinoma. Os resultados foram estatisticamente significantes. Entretanto, o estudo considerou apenas negativo e positivo, sem apresentar o grau de variação dos diferentes escores da IHC. Outra crítica deste estudo é a não correlação com os diferentes estágios da NIC.
Já Suzuki et al.28 reportaram uma piora na sobrevida livre de doença quando o p53 era encontrado (30% x 62%). Entretanto a histologia da amostra era apenas adenocarcinoma e as pacientes eram tratadas com radioterapia. Outros estudos não conseguiram reportar os mesmos valores prognósticos quando as pacientes eram tratadas com cirurgia radical, radioterapia ou quimiorradioterapia.29-32
O Zhou et al.33 em sua metanálise observaram que o p53, codon 72, tem associação com o aumento da chance de evolução para carcinoma invasor. O estudo reuniu 3580 mulheres com carcinoma invasor e 3827 casos controle de pacientes.
Esta associação se mostrou mais evidente nas mulheres indianas. O polimorfismo do codon 72 foi utilizado por ser mais facilmente detectado em testes de PCR (reação da cadeia polimerase).
p16INK4a
Outro passo importante para a perda da regulação do ciclo celular é a ação do oncogene viral E7 que se liga ao gene do retinoblastoma, ou proteína do retinoblastoma (pRb), inativando-a. A pRb tem papel fundamental na manutenção da célula em G1, exercendo sua função por formar complexos estáveis com o fator de transcrição E2F. O E2F, quando livre, ativa diversas quinases dependentes de ciclinas, desencadeando o processo de replicação do DNA. A pRb também atua sobre o inibidor de ciclina dependente de quinase (CDK) 2 A, chamado abreviadamente de p16INK4a, e sobre o inibidor de ciclina dependente de quinase 1 B, ou p27, os quais são importantes moduladores da parada do ciclo celular em G1.34,35 O p16INK4a é parte integral da via do pRb, atua conjuntamente com este no bloqueio do ciclo celular por inativação das CDKs. Sabe-se que o p16INK4a e o p27 não podem exercer suas funções na ausência de pRb, liberando a célula para a replicação. Em síntese, o oncogene viral E7 atua reduzindo as concentrações de pRb e, por conseguinte altera a expressão do p16INK4a e do p27, acarretando o aumento de concentração de ciclinas
dependentes de quinases que, em pleno funcionamento, permitem a entrada e manutenção da célula na fase S.16,36-37
As principais aplicações diagnósticas do teste de imunohistoquímica para p16INK4a estão no campo da patologia ginecológica. A expressão da p16INK4a foi investigada mais extensamente na patologia cervical, embora estejam surgindo novas aplicações deste marcador em várias localizações do trato genital feminino. No epitélio cervical normal a expressão do p16INK4a está ausente ou, em alguns casos, é positiva focalmente, padrão não alterado nas cervicites e metaplasia escamosa do epitélio.38-39 Na NIC a expressão da p16INK4a está presente na maioria dos casos e geralmente restrita ao terço basal do epitélio, embora a porcentagem de positividade varie muito na literatura.37-38 A superexpressão, coloração acima de 15%, da p16INK4a em células cervicais é interpretada normalmente como um marcador da integração do genótipo de HPV de alto risco36,40-41
Leskinova et al.42 numa série com 796 mulheres, relataram a expressão do p16INK4a em diferentes estágios de lesões de colo uterino. Quanto mais displásico, maior era a positividade do marcador. Assim como nos pacientes com carcinoma (NIC I 72,3%; NIC II 91%; NIC III 98,3%; Carcinoma 98,5%). Além disso, estes resultados foram estratificados conforme o grau de expressão do marcador. O resultado global ainda sugere que o p16 quando positivo e superexpresso (coloração acima de 50%), tem uma valor prognóstico negativo.
