... SUMÁRIO ...
Dedicatória... vi
Agradecimentos... viii
Lista de Abreviaturas... x
Lista de Figuras... xii
Organização da Tese... xiv
Resumo... xvi
Abstract... xix
1) Introdução... 1
1.1) O Sistema Nervoso... 2
1.2) Motoneurônios alfa... 4
1.3) Alterações neuronais após lesão nervosa... 8
1.4) O complexo de histocompatibilidade principal de classe I no SNC... 10
1.5) Glia e gliose... 15
1.6) Interferon beta (IFN beta) e expressão de MHC I... 20
1.7) Acetato de Glatirâmer (AG)... 23
2) Justificativa... 25
3) Objetivos... 27
4) Materiais & Métodos... 29
4.1) Procedimentos in vivo... 30
4.1.1) Tratamento dos animais com IFN beta... 30
4.1.2) Procedimento cirúrgico: Transecção do nervo isquiático... 31
4.1.3) Eutanásia dos animais... 32
4.1.4) Imunohistoquímica... 32
4.1.5) Hibridação in situ ... 34
4.1.6) Western blotting ... 37
4.1.7) Microscopia eletrônica de transmissão... 38
4.1.8) Análise das secções ultrafinas... 39
4.2) Procedimentos in vitro... 40
4.2.1) Cultura purificada de astrócitos... 40
4.2.2) Imunocitoquímica... 41
5) Resultados... 43
5.1) Aumento da expressão de MHC I após tratamento com IFN beta e lesão do nervo isquiático... 44
5.2) Redução da imunoreatividade para sinaptofisina após axotomia e tratamento com IFN beta ... 47
5.3) Aumento da astrogliose reativa mas não da reatividade da microglia após tratamento com IFN beta... 49
5.4) Aumento da expressão de RNAm para microglobulina beta-2 e GFAP e da quantidade total de proteína MHC I e GFAP no tecido nervoso após axotomia e tratamento com IFN beta... 56
5.5) Alterações ultraestruturais na medula espinal após axotomia e tratamento com IFN beta... 60
5.6) Efeitos in vitro do tratamento com IFN beta sobre culturas primárias de astrócitos.... 68
5.7) Efeito in vitro do tratamento com AG sobre culturas primárias de astrócitos... 70
6) Discussão... 73
7) Conclusões... 83
8) Referências bibliográficas... 85
9) Artigo publicado... 102
Dedico este trabalho aos meus pais que sempre me apoiaram, estiveram presentes e acreditaram em meu potencial, me incentivando na busca de novas realizações.
• Agradeço a Deus pela vida, pelo amor e pela saúde, pois assim pude, da melhor forma, aproveitar essa oportunidade.
• Ao Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, a quem pacientemente me orientou e coordenou nos passos deste trabalho, para que a realização desta tese fosse possível. • Ao Prof. Dr. Benito Pereira Damaceno pelo empenho em conseguir o interferon beta e o acetato de glatiramer para que pudéssemos desenvolver este trabalho.
• Aos funcionários do departamento de anatomia: aos técnicos de laboratório, Nori e Marquinho, que sempre nos auxiliaram com boa vontade e presteza sempre que necessário, à secretaria Ana e à bioterista Marlene, aos técnicos de anatomia Sr. Paulo, Paulo Franscisco e Toni, por auxiliar nos PEDs e nas disciplinas, e por fim, ao porteiro e cobrador do cafezinho Carlão.
• Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural, à coordenadora Profa. Dra. Laurecir Gomes e à secretária Liliam Panagio.
• Ao Biotério Central da UNICAMP, de onde vieram os animais que participaram desta tese, e também à vida de cada um dos animais envolvidos nos experimentos.
• À FAPESP, CAPES, CNPq e FAEPEX meus agradecimentos pelo auxílio financeiro em equipamento, material de consumo, bolsa e auxílio viagem, permitindo, assim, a viabilidade deste trabalho e do laboratório de regeneração nervosa.
• A todos os alunos e amigos do laboratório de Anatomia da UNICAMP, em especial à Ana Paula e àqueles do laboratório de regeneração nervosa: Amanda, Sheila, Rafaela, Gustavo, Juliana, Camila, Gabriel, Roberta, Rodrigo, Luciana, Suzana, Aline, Jéssica, e aos
egressos Pierucci, Aninha, Karina e Mário que tanto me ensinaram no convívio diário, sempre com boas atitudes de coleguismo e respeito mútuo.
• Aos meus pais Sandra e João, irmãos Rodrigo e André, à Izolda, minha linda e velha gatinha e ao Chico, meu cachorro, também, aos meus avós que tanto amo.
• Aos amigos, minha família de coração, que sempre me apoiaram e estiveram presentes em todos os momentos Titi, Tati, DJ, Dani, Dri, e especialmente, Aline, Ana, Cacala e Grá.
AG – Acetato de Glatirâmer
BMP – Binding Membrane Proteins (proteínas ligantes de membrana) BSA – Bovine Serum Albumin (albumina de soro bovino)
CGRP – Calcitonin Gene-Related Protein (proteína relacionada ao gene de calcitonina) DAPI – 4' -6-diamidino-2-fenilindol
DMEM – Dulbecco’s Modified Eaglea’s Medium (meio de Eagle modificado por Dulbecco) DTH – Delayed-Type Hypersensitivity (resposta de hipersensibilidade tardia)
DTT – Ditiotreitol
EAE – Encefalomielite Autoimune Experimental EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético EP – erro padrão
ETAR / ETBR – Endothelin Receptor A and B (receptor de endotelina A e B) GABA – ácido gama-amino-butírico
GAP-43 – Growth Associated Protein 43 (proteína 43 associada ao crescimento) GFAP – Glial Fibrillary Acidic Protein (proteína ácida fibrilar glial)
GluR – receptor de glutamato
HLA – Human Leucocyte Antigen (antígeno leucocitário humano)
ICS - Interferon Consensus Sequence (seqüência consensa para os interferons) IFN – interferon
IgG – imunoglobulina G IL – interleucina
Lmp – Large Multipurpose Protease (grandes proteases multifuncionais) LT – linfócitos T
MBP – Myelin Basis Protein
MHC – Main Histocompatibility Complex (complexo de histocompatibilidade principal) NMDA – N-metil D-aspartato
PB – Phosfate Buffer (tampão fosfato)
PDGF – Platelet Derived Growth Factor (fator de crescimento derivado de plaquetas) PirB – Paired-immunoglobulin Receptor B (receptor de imunoglobulina tipo B) PMSF – Phenylmethylsulfonyl Fluoride
SSC – Tampão cloridrato de sódio-citrato de sódio
TAP – Transporter of Associated Peptide (proteína transportadora de antígeno) TBS-T – Tris-Buffered Saline Tween-20 (tampão Tris-Tween20)
TCR – T cell receptor (receptor de célula T) TdT – terminal deoxinucleotidil transferase Th1 – T cell helpers 1 (células T auxiliares 1)
TGF- Transforming Growth Factor (fator de crescimento de transformação) TNF – Tumoral Necrosis Factor (fator de necrose tumoral)
Figura 1 – organização da substância cinzenta medular proposta por Rexed ... 6
Figura 2 – tipos de terminais pré-sinápticos... 7
Figura 3 – função imunológica do MHC I... 12
Figura 4 – procedimento cirúrgico de lesão do nervo isquiático... 31
Figura 5 – esquema da técnica de hibridação in situ... 36
Figura 6 – imunomarcação anti-MHC I na coluna ventral da medula espinal... 45
Figura 7 – gráfico mostrando a quantificação da imunomarcação anti-MHC I... 46
Figura 8 – imunomarcação anti-sinaptofisina na coluna ventral da medula espinal... 48
Figura 9 – gráfico mostrando a quantificação da imunomarcação anti-sinaptofisina... 49
Figura 10 – imunomarcação anti-GFAP na coluna ventral da medula espinal ... 51
Figura 11 – gráfico mostrando a quantificação da imunomarcação anti-GFAP... 52
Figura 12 – imunomarcação anti-ezrina na coluna ventral da medula espinal ... 53
Figura 13 – gráfico mostrando a quantificação da imunomarcação anti-ezrina... 54
Figura 14 – imunomarcação anti-Iba1 na coluna ventral da medula espinal ... 55
Figura 15 – gráfico mostrando a quantificação da imunomarcação anti-Iba1 ... 55
Figura 16 – hibridação in situ para as proteínas microglobulina beta-2 e GFAP... 57
Figura 17 – western blotting para MHC I e quantificação das bandas ... 59
Figura 18 – western blotting para GFAP e quantificação das bandas ………... 60
Figura 19 – montagem seqüencial superfície do corpo de um motoneurônio alfa... 61
Figura 20 – cobertura sináptica em relação ao corpo de motoneurônios alfa ... 63
Figura 21 – análise quantitativa da cobertura sináptica de motoneurônios alfa... 65
Figura 22 - distribuição de freqüência dos espaços entre pontos de contatos sinápticos ... 67
Figura 23 - imunomarcação anti-MHC I em cultura astrócitos tratadas com IFN beta ... 68
Figura 24 - imunomarcação anti-GFAP em cultura astrócitos tratadas com IFN beta... 69
Figura 25 - imunomarcação anti-ezrina em cultura astrócitos tratadas com IFN beta... 70
ORGANIZAÇÃO DA TESE
A presente tese está dividida em 16 itens.
