5.1) Aumento da expressão de MHC I após o tratamento com IFN beta e lesão do nervo isquiático
O efeito in vivo do tratamento com IFN beta sobre a expressão de MHC I é apresentada na Figura 6, em que se observa a imunoreatividade na região do núcleo motor lateral na coluna ventral da medula espinal após uma semana da lesão. A Figura 6A-C mostra o lado contralateral da medula, contendo os neurônios utilizados como controle. Observou-se que a expressão basal de MHC I é relativamente baixa e, geralmente, restrita às regiões perivasculares.
A Figura 6D-F representa o lado ipsilateral à lesão, evidenciando um aumento da expressão do MHC I após a transecção do nervo isquiático. A axotomia induziu o aumento da expressão de MHC I em todos os grupos experimentais. Observou-se que este aumento foi similar para os grupos axotomizado e axotomizado com tratamento placebo.
Figura 6 – Imunomarcação anti-MHC I após axotomia e tratamento com INF beta. A-C lado contralateral
(não lesado) da coluna ventral da medula espinal dos grupos axotomizado, axotomizado com tratamento placebo e axotomizado com tratamento de IFN, respectivamente. Note a reduzida expressão de MHC I nos diferentes grupos. D-F lado ipsilateral da coluna ventral da medula espinal uma semana após lesão, mostrando o aumento da marcação nos três grupos. No grupo tratado com INF (F), a marcação foi especialmente intensa ao redor dos motoneurônios, bem como no neurópilo adjacente. Escala=50 µm.
No entanto, o tratamento com IFN beta, adicionalmente à axotomia, levou a um incremento de aproximadamente 40% da imunomarcação para MHC I, revelando uma diferença estatisticamente significativa em relação aos outros grupos (axotomia, 5,12 ± 0,13, média ± EP; axotomia mais placebo, 4,74 ± 0,57; axotomia mais INF beta, 8,03 ± 0,67; p<0,01, Figura 7). Notadamente, a maioria da marcação para MHC I estava restrita à superfície e neurópilo adjacente dos motoneurônios axotomizados, indicando uma resposta à lesão tanto dos neurônios quanto da glia circunjacente. Nesse caso, foi quantificado apenas o lado ipsilateral à lesão do nervo, já que, o lado contralateral a expressão de MHC I ao redor dos neurônios medulares foi praticamente nula.
Figura 7 – Representação gráfica da quantificação da densidade integrada de pixels para a imunomarcação
anti-MHC I na coluna ventral da medula espinal (lado ispsilateral) após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta. O lado contralateral não está representado porque a quantificação da expressão resultou em valor praticamente nulo.
5.2) Redução da imunoreatividade para sinaptofisina após axotomia e tratamento com IFN beta
A imunoreatividade da proteína sinaptofisina no núcleo motor lateral na coluna ventral da medula espinal de animais controle (axotomia e axotomia com tratamento placebo) e animais tratados com INF beta está representada na Figura 8. Foi identificada similaridade entre os lados contralaterais às lesões para imunomarcação anti-sinaptofisina em todos os grupos. Neste sentido, destaca-se a marcação adjacente a superfície celular dos grandes motoneurônios que compõem o núcleo motor. Foi possível observar uma densa reatividade nesta área, a qual é atribuída ao grande número de aferências aos motoneurônios alfa. Entretanto, nenhuma distinção da natureza das aferências é possível, uma vez que todo terminal pré-sináptico ativo apresenta em seu interior vesículas contendo sinaptofisina. Contudo, é possível a realização de uma estimativa da cobertura sináptica em relação à membrana motoneuronal baseando-se no nível da imunomarcação para sinaptofisina, similarmente ao descrito por Oliveira et al. (2004).