Naqueles casos em que há discordância entre a cito-histologia, Gustinucci et al.43 demonstraram que o teste do p16INK4a pode auxiliar, assim como nos casos de células epiteliais e endocervicais atípicas, por ser um teste mais específico que o da captura híbrida pelo HPV. A expressão elevada do p16INK4a esta associada a progressão da lesão do colo do útero, independente do estatus do teste do HPV.43
Ki-67
O antígeno Ki-67, marcador de proliferação e confinado as células da camada parabasal do epitélio escamoso, é expresso durante as fases do ciclo celular (G1, S, G2, M), exceto G0. Pode ser detectado através de métodos qualitativos e quantitativos, incluindo a imunohistoquímica, densitometria de fluxo, ELISA, microscopia eletrônica.44 Uma vez que o Ki-67 é encontrado apenas em células de divisão, podendo ser
tumorais ou não, mas ausente em células em repouso, é um indicador confiável de crescimento.45
Há um teste duplo, imunohistoquímico do Ki-67 e p16 disponível para o uso como um teste coadjuvante no rastreio do câncer de colo do útero (Cintec, laboratórios MTM). Schmidt et al.46 avaliaram 776 amostras de células de significado indeterminado (ASC) e em displasia de baixo grau (LIEBG) retrospectivamente.
A sensibilidade encontrada foi de 94,2% em LIEBG, e 92,2% em ASC, enquanto as taxas de especificidade foram de 80,6% e 68,0% respectivamente. Sensibilidade e especificidade com perfis semelhantes foram encontrados em mulheres com idade abaixo de 30 anos. Assim, citologia Ki-67 e p16 mostrou sensibilidade comparável, mas significativamente maior especificidade em relação a testes para HPVs de alto risco.47
Na série de Ancuta et al.48,o Ki-67 foi avaliado em 61 pacientes submetidas a histerectomia por câncer cervical de diferentes estágios. Os resultados demonstram que quanto mais avançado o estadiamento, maior era a taxa de proliferação do Ki-67.
Hanprasertpong et al.49, em uma série com 235 pacientes num período de 1987 a 2004, demonstraram que o marcador Ki-67 quando acima de 30% é um fator prognóstico independente de piora na sobrevida livre de doença.
HLA-G
Já outro marcador em estudo recentemente é o Antigeno Leucocitário Humano (HLA). A alteração do HLA classe I é um dos mecanismos mais frequentes utilizados pelas células tumorais para escapar dos mecanismos anti-tumorais da resposta imunológica.50,51 O antígeno HLA-G é a expressão maligna a ser investigada. O HLA-G tem efeitos inibitórios sobre as células competentes responsáveis pela supressão ou regulação daquelas células que escapam ao sistema imunológico.52
Inicialmente há 3 estudos que não demonstraram relação do HLA-G com a carcinogênese cervical. Zhou et al.53 analisaram o HLA-G expresso pelo anticorpo monoclonal 4H84 em mulheres com NIC e carcinoma.
Gonçalves et al.54 utilizaram o mesmo anticorpo monoclonal para a coloração IHC, avaliaram 74 mulheres com NIC e carcinomas. Na imunohistoquímica, o HLA-G somente foi identificado nas pacientes com ASC. Em contrapartida, o HLA-E estava fortemente positivo na progressão da NIC neste estudo. Esta fração da molécula do
HLA é um produto do HLA-G e a hipótese levantada é que a expressão positiva sugira inibição das células natural killer e assim aja a progressão para o carcinoma invasor.
O resultado deste estudo pode ter sido influenciado negativamente pelo baixo número de biópsias.
Guimarães et al.55 também não mostraram relação deste marcador com a carcinogênese cervical. Para a análise de 79 mulheres utilizou-se o anticorpo monoclonal mAb 5A6G7. A expressão do HLA-G foi baixa e semelhante para todas as pacientes.
Ao contrário destes estudos que falharam ao demonstrar a relação do HLA-G com a carcinogêneses cervical, estudos mais recentes mostraram diferentes resultados.
Dong et al.56 numa amostra com 16 NIC I, 39 NIC II e III, e 116 mulheres com carcinoma invasor, com ou sem infecção pelo HPV, avaliaram a expressão IHC do HLA-G, através do anticorpo HLA-G mAb HGY. Os autores concluiram que a associação foi positiva quanto maior o grau de displasia e câncer e também a presença do HPV.
Zheng et al.57 avaliaram a expressão do marcador, expresso pelo anticorpo monoclonal 4H84, em 119 mulheres chinesas. Verificou-se um aumento da positividade do HLA-G em relação aos tecidos normais. Além disso, houve uma associação positiva deste marcador com relação ao tamanho da lesão, paramétrios e linfonodos metastáticos.
Em 2012 e 2013, mais 2 estudos foram publicados demonstrando esta relação. Li et al51 demonstraram em 175 mulheres chinesas, a associação positiva do marcador, expresso pelo anticorpo monoclonal 4H84, com a carcinogênese cervical.