Os seis primeiros itens são introdutórios ao texto da tese, contendo respectivamente: Lista de Abreviaturas, Lista de Figuras, Organização da Tese, Resumo, Abstract e Sumário. Os nove itens seguintes se referem ao conteúdo da tese propriamente dita, estando estruturados em Introdução, Justificativa, Objetivos, Materiais & Métodos, Resultados, Discussão, Conclusões, Referências Bibliográficas e Artigo Publicado, sendo este originado da presente pesquisa e intitulado “MHC I upregulation influences astroglial reaction and synaptic plasticity in the spinal cord after sciatic nerve transection” (Zanon e Oliveira, 2006), publicado na revista Experimental Neurology.
O último item, anexo, contém a continuação do trabalho ora apresentado denominado “IFN beta treatment enhances axonal growth and motor function recovery following peripheral nerve injury” (Zanon et al., 2009) submetido e a aprovação cedida pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Unicamp para a realização do presente trabalho.
O complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) é uma molécula originalmente do Sistema Imunológico. A presença desses elementos no Sistema Nervoso Central (SNC) parece estar relacionada a diferentes funções, apresentando papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e sendo fundamental no processo de eliminação sináptica após uma lesão nervosa no adulto. No intuito de investigarmos os processos de plasticidade sináptica e reatividade glial no microambiente da medula espinal foram utilizados dois imunomoduladores empregados no tratamento da Esclerose Múltipla, o interferon beta (IFN beta) e o acetato de glatirâmer (AG). O IFN beta, potencialmente capaz de influenciar a expressão de MHC I, foi utilizado in vivo, juntamente com axotomia periférica e in vitro, enquanto o AG foi utilizado para testes in vitro. Para tanto, camundongos C57BL/6J foram tratados com 10.000 UI de IFN beta durante 2 semanas, antes e depois da transecção unilateral do nervo isquiático. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinais lombares processadas para imunohistoquímica (anti-MHC I, sinaptofisina, GFAP – glial fibrillary acidc protein, ezrina e iba1), hibridação in situ (sondas para GFAP e microglobulina beta-2), Western blotting (GFAP e MHC I) e microscopia eletrônica de transmissão. Grupos axotomizados, placebo e não tratado foram utilizados como controles. Adicionalmente ao estudo in vivo, foram estabelecidas culturas purificadas de astrócitos para o tratamento com diferentes doses de IFN beta (0, 100, 500 ou 1000 UI/ml) ou AG (0, 1.2, 2.5 ou 5.0µg/ml) durante 5 dias. As culturas tratadas com IFN beta foram submetidas à imunohistoquímica para MHC I, ezrina, GFAP, enquanto nas culturas tratadas com AG foi realizado o estudo para verificar a reatividade e proliferação através da marcação anti-GFAP e DAPI (para identificação dos núcleos das células). In vivo, os resultados mostraram um aumento do
RNAm e da expressão protéica para MHC I após axotomia, sendo que este incremento foi maior no grupo tratado com INF. Observou-se a intensificação da expressão das proteínas que expressam a reatividade astrocitária, GFAP e ezrina, concomitantemente à diminuição da imunomarcação para sinaptofisina, especialmente no grupo tratado. O tratamento realizado não influenciou a reatividade da microglia. A análise do material in vitro também mostrou, após o tratamento com IFN beta, um aumento da expressão de MHC I e GFAP, bem como de ezrina. As doses que mais estimularam a elevação da expressão dos marcadores estudados foram as de 500 e 1000 UI/ml. Dado que não ocorreu para o tratamento com o acetato de glatirâmer. Assim, o tratamento com AG não alterou o nível de reatividade astrocitária, apesar de estimular a proliferação celular. A ultraestrutura das sinapses mostrou uma intensa retração dos terminais pré-sinápticos em contato com os motoneurônios alfa, induzida pela axotomia mais o tratamento com IFN beta. Em conjunto, esses resultados reforçam a importância da expressão de moléculas de MHC I em resposta à lesão nervosa e seu papel como mecanismo de comunicação entre neurônio e glia, além de reafirmar que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica.
The class I main histocompatibility complex (MHC I) is a molecule originally restricted to Immune System. The presence of such element in the Central Nervous System (CNS) may indicate other functions, including an important role in the synaptic refinement during the development of the CNS as well as in the synaptic elimination process after a peripheral nerve injury in the adult. To investigate the synaptic plasticity and glial reactivity in the spinal cord, two immunomodulators, widely used for treating Multiple Sclerosis, were applied, namely the Interferon beta (IFN beta) and the glatiramer acetate (GA). The IFN beta was used in order to upregulate the MHC I expression in vivo, after a peripheral axotomy, and also in vitro. GA treatment was only used for in vitro experiments. C57BL/6J mice were injected with 10,000 IU of IFN beta for 2 weeks, before and after the nerve transection. The animals were sacrificed and the lumbar spinal cords were processed for immunohistochemistry (MHC I, synapthophysin, GFAP, ezrin and Iba-1 antisera), in situ hybridization (beta 2 immunoglobulin, a component of the MHC I molecule, and GFAP), Western blotting (GFAP and MHC I) and transmission electron microscopy. Placebo and non-treated axotomized groups were used as controls. Additionally to the in vivo study, primary cultures of astrocytes were established and treated during five consecutive days with different doses of IFN beta (0, 100 IU, 500 IU and 1000 IU/ml). In this case, some cultures were treated with GA (0, 1.2, 2,5 and 5.0 µg/ml). INF treated cultures were processed for immunocitochemistry (MHC I, GFAP and ezrin antisera). GA treated cultures were evaluated with anti-GFAP antibody and cell proliferation was accessed with DAPI staining. In vivo, the results showed an upregulation of MHC I mRNA and protein expression after axotomy, that was stronger in the IFN treated group. We observed a greater GFAP and ezrin expression, coupled with a decrease of synapthophysin immunoreactivity.
Such alterations were more evident in the IFN treated group. Interestingly, the IFN beta treatment did not interfere in the microglial reactivity. The in vitro analysis also showed a sharp upregulation of MHC I, GFAP and ezrin, mostly when the cultures were subjected to 500 and 1000 IU/ml of IFN beta. Regarding the GA treatment, the results showed that treatment did not change the level of astroglial reactivity despite stimulating cellular proliferation. The ultrastructural analysis of synapses showed a larger pruning of presynaptic terminals in contact with alpha motoneurons, induced by axotomy plus IFN beta treatment. Together, our results reinforce the importance of the MHC I expression as a response to nerve injury and its role as a communication mechanism between neurons and surrounding glial cells. Furthermore, the present data confirm that astrocytes are active elements during the synaptic plasticity process.