Figura 8 – Imunomarcação anti-sinaptofisina após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta. A-C lado
contralateral (não lesado) da coluna ventral da medula espinal de animais axotomizados, axotomizados com tratamento placebo e axotomizados com tratamento de IFN, respectivamente. Note que o tratamento com IFN beta não alterou o padrão normal da expressão de sinaptofisina. D-F lado ipsilateral, uma semana após a lesão, mostrando uma diminuição geral da expressão da sinaptofisina. Observe esta diminuição especialmente ao redor dos motoneurônios axotomizados (círculos tracejados), indicando uma menor cobertura sináptica nestas células. Este fenômeno mostra-se exacerbado no grupo tratado com IFN beta (F). Escala = 50 µm.
Em contraste ao lado contralateral, uma semana após a lesão, a intensidade da expressão de sinaptofisina foi bastante reduzida, particularmente na superfície dos neurônios axotomizados. Os resultados são apresentados na Figura 8D-F e revelam uma redução estatisticamente significativa de 30% para a imunomarcação no grupo tratado com IFN beta (axotomia, 0,62 ± 0,05; axotomia mais placebo, 0,60 ± 0,04; axotomia mais INF
beta, 0,42 ± 0,05; p<0,05, Figura 9). Este decréscimo, no microambiente ao redor dos motoneurônios axotomizados, indica uma diminuição dos terminais em aposição a estes neurônios. Nesse ponto também cabe a obsevação da coincidência das áreas de imunomarcação para sinaptofisina e MHC I, como descrito anteriormente.
Figura 9 – Representação gráfica da quantificação da densidade integrada de pixels para a imunomarcação
anti-sinaptofisina na coluna ventral da medula espinal após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta.
5.3) Aumento da astrogliose reativa mas não da reatividade da microglia após tratamento com IFN beta
As Figuras 10 e 12 mostram a imunoreatividade para GFAP e ezrina respectivamente. Estas proteínas são constituintes do citoesqueleto celular dos astrócitos e suas imunomarcações são comumente utilizadas para a análise do grau de reatividade dessas células. Os resultados demonstraram que o lado contralateral à lesão apresenta reatividade
basal, demonstrando a presença de processos astrocitários GFAP-positivos no microambiente próximo aos grandes motoneurônios do nervo isquiático, mostram também que essa reatividade não foi alterada pelo tratamento com IFN beta (Figura 10A-C).
Um aumento significativo na astrogliose foi demonstrado pelo incremento de GFAP nos segmentos medulares afetados, particularmente concentrado ao redor dos neurônios axotomizados, indicando uma relação direta entre os neurônios lesionados e a glia (Figura 10D-F). Adicionalmente, o tratamento com IFN beta aumentou significativamente (~40%) a resposta dos astrócitos à lesão (axotomia, 2,15 ± 0,23; axotomia mais placebo, 2,34 ± 0,26; axotomia mais INF beta, 3,72 ± 0,22; p<0,01, Figura 11).
Figura 10 – Imunomarcação anti-GFAP após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta. A-C lado
contralateral (não lesado) da coluna ventral da medula espinal dos grupos axotomizado, axotomizado com tratamento placebo e axotomizado com tratamento de IFN, respectivamente. Note que o tratamento com IFN não alterou o padrão normal da expressão de GFAP. D-F lado ipsilateral da coluna ventral da medula espinal uma semana após lesão. Observe o aumento da imunomarcação especialmente ao redor dos motoneurônios axotomizados, indicando uma possível comunicação entre os neurônios lesados e a glia reativa. Observe que este fenômeno está mais proeminente no grupo tratado com INF beta (F). Escala = 50 µm.
Figura 11 – Representação gráfica da quantificação da densidade integrada de pixels para a imunomarcação
anti-GFAP na coluna ventral da medula espinal após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta.
A Figura 12 apresenta o aumento da expressão de ezrina após axotomia e tratamento com IFN beta. O lado da medula espinal ipsilateral à lesão nervosa dos animais submetidos ao tratamento revelou uma imunomarcação mais intensa (1,84 ± 0,11; p <0,05) em relação aos controles (axotomia, 1,51 ± 0,14; axotomia mais placebo 1,52 ± 0,09; Figura 13). Esses dados reinforçam a modulação da reatividade astrocitária pelo aumento da expressão de MHC I induzida pelo tratamento com IFN beta.