Para as mulheres com câncer, pelo estádio da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia I, II, III+IV, o HLA-G encontrado foi de 56,3%, 76,3% e 100%
respectivamente.
Silva et al.58 em um estudo biomolecular com 105 mulheres sexualmente ativas, randomizadas em dois grupos, identificaram uma associação positiva do HLA-G com mulheres portadoras de lesão de alto grau e câncer de colo de útero quando comparadas às sem lesão. E numa análise molecular, esta forte relação estava relacionada ao polimorfismo do HLA-G, alteração genética imposta pela lesão no gene HLA-G.
A discrepância do HLA-G em diferentes estudos acredita-se que seja pelos diferentes anticorpos utilizados, e pela variação no número nas amostras. Há uma
tendência em afirmar que a expressão do HLA-G é associada a doença com pior prognóstico, contribuindo para o progresso tumoral.52,59
Conclusão
Existe uma necessidade absoluta de se aumentar a especificidade dos testes de detecção precoce e de estandardização de conduta nas neoplasias de colo de útero.
O conhecimento atual nesta área permite-nos correlacionar os biomarcadores p16ink4a, Ki-67 e HLA-G com os graus de NIC, risco e progressão, assim como de fazer recomendações para manejo clínico das mulheres afetadas.
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CAPÍTULO 2
ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA DO P16INK4A, KI-67 E HLA-G EM NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS E NO CÂNCER DE COLO UTERINO
ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA DO P16INK4A, KI-67 E HLA-G EM NEOPLASIAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS E NO CÂNCER DE COLO UTERINO
IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF HLA-G, KI-67 AND P16 IN CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA AND CERVICAL CANCER
Fabio Roberto Fin Marcelo de Paula Loureiro Thais Andrade Costa Casagrande Resumo
Introducão: O perfil imunohistoquímico nas neoplasias intraepiteliais cervicais pode contribuir para um melhor entendimento e estratificacão de risco de mulheres no processo carcinogênico do câncer de colo do útero. Objetivo: O objetivo deste estudo é analisar a expressão de três biomarcadores, p16INK4a, Ki-67 e HLA-G nas lesões de colo de útero com displasia de baixo e alto grau, nos pacientes com carcinoma invasor, e nas mulheres com colo de útero sem lesão. Metodologia: Estudo retrospectivo com 70 mulheres, divididas em 4 grupos: I: 10 mulheres sem lesão de colo uterino; II: 15 com displasia de baixo grau; III: 22 com displasia de alto grau; IV: 23 com carcinoma invasor. Estas biópsias foram avaliadas através de estudos imunohistoquímicos, por meio da expressão da proteína p16INK4a,, HLA-G e o Ki 67. Resultados: Em relação a positividade do p16INK4a, 21/22 (95,5%) das pacientes com displasia de alto grau e 21/23 (91,3%) com carcinoma de colo uterino tinham o p16INK4a positivo 2+, e encontrado somente 4/15 (26,7%) das pacientes com displasia de baixo grau (p<0,001). Para o marcador Ki-67, a positividade foi estatisticamente significativa para os grupos III e IV (13/22 e 15/23 respectivamente) quando comparados com o grupo I e II (0/10 e 4/15 respectivamente). Em relação ao marcador HLA-G não houve expressão nas amostras estudadas.Conclusão: Os marcadores imunohistoquímicos p16INK4a e Ki-67 quando presentes em biópsias de colo uterino estão relacionados com maior probabilidade de desenvolvimento de neoplasia maligna.
Palavras-chave: Câncer do colo uterino. Neoplasia intraepitelial cervical. p16INK4a. Ki-67. HLA-G.
Abstract
Introduction: The immunohistochemical profile in cervical intraepithelial neoplasia can contribute to a better understanding and risk stratification of women in the carcinogenic process of cervical cancer. Objective: The objective of this study is to analyze the expression of three biomarkers, p16INK4a, Ki-67 and HLA-G in cervical lesions with low dysplasia and high-grade, in patients with carcinoma, and in women with cervical without injury. Methodology: A retrospective study of 70 women divided into four groups: I: 10 women without cervical lesions; II: 15 with low-grade dysplasia; III: 22
with high-grade dysplasia; IV: 23 with carcinoma. These biopsies were assessed by immunohistochemical studies by means of expression of p16INK4a protein, HLA-G and the Ki 67. Results: Compared to the p16INK4a positive, 21/22 (95.5%) of patients with high dysplasia degree and 21/23 (91.3%) with cervical cancer had a positive p16INK4a 2+, and found only 4/15 (26.7%) of patients with low-grade dysplasia (p
<0.001). For the Ki-67 marker positivity was statistically significant for the groups III and IV (13/22 and 15/23 respectively) compared with the group I and II (0/10 and 4/15 respectively). Regarding to HLA-G label there was no expression in all samples.