1.1) O Sistema Nervoso
Anatomicamente, o Sistema Nervoso consiste de uma porção central (Sistema Nervoso Central – SNC) que se subdivide em duas partes (segmentar, representado pela medula espinal, e supra-segmentar, onde se encontra o encéfalo) e uma porção periférica (Sistema Nervoso Periférico – SNP, representado por gânglios e nervos). O Sistema Nervoso apresenta diversas funções que envolvem o processamento de informações sensoriais, o controle motor, a mediação de respostas autonômicas, a elaboração de respostas emocionais, aprendizagem e memória. O tecido nervoso é composto por diferentes tipos de células, os neurônios, a macroglia (astrócitos e oligodendrócitos), a microglia, os macrófagos perivasculares, que são as primeiras células a apresentarem uma resposta imune no SNC, as células endoteliais, as células ependimárias, que forram os ventrículos cerebrais, e as células que formam os envoltórios do Sistema Nervoso, as meninges (Machado, 1998; Kandel et al., 2000).
Os neurônios são células especializadas na condução do impulso nervoso e constituem a unidade fundamental do SNC. Um neurônio típico é constituído de um corpo (soma), dendritos e um axônio, porém, o SNC contém uma ampla variedade de neurônios com diferentes morfologias e funções. A célula, como um todo, apresenta contatos com terminais ou botões sinápticos de outros neurônios, formando as sinapses (Kandel et al., 2000).
Funcionalmente, os neurônios podem ser sensitivos, motores ou interneurônios. Cabe destacarmos os neurônios motores ou motoneurônios, que podem ser primários quando estão localizados na área motora do córtex cerebral, e projetam fibras nervosas que fazem
conexões em níveis caudais com os motoneurônios secundários, localizados nos núcleos da base, no tronco encefálico e na coluna ventral da medula espinal.
Os motoneurônios medulares, isto é, localizados na medula espinal, podem ser divididos em tipos alfa e gama. Os motoneurônios gama são menores e inervam as fibras intrafusais dos fusos musculares. Os motoneurônios alfa são maiores e inervam as fibras musculares extrafusais que contribuem de fato para a contração muscular (Kandel et al., 2000).
O neurônio do tipo alfa é o tipo de neurônio de interesse no presente trabalho. Como citado acima, estão localizados na medula espinal, especificamente, na região mais interna da medula em forma de “H”, chamada de substância cinzenta, que contém os corpos neuronais, externamente, se encontra a substância branca que contém as fibras nervosas mielinizadas. Os astrócitos, constituintes da macroglia, também estão presentes em ambas as substâncias da medula e desempenham inúmeras funções no SNC (Shao e McCarthy, 1994).
Os astrócitos são o tipo mais abundante de célula glial (40-50% da glia) e caracterizam-se por possuírem inúmeros prolongamentos, restando pequena quantidade citoplasmática ao redor do núcleo, que pode ser esférico ou ovóide. Reconhecem-se dois tipos de astrócitos: os fibrosos, que apresentam prolongamentos lisos, longos e delgados, sem muitas ramificações e são encontrados na substância branca; e os protoplasmáticos, que possuem grande quantidade citoplasmática e grânulos, prolongamentos espessos e bastante ramificados, localizando-se somente na substância cinzenta. Os prolongamentos dos astrocitários protoplasmáticos relacionam-se intimamente com os corpos dos neurônios e, de maneira especial, envolvem as sinapses (Aldskogius et al., 1999; Kandel et al., 2000).
Os oligodendrócitos, também são constituintes da macroglia, porém menores que os astrócitos e com menor quantidade de prolongamentos. Distinguem-se dois tipos de oligodendrócitos: os satélites ou perineuronais, situados junto ao soma e dendritos, e os fasciculares, encontrados junto às fibras nervosas, responsáveis pela produção da mielina no SNC (Kandel et al., 2000).
A microglia compreende aproximadamente 10% das células gliais e são células pequenas e alongadas, possuem poucos prolongamentos que partem de suas extremidades. São sensíveis às alterações em seu microambiente e fazem parte do Sistema Fagocitário Mononuclear, assim, tornam-se ativas em resposta às lesões ou processos patológicos no SNC. Uma vez ativadas, as células microgliais exibem alterações morfológicas, no número de células, na expressão de receptores de membrana, liberam citocinas e fatores tróficos, e são capazes de realizarem endocitose e fagocitose, transformando-se em macrófagos do SNC (Kreutzberg, 1996; Aldskogius e Kozlova, 1998). Um dos sinais mais precoces da ativação da microglia é o aumento da expressão do receptor CD11b/c (um receptor do sistema complemento), podendo ser detectado 24 horas após uma lesão central (Graeber et al., 1988a). Adicionalmente, a proliferação das células microgliais é evidente especialmente de dois a quatro dias após lesão (Graeber et al., 1988b).
1.2) Motoneurônios alfa
Os neurônios medulares agrupam-se em núcleos que se dispõem dentro das três colunas da medula espinal (colunas dorsal, lateral e ventral). Alguns núcleos, entretanto, não se estendem ao longo de toda a medula (Kandel et al., 2000). Os núcleos da coluna ventral compreendem os motoneurônios secundários e podem ser divididos em grupo
medial e grupo lateral, de acordo com sua posição. O grupo medial existe em toda extensão da medula e os motoneurônios aí localizados inervam a musculatura axial, enquanto o grupo lateral origina fibras nervosas que inervam a musculatura dos membros. Em função disso, o grupo lateral está presente apenas nas regiões das intumescências cervical (motoneurônios destinados a inervação dos membros anteriores) e lombar (motoneurônios que inervam a musculatura dos membros posteriores) (Hebel e Stromberg, 1986; Machado, 1998).
No grupo lateral de núcleos, os neurônios localizados ventro-medialmente inervam a musculatura proximal dos membros, enquanto que, os neurônios na região dorso-lateral originam fibras nervosas para suprir os músculos distais dos membros. Nos membros posteriores, o nervo isquiático inerva os músculos proximais da região posterior da coxa e todos os músculos distais do membro (Hebel e Stromberg, 1986; Machado, 1998). Dessa forma, pode-se afirmar que os motoneurônios localizados dorso-lateralmente na coluna ventral da medula lombar pertencem ao pool de neurônios que constituem o nervo isquiático, assim sendo, somente as células dessa região foram consideradas para análise no presente trabalho.
A Figura 1 mostra a divisão da substância cinzenta medular proposta por Rexed (1952; 1954) a partir da correlação entre as conexões sinápticas e dados eletrofisiológicos. A substância cinzenta foi então subdividida em dez lâminas: as lâminas I-VI correspondem à coluna dorsal ou posterior da medula, a VII à zona intermediária, as lâminas VIII e IX compreendem a coluna ventral ou anterior e a lâmina X, a substância cinzenta central da medula espinal. A lâmina IX inclui os núcleos motores, lateral e medial que inervam a musculatura estriada esquelética (Kandel et al., 2000).
Figura 1 - Organização da substância cinzenta da medula espinal proposta por Rexed. A imagem representa
um corte transversal ao nível da intumescência lombar da medula (L5). Em vermelho o núcleo motor medial. Em tons de azul destaca-se o núcleo motor lateral, em azul escuro, área considerada para esse estudo, apresenta os motoneurônios dorsais para inervação dos músculos distais do membro posterior, e, em azul claro, os motoneurônios ventrais que inervam os músculos proximais do membro posterior.
Conradi (1969) descreveu a ultraestrutura dos motoneurônios medulares de gatos em situação de normalidade e após lesão da raiz dorsal nervosa. Este autor observou que os motoneurônios alfa possuem um grande corpo celular circular ou ovóide com diâmetro entre 30-60 μm, já em camundongos, a média do diâmetro do corpo celular dos motoneurônios alfa é de 35 μm (Oliveira et al., 2004). No microambiente medular, os motoneurônios apresentam contatos com a glia, dendritos e terminais sinápticos, sendo que aproximadamente metade de toda extensão da membrana de seu corpo celular apresenta-se coberta por projeções gliais, destacando-se os contatos com os astrócitos.
Os terminais sinápticos ou botões sinápticos apresentam seu interior preenchido por vesículas e, segundo o aspecto morfológico dessas, os terminais podem ser classificados em
três tipos (Figura 2): tipo S, que possuem vesículas esféricas contendo o aminoácido excitatório glutamato; tipo F, que possuem apenas vesículas achatadas contendo glicina, ou achatadas e esféricas, contendo também ácido gama-amino-butírico (GABA), sendo os do tipo F, inibitórios; e, ainda, tipo C, que são excitatórios e colinérgicos. Notadamente, apenas os motoneurônios alfa possuem terminações sinápticas do tipo C, sendo estes cruciais para sua correta identificação em nível ultraestrutural (Conradi, 1969; Shupliakov et al., 1993).