Figura 12 – Imunomarcação anti-ezrina após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta. A-C lado
contralateral (não lesado) da coluna ventral da medula espinal dos grupos axotomizado, axotomizado com tratamento placebo e axotomizado com tratamento de IFN, respectivamente. Note que o tratamento com IFN beta não alterou o padrão normal da expressão de ezrina. D-F lado ipsilateral da coluna ventral da medula espinal uma semana após lesão. Observe o aumento da imunomarcação, indicando o aumento de projeções astrocitárias mais delgadas. Escala = 50 µm.
Figura 13 – Representação gráfica da quantificação da densidade integrada de pixels para a imunomarcação
anti-ezrina na coluna ventral da medula espinal após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta.
A imunomarcação com o anticorpo anti Iba-1 reflete a intensidade da reatividade microglial. Os resultados mostrados na Figura 14 apresentam um aumento significativo da imunomarcação anti-Iba1 após axotomia periférica (Figura 14A e B). No entanto, o tratamento com IFN beta não interferiu nessa intesificação em resposta à lesão do nervo (placebo 3.12±0.17 e IFN beta 3.44±0.14, p = 0.19, Figuras 14 e 15).
Figura 14 – Imunomarcação anti-Iba1 após axotomia e tratamento placebo ou com INF beta. A e B lado
contralateral (não lesado) da coluna ventral da medula espinal dos grupos placeb e tratado com IFN beta. Note que após axotomia a microglia torna-se reativa em C e D, porém o tratamento com IFN beta não alterou a resposta após lesão (D). Escala = 100 µm.
Figura 15 – Representação gráfica da quantificação
da densidade integrada de pixels para a imunomarcação anti-Iba1 na coluna ventral da medula espinal após axotomia e tratamento com INF beta.
5.4) Aumento da expressão de RNAm para microglobulina beta-2 e GFAP e da quantidade total de proteína MHC I e GFAP no tecido nervoso após axotomia e tratamento com IFN beta
Os resultados da hibridação in situ mostraram visualmente um aumento da expressão de RNAm na região da coluna ventral da medula espinal para a subunidade microglubulina beta-2da e para a proteína GFAP após axotomia (observe Figura 16). Enquanto os gráficos mostram a razão entre os lados lesado/não lesado da quantificação dos grãos de prata que indicam a intensidade de RNAm em animais placebo e animais tratados com IFN beta.
A Figura 16D mostra o aumento da transcrição do RNAm para a subunidade microglobulina após axotomia associada ao tratamento com IFN beta (axotomizado mais tratamento placebo 3,58±0,30; axotomizado mais tratamento com IFN beta 6,54±1,45; p < 0,05). A modulação do RNAm para a proteína astrocítária GFAP após tratamento e axotomia está representada na Figura 16 F-I (axotomizado mais tratamento placebo 2,81±0,37; axotomizado mais tratamento com IFN beta 4,65±0,67; p < 0,05). E como a microglobulina, mostra uma maior intensidade após tratamento com IFN beta.
Microglobulina beta-2
Figura 16 – As fotomicrografias apresentam motoneurônios que compõem o pool do nervo isquiático na
coluna ventral da medula espinal. A-D mostram marcação de RNAm para a subunidade microglobulina beta 2. A e B representam lados não lesados de animais placebo (PL) e tratados com IFN beta respectivamente (IFN), C e D representam neurônios motores axotomizados de animais placebo e tratados. Note a intensa quantidade da marcação que se destaca no interior dos corpos das células da coluna ventral da medula, e que está notadamente aumentada após axotomia periférica e tratamento com IFN beta (gráfico em E). F a I mostram o resultado da técnica de hibridação in situ para a proteína GFAP. F e G são lados contralaterais (CL) à lesão enquanto H e I, lados ipsilaterais (IP) de animais placebo e tratados com IFN beta consecutivamente. Observe a intensa marcação ao redor dos grandes motoneurônios do isquiático do lado axotomizado, essa marcação ocorre especialmente após tratamento com IFN beta (gráfico em J).