Conclusions: The immunohistochemical markers p16INK4a and Ki-67 as present in cervical biopsies are associated with increased likelihood of developing the malignancy.
Keywords: Cervical cancer. Cervical intraepithelial neoplasia. HLA-G. Ki-67. p16INK4a.
Introdução
O câncer de colo de útero é o tumor ginecológico mais comum entre as mulheres, com uma incidência estimada de 530.000 novos casos e óbito de 270.000.
Mais de 80% dos casos ocorrem em países em desenvolvimento aonde os programas de prevenção e controle não são efetivos. 1-3
O exame da coleta de citologia oncótica é a principal estratégia adotada para diagnóstico e controle das neoplasias intraepiteliais cervicais e do câncer de colo de útero. Entretanto há divergências nos resultados, seja pela forma incorreta na coleta e realização do exame, seja pela variabilidade na interpretação dos resultados pelos citopatologistas. Por este motivo, alguns países adotaram como rotina a coleta do teste do HPV.4-6
A etiologia do câncer de colo de útero esta relacionada com a persistência da infecção causada pelo HPV nas células do epitélio do colo uterino. Há pelo menos 85 subtipos do vírus já classificados como de alto e baixo risco para lesões neoplásicas.
A principal vantagem em utilizar testes de HPV é a alta sensibilidade, uma vez que a ausência de HPV carcinogênico indica baixa probabilidade de neoplasia intraepitelial de alto grau ou câncer. A evolução de lesões pré-neoplásicas para câncer não ocorre em tempo inferior a 5 anos, quando o teste mostra-se negativo.7
A desvantagem destes testes é a baixa especificidade, pois não diferenciam as infecções causadas pelo HPV em transitórias e persistentes.7,8 As infecções transitórias são aquelas em que não há lesões clínicas aparentes, e ocorrem principalmente em mulheres jovens abaixo de 30 anos. Já as infecções persistenstes são aquelas com maior risco de progressão para carcinoma invasor. 9-12
A infecção pelo HPV de alto risco é condição necessária mas não suficiente para a progressão à doença invasora. Para que o câncer cervical ocorra é necessário uma sucessão de acontecimentos. A infecção deve persistir por tempo prolongado, e manter a expressão contínua dos oncogenes virais E6 e E7, que agem na integração viral do HPV no DNA da célula hospedeira, ocasionado mutações nos genes celulares e o rearranjo cromossomal induzidos pela instabilidade genômica. Assim as células se replicam contendo o DNA mutado levando à formação de um epitélio carcinogênico.13-14
Devido as altas taxas de infecção por HPV nas mulheres atualmente, o teste de citologia oncótica e do HPV não estão mais sendo suficientes para especificar quais pacientes desenvolverão câncer.15
Por isto há a necessidade da busca de novos marcadores na identificação dos tumores de colo de útero. Os marcadores tumorais são indicadores do estado fisiológico e de alterações que ocorrem durante o processo neoplásico. A expressão destes marcadores pode refletir diversos processos em andamento nas células tumorais, tais como hiperproliferação, alteração de padrões de expressão gênica, hiperplasia, genotoxicidade, inflamação e alterações enzimáticas relacionadas com o desenvolvimento tumoral, entre outros. Um marcador tumoral ideal possui relação direta com o processo maligno, correlaciona-se com a massa tumoral, permite a caracterização do tipo, localização e estadiamento do tumor, bem como fornece uma avaliação prognóstica do tumor em questão.16
Os principais marcadores em estudo atualmente se baseiam na alteração que o HPV promove no ciclo celular. A ação de oncogenes virais do HPV, chamados E6 e E7 provocam transformações replicativas nas células da camada basal e contribui para a carcinogênese.17 Este oncogene quando ativo aumenta a concentração do p16INK4a, que é um dos marcadores promissores mais estudados.18-19 Da mesma forma, a atividade proliferativa celular que ocorre por meio de ação do HPV, é mensurada através de outro marcador, o Ki-67.20 Os marcadores se expressam não apenas na fase de divisão cellular, é o caso do Antígeno Leucocitário Humano (HLA). O HLA-G, mediador a ser estudado, tem efeito inibitório sobre as células competentes responsáveis pela supressão ou regulação daquelas células que escapam do sistema imunológico.21-23
A identificação e a utilização de ferramentas que possam complementar tanto o diagnóstico como o rastreamento das lesões precursoras do câncer do colo uterino é fundamental. Uma vez que a grandemaioria das lesões precursoras do câncer do colo uterino regride espontaneamente, a identificação de lesões que realmente necessitam sertratadas evitaria a utilização de procedimentos agressivos desnecessários, enquanto as lesões com maior chance de progredirem seriam passíveis de tratamentos precoces, antes do desenvolvimento de um câncer invasivo.23-24
O objetivo deste estudo é analisar a expressão destes 3 marcadores p16INK4a, HLA-G e o Ki-67 procurando identificar suas prevalências nas lesões de colo de útero com displasia de baixo e alto grau, nos pacientes com carcinoma invasor, e nas mulheres com colo de útero sem lesão.