Cedido por Alexandre L.R. de Oliveira – arquivo pessoal
Figura 2: Fotomicrografia mostrando os três tipos de terminais pré-sinápticos (S, C e F) em aposição à
membrana de um motoneurônios alfa medulares. Escala = 2µm.
Os terminais tipo F são maiores do que os do tipo S, especialmente no corpo celular, enquanto os terminais do tipo C são de duas a três vezes maiores do que os do tipo F. A média de comprimento de membrana ocupada com o contato sináptico varia de acordo com
o tipo de terminal e de acordo com a porção do neurônio. A média de cobertura do corpo é de aproximadamente 50% do total da superfície de sua membrana, enquanto nos dendritos é de 70% (Conradi, 1969).
1.3) Alterações neuronais após lesão nervosa
Qualquer mudança morfológica de um neurônio, especialmente de suas aferências, pode ter conseqüências importantes sobre suas funções e metabolismo. Essas alterações são freqüentemente acompanhadas por um remodelamento da glia adjacente, e esta modificação do microambinte extracelular oferecerá um impacto direto sobre a atividade neuronal e na transmissão sináptica (Theodosis et al., 2006).
O SNC é muito sensível a lesões e sua capacidade regenerativa é limitada. Assim, na maioria dos casos, o reparo tecidual não ocorre ou ocorre de forma incompleta, causando danos irreversíveis (Moran e Graeber, 2004). Para melhor compreensão dos mecanismos e limitações da regeneração do SNC, modelos de lesão nervosa foram propostos e estudados por diversos autores. Nesse contexto, modelos clássicos de lesão como a transecção ou esmagamento de nervo periférico (Lieberman, 1971; Chen, 1978; Reisert et al., 1984; Aldskogius e Svensson, 1993), a avulsão de raízes ventrais ou dorsais (Koliatsos et al., 1994; Pihel et al., 1995), a incisão no funículo ventral da medula (Risling et al., 1983; Linda et al., 1992) têm sido utilizados.
A axotomia de um nervo periférico causa uma resposta tecidual complexa no SNC. Esta resposta, que afeta tanto o corpo celular quanto o microambiente circunjacente dos motoneurônios axotomizados, manifesta-se através de alterações estruturais, metabólicas, eletrofisiológicas e moleculares (Moran e Graeber, 2004). Incluídos nesse contexto, estão o
edema do corpo celular, a retração de terminações sinápticas, o deslocamento do núcleo para a periferia da célula e a dissolução da substância de Nissl. Essas alterações do corpo celular são, em conjunto, denominadas cromatólise (Aldskogius e Svensson, 1993). Adicionalmente, ocorrem outras alterações metabólicas que envolvem o aumento da expressão de proteínas estruturais, tais como CGRP (calcitonin gene-related peptide) e GAP-43 (growth associated protein 43), ao passo em que a expressão de proteínas relacionadas à transmissão sináptica diminui grandemente. Todas essas alterações são interpretadas como uma modificação do estado funcional dos neurônios lesionados, passando de um modo de transmissão sináptica para um modo regenerativo em que a célula direciona seu metabolismo para a recuperação da lesão (Barron, 1983; Linda et al., 1992; Piehl et al., 1993; Piehl et al., 1998).
Dentre as alterações ultraestruturais após uma injúria no tecido nervoso, destaca-se a redução do número de contatos sinápticos no corpo neuronal e na região proximal dos dendritos. Sendo que esta redução de sinapses não ocorre da mesma maneira para os diferentes tipos de terminais sinápticos. Assim, os terminais excitatórios, do tipo S, são mais afetados (Linda et al., 2000; Cullheim et al., 2002; Oliveira et al., 2004). Nesse contexto, Linda et al. (2000) demonstraram, após a axotomia intramedular no funículo ventral da medula, uma perda significativa no número de sinapses apenas dois dias após a lesão. Observaram ainda que essa fase de diminuição da cobertura sináptica continuou até a terceira semana após a lesão, atingindo menor média de 13% de cobertura em 100μm de membrana, em relação à cobertura sináptica de um neurônio não lesado. Durante a fase de eliminação dos terminais sinápticos, os terminais glutamato-positivos do tipo S foram mais
afetados, aproximadamente 90% dos terminais, enquanto os inibitórios do tipo F sofreram redução de 70%. Essas alterações sinápticas refletem uma reorganização ativa dos contatos sinápticos em resposta a lesão, levando a uma mudança metabólica de um estado de transmissão sináptica para um estado de recuperação do tecido comprometido pela lesão (Barron, 1983; Linda et al., 2000).
1.4) O complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) no SNC
As moléculas codificadas nos genes MHC são constituídas estruturalmente por glicoproteínas e estão divididas em três grupos (Fraga e Neumann, 1996).
O primeiro grupo recebeu a denominação de classe I. É um heterodímero constituído por uma longa cadeia polipeptídica com três domínios extracelulares (alfa 1, alfa 2 e alfa 3) ligada, não covalentemente, a uma pequena proteína não-polimórfica denominada microglobulina beta-2, essencial para o processamento e expressão das moléculas classe I (Fraga e Neumann, 1996; Thorsby, 1999).
O segundo grupo, denominado de classe II contém duas cadeias distintas, alfa (com dois domínios extracelulares, alfa 1 e alfa 2) e beta (domínios beta 1 e beta 2). As moléculas de classe II são expressas por todas as células apresentadoras de antígeno, e sua função é apresentar peptídeos de 15 a 20 aminoáciodos de comprimento para as células T, CD3 e CD4 (células T helpers) que iniciam a resposta imune (Fraga e Neumann, 1996).
O terceiro grupo, chamado de classe III, é constituído por proteínas solúveis presentes no soro, fazendo parte desse grupo algumas proteínas do Sistema Complemento e outras como o TNF (tumoral necrosis factor) (Fraga e Neumann, 1996).
Em humanos, as moléculas do complexo MHC (ou HLA, human leucocyte antigen – primeira denominação para as moléculas apresentadoras de antígenos em humanos) são codificadas por genes do complexo HLA, encontrado no braço curto do cromossomo 6. Já os genes para codificação da microglobulina beta-2, se encontram no cromossomo 15 (Thorsby, 1999). Em camundongos, o gene codificante da molécula de MHC I, chamado H2, está localizado no cromossomo 17 (Lidman et al, 1999).
A principal característica estrutural das proteínas do sistema MHC é a presença de uma região em forma de bolsa que comporta pequenos peptídeos que, por sua vez, mostram extraordinário polimorfismo (Thams et al., 2007). Nas moléculas de classe I, esses peptídeos apresentam quase sempre nove aminoácidos de comprimento. A associação entre os peptídeos e as moléculas MHC é parcialmente específica, isto é, nem todo peptídeo é capaz de se associar a toda molécula MHC. Essa capacidade de associação é dependente do tamanho da cadeia polipeptídea, bem como das suas polaridades e cargas elétricas (Fraga e Neumann, 1996).
A função das moléculas de MHC I (Figura 3) é revelar, ao meio extracelular, amostras dos constituintes protéicos das células, sinalizando ao Sistema Imunológico que o metabolismo está normal, isto é, que as proteínas sintetizadas no interior celular são todas próprias dessas células. No entanto, pode revelar que seu maquinário de síntese protéica está desviado de suas funções, apresentando peptídeos de microorganismos de multiplicação citosólica, comumente vírus, às células T citotóxicas CD8, dando início a uma resposta imune (Figura 3; Fraga e Neumann, 1996).
As células T citotóxicas, uma vez ativadas, em geral, eliminam qualquer célula que possam especificamente reconhecer (Janeway e Travers, 1997). No entanto, algumas experiências originalmente planejadas para a exploração da base estrutural do reconhecimento antigênico pelas células T mostraram, de modo inesperado, que o reconhecimento não conduz necessariamente à ativação de uma resposta imune, mas sim na sua inibição. Assim, alguns complexos MHC/peptídeo podem inibir a ação das células T. Estes peptídeos são usualmente designados como peptídeos antagonistas ou peptídeos ligantes alterados (Fraga e Neumann, 1996; Janeway e Travers, 1997).