A quantidade total de proteína expressa no tecido nervoso medular foi mensurada através de western blotting para as proteínas MHC I e GFAP. Ambas, mostraram aumento de expressão após axotomia conforme mostrado nas Figuras 17 e 18. Analisaram-se lados não lesados e lados lesionados entre os grupos placebo e tratados com IFN beta. Dessa maneira, observou-se expressão de MHC I em ambos os lados da medula, devendo-se essa expressão às regiões perivasculares e outros tipos celulares, entre esses as células gliais. Sendo essa expressão semelhante para os lados não lesados dos grupos placebo e tratado (2,39±0,23 e 2,47±0,21, p= 0,80) e estatisticamente maior para o lado lesado com tratamento de IFN beta (2,71±0,28 e 3,85±0,39, p= 0,03).
Figura 17 – Western blotting para proteína MHC I em tecido medular (lesado, IL e não lesado, CL) de
animais axotomizados tratados com solução placebo e com IFN beta. O aparecimento de duas bandas pode ocorrer devido a presença de isofromas ou diferentes cadeias peptídeas que compões o complexo MHC I. Note a intensificação das bandas em ambos os grupos do lado IL em relação ao lado CL. E, no gráfico B, observe a quantificação de pixels e a comparação entre os lados CL e IL entre os grupos.
Para a proteína GFAP, um aumento da expressão em relação a ambos os lados do grupo placebo pode ser notada (Figura 18). Fato que não foi percebido na avaliação da reação localizada ao redor dos neurônios axotomizados através da imunohistoquímica. É sabido que a astrogliose pode ocorrer em segmentos medulares próximos ao sítio da lesão.
Figura 18 – Western blotting para proteína GFAP em tecido medular (lesado, IL e não lesado, CL) de
animais axotomizados tratados com solução placebo e com IFN beta. Note a intensificação das bandas em ambos os grupos do lado IL em relação ao lado CL, bem como, a maior quantidade de proteína nos dois lados de animais tratados com IFN beta em relação ao grupo placebo. E, no gráfico B, observe a quantificação de pixels e a comparação entre os lados CL e IL entre os grupos.
5.5) Alterações ultraestruturais na medula espinal após axotomia e tratamento com IFN beta
As imagens obtidas ao microscópio eletrônico foram montadas sequencialmente conforme mostra a Figura 19. Após a reconstrução dos motoneurônios, os mesmos tiveram seus terminais pré-sinápticos classificados (botões tipo F, S ou C) e analisados. Foram considerados para o estudo, apenas os neurônios reconhecidos como motoneurônios alfa pela presença de pelo menos um terminal pré-sináptico colinérgico (tipo C) em aposição à superfície de membrana.
A localização dos neurônios estudados na medula espinal e as diferenças ultraestruturais entre os grupos controle, axotomizado e axotomizado mais tratamento com IFN beta estão demonstradas na Figura 20. O tecido proveniente dos animais normais, não operados, revelou uma ampla cobertura sináptica da superfície da membrana dos motoneurônios alfa (Figura 20B).
Uma semana após a transecção do nervo isquiático, algumas alterações ultraestruturais foram observadas ao redor dos motoneurônios axotomizados. Adicionalmente, os neurônios lesionados também apresentaram alterações clássicas de cromatólise, tais como o deslocamento do núcleo e diminuição da eletrodensidade do citoplasma, compatível com a dissolução dos corpúsculos de Nissl. Após a lesão, muitos
Figura 19 – Seqüência de fotomicrografias
utilizadas para a reconstrução de um motoneurônio alfa. Na ampliação é possível observar-se terminais sinápticos numerados seqüencialmente. Escala = 4,5 µm.
terminais pré-sinápticos estavam parcialmente ou totalmente retraídos em relação aos corpos neuronais. Projeções gliais delgadas foram freqüentemente identificadas em contato com a membrana pós-sináptica, preenchendo o espaço entre os botões sinápticos (Figura 20C-D). Devido a baixa eletrodensidade observada nessas projeções, essas estruturas foram atribuídas aos astrócitos.