Metodologia
Foi realizado um estudo retrospectivo de revisão de lâminas das pacientes atendidas no Departamento de Oncologia Ginecológica do Hospital São Vicente, Curitiba, no período de janeiro de 2013 a abril de 2014. Foram incluídas todas as pacientes atendidas com alteração no exame de citologia oncótica e que posteriormente realizaram biópsia do colo uterino no mesmo Departamento.
Todas as lesões foram classificadas por dois patologistas experientes segundo critérios de Bethesda, e divididas em 3 grupos acrescido do grupo controle. No grupo I (controle) foram incluídas as biópsias de colo de útero de mulheres sem sinais de infecção e/ou lesão. Este material foi obtido de mulheres que foram histerectomizadas por mioma em cuja análise histológica do colo uterino não havia lesão. No grupo II, composto por pacientes com displasia de baixo grau (LIEBG). No grupo III, mulheres com displasia de alto grau (LIEAG). E no grupo IV, com carcinoma invasor de colo uterino.
Inicialmente a amostra continha 113 pacientes. Após uma análise do material, exclui-se 42 blocos de parafina por escassez de material ou por condições inadequadas para realização de IHQ.
Os grupos ficaram assim compostos:
Grupo I: 10 pacientes Grupo II: 15 pacientes Grupo III: 22 pacientes Grupo IV: 23 pacientes
Estes blocos de parafinas foram submetidos a estudos imunohistoquímicos, para avaliação da expressão da proteína p16INK4a,, HLA-G e o Ki 67.
O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Hospital São Vicente (HSV), Curitiba, Paraná, Brasil.
Técnica de ImunohistoquÍmica
O processo de imunohistoquímica foi todo automatizado, realizado através do processador Leica Bond III.
Os blocos parafinados contendo as amostras foram cortados com auxílio de um micrótomo com espessura de três micrômetros e corados em Hematoxilina e Eosina para a seleção de campos e marcação da lesão alvo. Na sequência, novos cortes de 3 micrômetros em lâminas sinalizadas para o processamento automático da IHQ.
p16INK4a
A imunorreação do p16INK4a foi obtida após cortes de 3 micrômetros dos blocos de parafinas e por meio de um kit disponível comercialmente (ABCAM), incluindo o anticorpo monoclonal 2D9A12. O método de processamento do material foi automatizado pelo processador Leica Bond III.
A diluição utilizada para o anticorpo p16INK4a, 2D9A12 foi de 1/500. A ligação específica de anticorpos primários foi detectados pelo sistema Novolink ® para p16INK4a (Novocastra) Rotulagem foi visualizada com 3,3' – diaminobenzidina.
Os controles positivos consistiram de tecidos com imunorreatividade anteriores para cada marcador, e os controles negativos consistiram dos mesmos tecidos utilizados como controles positivos, onde os anticorpos primários foram omitidos.
Ki-67
A imunorreação do Ki-67 foi obtida após cortes de 3 micrômetros dos blocos de parafina, e por meio de um kit disponível comercialmente (CeLL Marque), com o anticorpo Ki-67, SP6. O método de processamento do material foi automatizado pelo processador Leica Bond III.
A diluição utilizada para o marcador Ki-67 SP6 foi de 1/400. Foi revelado com tetrahidrocloreto diaminobenzidina (DAB Kit, Dako) e contrastados com hematoxilina.