Todas as células nucleadas expressam MHC I, embora o nível de expressão varie entre os tipos celulares. As células do Sistema Imunológico, por exemplo, o expressam em grande quantidade, enquanto as células hepáticas expressam níveis relativamente baixos (Janeway e Travers, 1997).
Figura 3: MHC I no Sistema Imune. A
molécula TAP é requerida no retículo endoplasmático para a apresentação do peptídeo pelo MHC. A subunidade microglobulina beta-2 (β2-m) completa a estrutura da molécula para sua expressão na superfície celular. O receptor associado à unidade CD3, é expresso pelos linfócitos T e interage com o complexo MHC-peptídeo.
Fonte: Boulanger e Shatz, Nature Reviews
No Sistema Nervoso, a barreira hemato-encefálica constitui uma proteção a possíveis agentes patológicos e também impede, numa situação de normalidade, a passagem de células do Sistema Imunológico para o parênquima do SNC (Pihel e Lidman, 2001), dessa forma, as células nervosas não expressam ou expressam níveis muito baixos de moléculas relacionadas à resposta imune, tais como o MHC I, sendo, portanto, considerados “imunoprivilegiados” (Lampson e Hickey, 1986; Ljunggren e Kärre, 1990; Joly et al., 1991; Mucke e Oldstone, 1992; Rall et al., 1994). Em contraposição a essa idéia, foi demonstrado que as células nervosas podem expressar moléculas de MHC I in vitro (Neumann et al., 1995; Linda et al., 1998). In vivo, vários grupos neuronais também expressam MHC I, como os motoneurônios medulares (Linda et al., 1998), neurônios do Sistema Visual (Corriveau et al., 1998), da substância negra, dos núcleos da base, do hipocampo e do hipotálamo (Lidman et al., 1999). Esses estudos propuseram que a expressão de MHC I no SNC poderia estar relacionada a outras funções, diferentes de seu conhecido papel no Sistema Imunológico (Linda et al., 1999; Lidman et al., 1999).
Recentemente, apesar dos mecanismos intrínsecos do processo de plasticidade sináptica no SNC serem virtualmente desconhecidos, um mecanismo envolvendo a expressão do MHC I foi proposto por Huh et al. (2000). Nesse sentido, esses autores demonstraram que camundongos transgênicos, incapazes de expressar o MHC I, apresentavam uma falha no processo de segregação das aferências provenientes da retina para o corpo geniculado lateral, durante o desenvolvimento do Sistema Visual. Tal observação levou à conclusão de que o sinal proveniente do MHC I é de fundamental importância para a remoção de conexões sinápticas extranumerárias durante o desenvolvimento. Através da técnica de hibridação in situ, esses autores identificaram
RNAm para moléculas de MHC I em muitas populações neuronais e observaram que a expressão desse RNAm é aumentada pela atividade elétrica neuronal espontânea durante o processo de desenvolvimento do SNC (Huh et al., 2000), sugerindo, então, que a regulação da transcrição do MHC I é dependente da atividade elétrica neuronal.
Oliveira et al. (2004) investigaram a hipótese de que a eliminação sináptica após uma axotomia fosse, pelo menos em parte, dependente da presença do MHC I, da mesma forma que demonstrada por Huh et al. (2000) durante o desenvolvimento. Para tanto, realizaram a transecção do nervo isquiático em camundongos deficientes para a expressão da proteína microglobulina beta-2, uma subunidade do complexo de MHC I. Uma semana após a lesão, os motoneurônios medulares foram identificados e os terminais sinápticos em contato com o corpo celular foram analisados em nível ultraestrutural, calculando-se assim a cobertura sináptica remanescente.
Notadamente, os resultados obtidos indicaram que os animais deficientes para a microglobulina beta-2 apresentaram maior eliminação sináptica, sendo os terminais inibitórios mais comprometidos, enquanto animais normais também submetidos à lesão apresentaram uma menor redução dos terminais inibitórios. Esses resultados indicaram que, em animais adultos, após uma lesão nervosa, o MHC I desempenha um papel fundamental na estabilização seletiva de sinapses inibitórias, contribuindo para que o processo de retração ocorra de forma específica (Oliveira et al., 2004).
Oliveira et al. (2004) também estudaram a sobrevivência neuronal e a capacidade regenerativa através do emprego de um marcador retrógrado. Assim, após três semanas da axotomia e, portanto, após a regeneração tecidual que re-conectou os cotos do nervo, um segmento de 1mm do coto proximal foi extraído, e o traçador aplicado através do coto
proximal remanescente do nervo, para a identificação dos neurônios sobreviventes. Os resultados mostraram que o número de neurônios marcados foi equivalente para os animais com expressão normal de MHC I e os animais com deficiência desta expressão, no entanto, quando o traçador foi aplicado através do coto distal do nervo isquiático (distalmente ao tecido regenerativo), o número de neurônios marcados foi significativamente menor para os animais com deficiência de expressão de MHC I. Essa diferença mostra que a presença de moléculas MHC I é importante para a regeneração axonal após lesão nervosa, tendo, portanto implicações sobre o potencial regenerativo do Sistema Nervoso (Oliveira et al., 2004). Contribuindo com essa idéia um trabalho recente realizado por Sabha et al. (2008) mostra a relação entre a capacidade regenerativa e expressão de MHC I em diferentes linhagens de camundongos. Dessa forma, animais da linhagem C57BL6/J, que normalmente expressam comparativamente pouca quantidade de MHC I, apresentam baixo potencial regenerativo ao lado de uma menor porcentagem de destacamento sináptico após lesão nervosa. Em contrapartida, animais A/J, que expressam maior quantidade de MHC I, mostram uma capacidade regenerativa maior juntamente com uma maior taxa de retração das sinapses.
1.5) Glia e gliose
Há 20 anos a glia não era considerada um componente importante do SNC. Até então, as funções gliais envolviam suporte, suprimento de nutrientes e remoção de debris celulares. Após vários estudos, descobriu-se que a glia apresentava funções essencias para o normal funcionamento do processamento de informações, na memória e aprendizado e na plasticidade (Temburni e Jacob, 2001).
Os astrócitos protoplasmáticos, como referido anteriormente, são aqueles encontrados na substância cinzenta da medula e que estão em íntimo contato com as sinapses. Eles apresentam canais iônicos que tem papel direto e ativo na transmissão sináptica (Temburni e Jacob, 2001). Suas projeções citoplasmáticas que representam de 70 a 80% de sua membrana são particularmente abundantes ao redor das terminações nervosas (Wolff, 1970; Spacek, 1985), onde formam processos perisinápticos (Derouiche e Frotsher, 2001). Tais projeções são extremamente delicadas, não contêm organelas citoplasmáticas e, normalmente, apresentam espessura limitada a 50 nm.
As projeções astrocitárias têm a capacidade de alterarem rapidamente seu volume, regulando, desta forma, o ambiente perisináptico (Hanson, 1994; Hanson e Rönnbäck, 1995). São capazes, também, de limitar a difusão de íons e neurotransmissores (Chvatal e Sykova, 2000; Verkhratsky e Steinhäuser, 2000). Dessa forma, há evidências que as projeções astrocitárias sejam de grande importância na modulação da excitabilidade neuronal e, conseqüentemente, na transmissão nervosa (Kang et al., 1998; Grosche et al., 1999, Araque e Perea, 2004), conferindo a essas células um alto grau de sensibilidade a mudanças no microambiente do neurópilo (Castonguay et al., 2001).
Os astrócitos também produzem o ácido quinurênico, o qual se constitui num antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) (Roberts et al., 1992); apresentam canais de cálcio, que atuam na modulação da inibição sináptica (Bormann e Kattenmann, 1988) e transportadores de glutamato, localizados particularmente nas adjacências de terminações glutaminérgicas (Rothestein et al., 1994; Derouiche e Rauen, 1995). Apresentam canais de cloro que controlam o pH extracelular e regulam o volume celular (Deitmer e Rose, 1996). Os vários tipos de canais de potássio regulam o ambiente iônico
celular (Newman e Reichenbach, 1996) e os canais de sódio, estão envolvidos no controle das atividades de vários transportadores, particularmente do Na+/K+ ATPase e Na+/glutamato (Verkhratsky e Steinhäuser, 2000).