Figura 20 – Ultraestrutura da superfície de motoneurônios alfa. A- desenho esquemático de segmento lombar
da medula espinal demonstrando o núcleo motor lateral, onde se encontram os motoneurônios que constituem o nervo isquiático. Em detalhe, um motoneurônio (Mn) com um terminal pré-sináptico (T) em aposição. B- cobertura de neurônio normal, não lesionado. C- neurônios após uma semana de axotomia. Note as retrações e as projeções astrocitárias (setas) entre a membrana neuronal e o terminal retraído. D- neurônios após uma semana de axotomia e tratamento com IFN beta. Note os processos de retração e astrogliose exacerbados. Escala = 4,5 µm.
A análise quantitativa da ultraestrutura das sinapses mostrou uma clara redução da cobertura sináptica total nos grupos axotomizado e axotomizado mais tratamento (Figura 21A). Este resultado foi significativamente mais intenso para os animais tratados com IFN beta, com uma média de 36,30 ± 1,75% de cobertura de membrana, comparado com 45,24 ± 2,15% para os animais apenas axotomizados e 53,29 ± 0,41% para animais sem qualquer lesão, resultando, portanto, num decréscimo de 17% da cobertura sináptica após tratamento em relação à normalidade (p<0,001).
O número de botões sinápticos em contato quantificados por 100 μm de membrana diferiu entre os grupos (grupo axotomizado 21,36 ± 1,15 terminais/100 μm de membrana; grupo axotomia e tratamento 17,28 ± 0,93 terminais/100 μm de membrana; p < 0,05). No entanto, esta redução foi ainda mais significativa em comparação aos motoneurônios não lesionados (35,91 ± 1,78 terminais/100 μm de membrana, p < 0,001; Figura 21B).
A cobertura sináptica de cada tipo de terminal (F, S e C) foi calculada e está representada na Figura 21C. Uma ampla retração dos botões tipo F, inibitório, foi observada após o tratamento com IFN beta (normal, 36,12 ±1,64%; axotomia, 31,13 ± 0,02%; axotomia e INF, 23,73 ± 0,01%, p<0,01). Em contraste, a redução da porcentagem da cobertura pelos terminais tipo S, excitatório, não alterou após o tratamento com IFN beta (axotomia, 9,25 ± 0,01%; axotomia mais INF, 8,58 ± 0,01%), no entanto, ambos os grupos apresentaram uma redução significativa dos terminais S em relação ao grupo não axotomizado (12,63 ± 1,26%, p < 0,05). Desta forma, manteve-se o predomínio de cobertura pelos terminais inibitórios tipo F. A contagem dos terminais nervosos parcialmente retraídos revelou uma diferença estatisticamente significativa entre animais
axotomizados e animais axotomizados e tratados (35,85 ± 5,24 e 47,51 ± 1,93, respectivamente; p<0,05, Figura 21D).
Figura 21 – Representação da análise quantitativa da ultraestrutura das sinapses. A – mostra, em
porcentagem, a redução da cobertura sináptica após axotomia e tratamento com IFN beta. B – apresenta o número de terminais pré-sinápticos em aposição a 100 μm de membrana neuronal. C – mostra, em porcentagem, a cobertura sináptica específica para cada tipo de terminal (F, S e C). Observe que os terminais tipo F sofrem uma redução após tratamento com IFN beta, enquanto a quantidade de termianis tipo S é mantida. D – apresenta a diferença da porcentagem de termianais parcialmente retraídos entre o grupo axotomizado e o grupo axotomizado e tratado com IFN beta. Note em todas as análises que o processo de retração sináptica ocorreu de forma mais intensa para os animais submetidos ao tratamento com a citocina.
Os espaços de membrana sem aposição de terminais pré-sinápticos foram medidos, sendo apresentados em histogramas de freqüência (Figura 22). Através desta análise observou-se que, após axotomia, houve um aumento da freqüência de espaços maiores entre os terminais. Tal fato foi ainda mais evidente após tratamento com IFN devido a maior retração sináptica ocorrida. Notou-se que, apesar do processo de retração ser mais exacerbado com o tratamento com IFN, os terminais remanescentes ainda se dispunham em pequenos grupos. Mantendo-se, dessa forma, o padrão seletivo do processo de retração (Figura 22).