A reação apresenta-se como um controle positivo para a Ki-67, um corte contendo linfonodo com hiperplasia reativa, em que o controle negativo foi efetuada no mesmo tipo de amostra, sem o anticorpo primário.
HLA-G
A imunorreação do HLA-G foi obtida após cortes de 3 micrômetros dos blocos de parafina, e por meio de um kit disponível comercialmente (BD Pharmingen), com o anticorpo HLA-G, 4H84. O método de processamento do material foi automatizado pelo processador Leica Bond III.
A diluição utilizada para o marcador HLA-G, 4H84 foi de 1/500. Foi revelado com tetrahidrocloreto diaminobenzidina e contrastados com hematoxilina de Harris.
Os controles positivos foram cortes histológicos de trofoblastos humanos, e o controle negativo foi o mesmo corte histológico substituindo o anticorpo primário por solução salina tampão.
Positividade/Valores
No caso do p16INK4a, quando não houve coloração no citoplasma, ou menor que 5%, foi considerado negativa. E foi considerado positiva quando houve coloração.
Positiva 1+ entre 5 e 50%; e 2+ >50%.
A expressão de Ki-67 foi considerada positiva quando mais de 5% das células basais presentes com coloração nuclear. Positiva 1+ entre 5 e 50%; e 2+ >50%.
Para o HLA-G, a porcentagem de cada bloco de parafina foi avaliada e calculada através da intensidade de coloração. Foi negativa, quando menos de 5%, e positiva 1+ (5 e 50%) e 2+ (>50%).
Análise Estatística
Para descrição das variáveis quantitativas foram consideradas as estatísticas de média, mediana, valor mínimo, valor máximo e desvio padrão. Para descrição das variáveis qualitativas foram consideradas frequências e percentuais. A comparação dos grupos, em relação à idade foi realizada considerando-se o modelo de Análise de Variância com uma fonte de variação. Para comparação dos grupos em relação ao número de filhos foi considerado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Para comparação dos grupos definidos pelos diagnósticos em relação às classificações dos marcadores foi considerado o teste Qui-Quadrado. Para comparação dos grupos, dois a dois, em relação ao resultado de cada particular marcador, foi considerado o teste Exato de Fisher, considerando-se nesta avaliação a correção do valor de p pelo procedimento de Bonferroni. Valores de p menores do que 0,05 indicaram significância estatística. Os dados foram analisados com o programa computacional IBM SPSS Statistics v.20.
Resultados
1. Dados Epidemiológicos
Foram recuperados os blocos de parafina das biópsias de colo uterino de 70 mulheres. Após processo imunohistoquímico geraram os seguintes resultados:
Os dados epidemiológicos estão relacionados na Tabela 1. Nela se observa que a a idade média foi de 44,5 ± 16,52 anos. As pacientes do grupo IV apresentaram a idade média mais elevada que os demais grupos (*p<0,001). Com relação ao número de filhos, o número médio foi de 2,25, ± 2,02, sendo o grupo II com a menor média (2 ± 1,4), e o grupo IV com a maior média (3,5 ± 2,6). Das mulheres atendidas com alteração do colo uterino, 24/60 (40%) tem história de tabagismo.
Tabela 1. Dados epidemiológicos
I II III IV
Idade 46,8 ± 6,1 (34-55)
34,5 ± 10,9 (20-52)
35,5 ± 14,8 (19-78)
58,1 ± 15,1 (26-82)
Num filhos 2,0 ± 1,6 (0-5)
1,7 ±1,4 (0-4)
1,8 ±1,4 (0-5)
3,5 ± 2,6 (0-10)
Tabagismo
Não 10 (100%) 7 (46,7%) 18 (81,8%) 11 (47,8%)
Sim 0 (0%) 8 (53,3%) 4 (18,2%) 12 (52,2%)
Tratamento
Seguimento 8/15 (53%) 2/22 (9,1%)
CAF 7/15 (47%) 18/22 (81,8%)
Histerectomia 2/22 (9,1%)
Quanto ao tipo de tratamento realizado, 7/15 (46,7%) das mulheres do grupo II foram submetidas a conização, e 8/15 (53,3%) apenas seguimento (Tabela 1). Já as mulheres do grupo III, 18/22 (81,8%) fizeram conização, 2/22 (9,1%) submetidas a histerectomia e apenas 2 (9,1%) optou-se por seguimento.