Receptores para neurotransmissores são encontrados nas células gliais. Assim, têm sido descrita a presença de receptores ionotrópicos e metabotrópicos (mGluR3 e mGluR5) para o glutamato (Schools e Kimelberg, 1999), receptores GABAérgicos, adrenérgicos, colinérgicos, serotoninérgicos e receptores para vários peptídeos incluindo-se a substância P e o neuropeptídeo Y (Verkhratsky e Steinhauser, 2000; Castonguay et al., 2001).
Os astrócitos, através de suas amplas funções, bem como pela plasticidade de suas projeções citoplasmáticas, representam elementos fundamentais no processo de plasticidade sináptica após uma lesão nervosa (Aldskogius et al., 1999).
Paralelamente às alterações observadas nos motoneurônios axotomizados, os astrócitos também apresentam uma série de alterações metabólicas características, em conjunto denominadas astrogliose, gliose reativa ou astrogliose reativa (McCall et al., 1996; Pekny, 2001), que inclui principalmente o aumento da expressão de GFAP (glial fibrillary acidic protein) e de seu RNAm, esta proteína é constituinte da rede de filamentos intermediários do citoesqueleto dos astrócitos, presentes, portanto, no corpo celular e nas projeções astrocitárias (Tetzlaff et al., 1988).
Subseqüentemente, ocorre um aumento da expressão de apolipoproteína J (Svensson et al., 1995), PDGF (platelet derived growth factor) (Hermansson et al., 1995), do receptor NMDA (Popratiloff et al., 1996), e da proteína GAP-43 (Rohlmann et al., 1994), que indicam um aumento da comunicação intercelular. Também ocorre um aumento da expressão de receptores de endotelina (ETAR e ETBR), que promovem uma concentração
intracelular maior de íons Ca++ (MacCumber et al., 1990), induzem o efluxo de glutamato (Sazaki et al., 1997), estimulam a síntese de mediadores inflamatórios e promovem a organização do citoesqueleto de actina (Koyama e Baba, 1999), regulando a hipertrofia e hiperplasia astrocitária no SNC lesado (Rogers et al., 2003).
Os astrócitos, em resposta à lesão nervosa, também expressam moléculas de MHC I, semelhantemente aos neurônios axotomizados, o que parece ter função importante no processo de eliminação sináptica (Jarosinski and Massa, 2002; Cullheim and Thams, 2007). Neste sentido, Oliveira et al. (2004) descreveram que camundongos deficientes na expressão de MHC I apresentam uma astrogliose reativa mais intensa após axotomia. Dessa forma, pode-se dizer que moléculas de MHC I influenciam a astrogliose após lesão, interferindo, portanto, no processo de plasticidade e regeneração sináptica (Stensaas et al., 1987; Reier et al., 1989).
Como a expressão da proteína GFAP é caracteristicamente aumentada em astrócitos próximos de motoneurônios lesionados (Graeber e Kreutzberg, 1986; McCall et al., 1996; Norton, 1999), esta se constitui num eficiente marcador de seus processos citoplasmáticos (Pekny, 2001). Contudo, os processos celulares mais delgados parecem não conter exclusivamente GFAP, mas também, um conjunto de proteínas denominadas “actin-binding ERM proteins”, onde E indica ezrina, R indica radixina e M indica moesina (Derouiche e Frotsher, 2001; Derouiche et al., 2002). Localizados imediatamente abaixo da membrana plasmática (Louvet-Vallé, 2000), as proteínas ERM conectam proteínas da membrana celular com o citoesqueleto de actina, ligando-se à membrana plasmática através dos receptores transmembrana ERMBMPs (ERM binding membrane proteins), (Derouiche e Frotsher, 2001; Batchelor et al., 2004; Faure et al., 2004). Através de estudos
ultraestruturais, comprovou-se que ezrina e radixina estão presentes nos prolongamentos astrocitários lamelares mais finos (Derouiche e Frotsher, 2001; Derouiche et al., 2002).
Estes processos finos, através de sua motilidade respondem, com rápidas alterações estruturais, a mudanças de atividade das sinapses próximas (Derouiche e Frotscher, 2001), se interpondo entre a membrana do motoneurônio lesado e seus terminais sinápticos retraídos (Brännström e Kellerth, 1998; Aldskogius et al., 1999). Portanto, a identificação dessas proteínas também pode ser tida como indicativo da reatividade dos astrócitos, além de mostrar a relação entre os terminais sinápticos retraídos e as delgadas projeções astrocitárias.
As células microgliais fazem parte do Sistema Imune Inato e forma a primeira linha de defesa do SNC. Sua proliferação é o evento-chave na sua ativação após um episódio patológico agudo (Streit et al., 1999; Dising-Olesen, 2007) e em doenças neurodegenerativas (Simpson et al., 2007). A ativação da microglia se caracteriza por alterações estruturais, bioquímicas e funcionais que podem causar prejuízo e destruição neuronal. Dessa forma, a microgia ativa pode proporcionar efeitos neurotóxicos pela produção radicais livres, oxido nítrico, agonistas NMDA, proteases e citocinas (Cullheim e Thams, 2007). Por outro lado, a microglia também pode atuar como agente neuroprotetor, produzindo, por exemplo, o fator de crescimento como o TGF-beta1 (Streit, 2005).
Na axotomia de nervo periférico, a microglia também parece ter importância para o processo de plasticidade, contribuindo, de alguma forma, com o destacamento dos terminais pré-sinápticos em relação a membrana neuronal, principalmente num primeiro momento após a lesão, especificamente nas primeiras 72 horas (Streit and Kreutzberg, 1988; Dissing-Olesen, 2007, Cullheim e Thams, 2007). Porém, sua ativação parece não ser
essencial para o processo de destacamento das sinapses (Svensson and Aldskogius, 1993; Aldskogius et al.,1999).
1.6) Interferon beta (IFN beta) e expressão de MHC I
Os interferons (IFNs) são uma família de citocinas pró-inflamatórias geralmente produzidas em resposta a infecções virais e podem ser divididas em tipo I e tipo II. Os IFNs do tipo I incluem os IFNs monoméricos α, β, τ e ω, enquanto o IFN do tipo II, dimérico, corresponde ao IFN γ. O IFN alfa apresenta 12 subtipos que são codificados por 14 genes, enquanto todos os outros IFNs são monogênicos (Davidson College, 2000). Os IFNs têm papel imunomodulatório, aumentando a expressão de algumas proteínas e moléculas (Jiang et al., 1995).
O IFN beta é uma proteína globular contendo 166 aminoácidos constituindo cinco hélices alfa, produzidas por um único gene localizado no cromossomo 9. Sua resposta celular é mediada por um receptor específico, compartilhado com o IFN alfa. A síntese de IFN beta é induzida por vírus, ácido nucléico viral, bactérias, micoplasma e protozoários (Arnason, 1996).
Devido a seu papel imunomodulatório, o IFN beta, sob uma forma recombinante não glicosilada IFN beta1b, tem sido utilizado desde 1993 para o tratamento da Esclerose
Múltipla, uma doença neurodegenerativa autoimune desmielinizante que é progressiva (Dhib-Jabult e Cowan, 1993; Brück, 2005; Durelli e Clerico, 2005; Lublin, 2005; Bermel e Rudick, 2007).
O processo de deflagração da Esclerose Múltipla depende de uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia (delayed-type hypersensitivity – DTH), mediada por células T helper 1 (Th1) e pelos macrófagos e microglia ativados por elas (Arnason, 1996). Nesse contexto, os efeitos positivos do tratamento com IFN beta na doença envolve a redução da expressão de MHC II, aumento da síntese de IL-10 (IL-10 ou interleucina-10 diminui a expressão de B7-1, uma proteína estimulante da ativação das células Th1), estimula a entrada dos linfócitos nos linfonodos, inibe receptores para IL-2 (IL-2 ou interleucina-2 estimula a proliferação das células Th1 e 2 e reduz a síntese de TNF (Tumoral Necrosis Factor), linfócito T citotóxico e IFN gama in vitro, os quais são mediadores liberados pelas células Th1 para exterminarem os oligodendrócitos), suprime a liberação H2O2 e O2
-
pelos macrófagos e restaura a função supressora das células para níveis de normalidade (Arnason, 1996).