Figura 22 – Gráficos mostrando a distribuição de freqüência (em micrômetros) dos espaços entre os terminais
nervosos totalmente ou parcialmente retraídos ao longo da membrana do corpo dos motoneurônios. Observe também as representações esquemáticas que resumem a diferença de cobertura sináptica entre os grupos. A- animal normal, não lesado. B- animal axotomizado. C- animal axotomizado e submetido ao tratamento com IFN beta. Note que a presença de espaçamentos maiores nos animais tratados é mais freqüente.
5.6) Efeitos in vitro do tratamento com IFN beta sobre culturas primárias de astrócitos A fim de confirmar os efeitos diretos do INF beta sobre os astrócitos, culturas purificadas do córtex cerebral de camundongos C57BL/6J neonatos foram estabelecidas. Baseando-se na literatura, diferentes concentrações de INF beta (100, 500 e 1000 UI/ml) foram empregadas e os resultados à respeito da expressão de MHC I (anti-Ox18), de GFAP e de ezrina, documentados e quantificados (Figuras 23, 24 e 24). As doses de 500 e 1000 UI/ml de INF beta induziram um aumento significativo da expressão de MHC I (Figura 23C-D). Embora a marcação fosse visível por toda célula, foi concentrada particularmente nas projeções astrocitárias mais espessas. Em alguns locais, sob tratamento de 500 e 1000 UI/ml, a marcação foi também visível em processos mais finos (Figura 23C-D).
Figura 23 – Imunomarcação anti-MHC I (OX-18) em cultura purificada de astrócitos após tratamento com
diferentes doses de IFN beta (0, 100, 500 e 1000 UI/ml, respectivamente). Setas indicam projeções astrocitárias espessas, enquanto cabeças-de-seta apontam projeções delgadas. Note no gráfico em (E) que os efeitos máximos foram obtidos com as doses de 500 e 1000 UI/ml. Escala = 50µm.
A imunoreatividade do GFAP também foi influenciada pelo tratamento com INF beta (Figura 24). Com doses de 500 e 1000 UI/ml, um aumento significativo da atividade astrocitária resultou em maior densidade devido aos processos celulares organizados de forma a originar uma rede intrincada.
Figura 24 – Imunomarcação anti-GFAP em cultura purificada de astrócitos após tratamento com diferentes
doses de IFN beta (0, 100, 500 e 1000 UI/ml, respectivamente). Note no gráfico em (E) que os efeitos máximos foram obtidos com as doses de 500 e 1000 UI/ml. Escala = 50µm.
Ezrina, que é uma das três proteínas da família REM (radixina, ezrina e moesina), que é encontrada nos processos astrocitários mais finos. Foi usada como indicador adicional da astrogliose reativa (Figura 25). De acordo com a imunomarcação para GFAP, a resposta mais intensa ao INF beta ocorreu com as doses de 500 UI/ml e 1000 UI/ml.
Figura 25 – Imunomarcação anti-ezrin em cultura purificada de astrócitos após tratamento com diferentes
doses de IFN beta (0, 100, 500 e 1000UI/ml, respectivamente), indicando a presença de ramificações finas. Note no gráfico em (E) que os efeitos máximos foram obtidos com as doses de 500 e 1000UI/ml. Escala= 50µm.
5.7) Efeito in vitro do tratamento com AG sobre culturas primárias de astrócitos
A dupla-marcação com DAPI permitiu conferirmos a pureza da cultura primária (Figura 26) e os resultados quantitativos mostraram que o tratamento com diferentes doses de AG não interfere no nível de reatividade astrocitária in vitro. No entanto, o acompanhamento do crescimento do número de células durante o período de tratamento, conciliado à quantificação final do número total de células mostrou que a administração de AG induziu a hiperplasia celular (Figura 26), porém, sem diferença estatisticamente