O conjunto dos efeitos imunomodulatórios do IFN beta beneficia o paciente portador de Esclerose Múltipla de forma a atuar reduzindo a freqüência dos períodos de crise, inibindo a formação de lesões no SNC e retardando a progressão da doença (Tuohy et al., 2000). Apesar de seus comprovados efeitos benéficos, ainda pouco se sabe sobre as reações e interações causadas pela administração dessa citocina sobre o tecido nervoso.
O Interferon beta tem sido testado em condições diferentes da EAE (encefalomielite autoimune experimental), nesse contexto, o IFN beta foi adicionado a co-cultura de neurônios corticais com microglia, observou-se que o tratamento suprimiu em torno de 70% da produção de glutamato e superóxido pela microglia ativa, prevenindo, dessa forma, a morte neuronal induzida por essas células (Jin et al., 2007).
Um outro efeito do IFN beta é o aumento da expressão de moléculas MHC I, TAP e proteínas Lmp (Janeway e Travers, 1997). Estes dois últimos participam do processamento do antígeno para sua apresentação pelo complexo MHC I. A molécula TAP é uma transportadora de peptídeos para o MHC I que se encontra dentro do retículo endoplasmático. Já as proteínas Lmp são componentes da proteosoma que cliva proteínas específicas para a apresentação pelo MHC I (Janeway e Travers, 1997).
O aumento da expressão de MHC I pelo IFN beta em células nervosas foi descrito por alguns autores (Dhib-Jalbut e Cowan, 1993; Jiang et al., 1995). Neste sentido, observou-se o aumento da expressão dos genes para MHC I, até mesmo em células embrionárias e neurônios que normalmente expressam baixos níveis dessa molécula (Jiang et al., 1995). Uma seqüência de pares de base comum aos tipos de IFNs (interferon consensus sequence – ICS) parece ser responsável pela elevação da transcrição dos genes MHC I (Shirayoshi et al., 1988).
Tendo-se em vista que o IFN beta é uma citocina largamente utilizada na clínica e que um dos seus efeitos é aumentar a expressão de moléculas MHC I e estas, por sua vez, apresentam importante papel nos processos de plasticidade e regeneração tanto durante o desenvolvimento do SNC quanto numa situação pós-lesional, a intenção deste trabalho foi estudar as alterações sinápticas e gliais do microambiente medular após axotomia associada ao tratamento com IFN beta. E ainda, através desse estudo, fornecer dados que auxiliem o melhor entendimento do mecanismo de ação do IFN beta no SNC que ainda não são claros. A hipótese inicial que incentivou a realização desse trabalho foi a possibilidade de que o IFN-beta, modulando a expressão de MHC I, influenciaria as respostas sinápticas e astrogliais frente a uma lesão nervosa periférica. Em decorrência dos resultados obtidos em
nossa pesquisa, outra questão foi levantada: qual seria o impacto das alterações provocadas pelo tratamento com IFN beta na regeneração do nervo experimentalmente lesado? Atualmente, já submetemos outro artigo para publicação baseado na pesquisa desenvolvida em nosso laboratório cujo tema foi “Regeneração nervosa periférica após esmagamento do nervo isquiático e tratamento com Interferon beta”.
1.7) Acetato de glatirâmer
O acetato de glatirâmer (AG), conhecido também como Copolímero 1, é um composto sintético de quatro aminoácidos (alanina, lisina, ácido glutâmico e L-tirosina). Devido sua eficácia clínica na supressão da esclerose múltipla, o AG foi aprovado em 1995, sob o nome de Copaxone®, para o tratamento da esclerose múltipla do tipo remitente/recorrente em humanos (Teitelbaum et al., 2004).
O tratamento precoce da esclerose múltipla com agentes imunomodulatórios que atravessam a barreira hemato-encefálica, como o IFN-beta e o AG, traz inúmeros benefícios para os pacientes acometidos pela doença. A eficácia entre os tratamentos com IFN e com AG é semelhante, no entanto, o AG apresenta menos efeitos colaterais (Francis, 2001).
O mecanismo de ação do AG que interfere no processo imunológico que desencadeia a esclerose múltipla ainda não está totalmente esclarecido. Alguns estudos com EAE (Arnon,1996; Aharoni et al., 1997) mostraram que o AG compartilha a composição peptídica e também algumas propriedades físico-químicas com a proteína de mielina básica (MBP, myelin basic protein) utilizada para induzir a EAE e mimetizar os aspectos inflamatórios da Esclerose Múltipla (Jung et al., 2004). Dessa forma, o AG compete com a
MBP no acoplamento com moléculas de MHC II, promovendo, então, o deslocamento de peptídeos da MBP das moléculas apresentadoras de antígenos, inibindo a ativação das células T.
Por outro lado, induz a proliferação de células T helpers 2/3 que secretam grande quantidade de citocinas antiinflamatórias como a IL-10 e o TGF-beta, aumentam a expressão de fatores neurotróficos como o BDNF e diminui a liberação de IFN gama pelas células T (Jung et al., 2004; Aharoni et al., 2005a, 2005b). Esses efeitos também ocorrem nas células nervosas circunjacentes acarretando efeito neuroprotetor e antiinflamatório do AG no SNC.
O conjunto dos efeitos de imunomodulatórios como o AG e o IFN beta beneficiam o paciente com esclerose de forma a atuar reduzindo a freqüência dos períodos de crise, inibindo a formação de lesões no SNC e retardando sua progressão (Arnon, 1996; Tuohy et al., 2000). Contudo, semelhantemente ao tratamento com IFN beta, pouco se sabe sobre as reações e interações do AG sobre o tecido nervoso.
Dado o novo papel da molécula de MHC I no Sistema Nervoso Central relacionado ao mecanismo de comunicação e sinalização entre neurônios e glia, este trabalho analisou as alterações gliais e estruturais dos contatos sinápticos numa situação pós-lesional provocadas pela axotomia e pela indução do aumento da expressão do MHC I. Modificações no microambiente medular, que envolvem principalmente o nível de ativação da glia circunjacente, mostram direta influência na plasticidade das sinapses e na capacidade regenerativa das células lesionadas. O conhecimento de meios de comunicação entre as células nervosas e a possibilidade de modulação dessa comunicação e, consequentemente, das respostas frente a um dano do Sistema Nervoso pode ser, futuramente, um valioso instrumento de interferência nas doenças neurodegenerativas como a Esclerose Múltipla, Esclerose Lateral Amiotrófica, Alzheimer, Parkinson, entre outras.
1- Frente à ação imunomodulatória do interferon beta (IFN beta) sobre a expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I), este trabalho teve por objetivo investigar sua influência no processo de retração dos terminais pré-sinápticos relacionados aos motoneurônios medulares que compõem o nervo isquiático, após uma lesão periférica.
2- Estudar a correlação entre a modulação do MHC I, através do tratamento com IFN beta, e a astrogliose reativa, in vivo após lesão nervosa e in vitro sobre culturas purificadas de astrócitos.
3- Estudar a proliferação e reatividade astrocitária sob tratamento com Acetato de Glatirâmer.
4.1) Procedimentos in vivo
4.1.1) Tratamento dos animais com IFN beta
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA/IB/UNICAMP, processo 793 -1) e todos os experimentos foram realizados de acordo com as instruções do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Foram utilizados 60 camundongos adultos fêmeas (6 a 8 semanas, 20-25 gramas) pertencentes à linhagem C57BL/6J que foram obtidos no Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Os animais foram divididos em três grupos experimentais: grupo 1 (animais submetidos à lesão do nervo isquiático unilateral), grupo 2 (animais submetidos à lesão do nervo isquiático e que receberam tratamento placebo), grupo 3 (animais submetidos à lesão do nervo isquiático e que receberam tratamento com interferon beta, IFN beta). Dentro de cada grupo os animais foram separados em subgrupos com n=5 para as seguintes técnicas: imunohistoquímica, hibridação in situ, western blotting e microscopia eletrônica, sendo que para essa última técnica os cinco animais do grupo 1 foram substituídos por animais sem qualquer lesão nervosa e sem qualquer tratamento.
O IFN beta (betaferon® , Chiron Co, EUA) foi administrado de forma subcutânea na dose de 10.000 UI (Unidades Internacionais) diluídas em 0,20 ml de tampão fosfato (PB, phosfate buffer) estéril pH 7,4 (Yu et al., 1996; Tuohy et al., 2000). As aplicações foram realizadas em dias alternados durante duas semanas. No oitavo dia de tratamento, os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico e, posteriormente, ao final do tratamento, no 15° dia, os mesmos foram submetidos à eutanásia. O mesmo esquema de
tratamento foi mantido para o grupo placebo, sendo, utilizado a administração de 0,20 ml de solução tampão como placebo.
4.1.2) Procedimento cirúrgico: Transecção do nervo isquiático
Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (1:1; 0,10ml/25g, i.p.) e submetidos à transecção do nervo isquiático esquerdo próximo ao forame obturado, com remoção de um segmento de dois milímetros do coto distal do nervo, com o intuito de evitar-se um eventual processo regenerativo (Figura 4).
4.1.3) Eutanásia dos animais
Os animais foram submetidos à eutanásia através de overdose de anestésico e toracotomia. A seguir, os mesmos foram perfundidos transcardiacamente com auxílio de bomba perfusora do tipo peristáltica. Inicialmente, visando a lavagem total dos vasos sanguíneos e órgãos, os animais foram perfundidos com 20 ml de solução salina tamponada e heparinizada (NaCl 0,9% em PB, pH 7,4). A fixação foi realizada pela subseqüente perfusão de 20 ml de solução fixadora, a qual variou conforme a técnica de análise utilizada.
Após fixação, o conjunto, contendo a intumescência lombar e raízes nervosas, foi extraído e dissecado e, posteriormente, imerso na mesma solução fixadora utilizada na perfusão durante 12 horas sob uma temperatura de 4ºC.
4.1.4) Imunohistoquímica
A solução fixadora tamponada utilizada para este procedimento constituiu-se de formaldeído 4% em PB 0,1M, pH 7,4.
Após 12 horas de fixação em temperatura de 4°C, as medulas foram desidratadas em sacarose 20% e incluídas em Tissue-Tek (Miles Inc., USA) e congeladas a -40ºC em isopentano resfriado em nitrogênio líquido. Dos blocos congelados com o material foram obtidos cortes histológicos em criostato (-25°C, Microm, Heidelberg, Germany) com espessura de 12 µm. As secções foram então transferidas para lâminas gelatinizadas previamente climatizadas. As lâminas prontas, contendo os cortes histológicos de medula, foram estocadas a -20ºC até a realização da técnica.
As lâminas foram colocadas em temperatura ambiente para a climatização, sendo então, imersas e lavadas por três vezes em PB 0,01M. Em seguida, as lâminas foram incubadas em câmara úmida com 150 µl de solução de albumina bovina 3% em PB 0,01M, pH 7,4 por 30 minutos. Após este período, as secções foram novamente lavadas em PB 0,01M, pH 7,4 e os anticorpos primários aplicados, com período de incubação de 18 a 24 horas sob temperatura de 4°C. Os anticorpos primários empregados foram: rato anti-MHC I (1:100, Península), coelho anti-sinaptofisina (1:200, Dako), uma porteína localizada no interior de vesículas dentro dos terminais pré-sinápticos é uma forma indireta de se observar a cobertura sináptica em relação aos neurônios, cabra anti-GFAP (1:100, Santa Cruz) e cabra anti-ezrina (1:200, Santa Cruz), ambos marcadores de astrócitos e tais proteínas são aumentadas com a maior reatividade dessas células, e coelho anti-Iba1 (1:1400, Wako), um marcador de microglia.
Em seqüência à primeira incubação, as lâminas foram lavadas em PB 0,01M, pH 7,4 e incubadas com os anticorpos secundários adequados: anti-coelho-CY-2, anti-cabra ou anti-rato-CY-3 (Jackson Lab, USA) por 45 minutos. Os espécimes foram lavados em PB 0,01M, pH 7,4 e montados com lamínula em glicerol/PB 0,01M (3:1). O material foi então observado e documentado utilizando-se sistema confocal (BioRad MRC-1024UV) acoplado a um microscópio invertido de fluorescência (Axiovert 100, Zeiss) utilizando-se os filtros para fluoresceína (CY-2, 488nm) e rodamina (CY-3, 568nm).
Foram capturadas três imagens representativas, com objetiva de 40x, de cada lado (lesado e não lesado) da coluna ventral da medula espinal para cada animal. Para quantificação utilizou-se o software IMAGEJ (versão 1.33u, National Institutes of Health,
USA). Para cada imagem, quantificou-se, de forma sistemática, a densidade integrada de pixels em seis áreas representativas ao redor dos grandes neurônios do núcleo motor lateral da medula espinal. Calculou-se a média aritmética para essas seis medidas. A partir da média da densidade integrada de pixels em cada lado da medula, foi calculada a razão lado lesado/não lesado para cada secção medular analisada. Como cada animal apresentava três secções, ou três imagens, da sua medula lombar, calculou-se, então, a média aritmética das razões para cada animal, e em seguida, a média para o grupo (n=5), sendo os resultados apresentados como média ± erro padrão (EP).
4.1.5) Hibridação in situ
A técnica de hibridação in situ permite além da observação da quantidade, a localização da expressão do RNAm de interesse, dado de extrema importância para o presente trabalho. Nessa técnica utilizou-se material congelado em Tissue-Tek conforme descrito para imunohistoquímica, porém, sem fixação prévia das medulas espinais. Dos blocos congelados com o material, foram obtidos secções transversais de 14 μm em criostato, coletadas em lâminas de vidro silanizadas e estocadas a -22ºC até a utilização.
As sondas complementares ao RNAm das proteínas GFAP (nucleotídeos 7863-7910, número de acesso X02801) e microgrobulina beta-2, componente essencial do complexo de histocompatibilidade principal (nucleotídeos 304-351, número de acesso X01838), foram marcadas em sua terminação 3´com 35S (Amersham; atividade específica de 7-10 x 108 cpm/μg) utilizando-se a enzima terminal deoxinucleotidil transferase (TdT) (Figura 5).
Após a marcação, as sondas quentes foram purificadas por filtração em uma coluna de sílica (GenEluteTM PCR DNA purification kit, Sigma) e hibridizadas às secções por 16 a 18 horas a 42ºC. A mistura de hibridação constituiu-se de formamida 50% (G.T. Baker Chemicals B W, Deventer, The Netherlands), SSC 4X (Tampão cloridrato de sódio-citrato de sódio, SSC 1X = NaCl 0,15 M e citrato de sódio 0,015M), solução de Denhardt 1X, N-laurosylsarcosina 1%, tampão fosfato 0,02M (pH 7,0), sulfato de dextran 10% (Pharmacia), 250 μg de RNAt de fungo (Sigma, St. Louis, MO), 500 μg/ml de DNA de esperma de salmão (Sigma) desnaturado por aquecimento e ditiotreitol 200mM (DTT; LKB, Bromma, Sweden). Após a hibridação, as secções foram lavadas 6 vezes em SSC 1X a 60ºC durante 15 min cada lavagem e, em seguida, desidratadas em etanol. Depois de secas em temperatura ambiente, as lâminas foram mergulhadas em emulsão fotográfica (NTB2; Kodak, Rochester, NY) e estocadas em caixas e isoladas sem qualquer penetração de luz. Após seis semanas em ambiente refrigerado a 4°C, as secções foram reveladas com revelador D-19 (Kodak), coradas com coloração de Nissl e montadas com lamínula. Nas secções controle, uma quantidade vinte vezes superior da sonda fria foi adicionada à mistura de hibridação.
Figura 5: Esquematização da técnica de hibridação in situ. Sondas, marcadas com isótopo radioativo,
complementar ao RNAm alvo e, à direita, uma vista panorâmica de um corte transversal na região lombar da medula espinal corada com corante de Nissl, em destaque (flecha maior em preto) marcação dos RNAs para microglubulina beta-2 no interior e nas circunjancencias dos neurônios motores que compõem o pool do nervo isquiático.
Em seguida as imagens foram documentadas (aumento final linear 400X) utilizando-se uma câmera digital conectada a um microscópio de luz. A análiutilizando-se quantitativa realizada utilizou o software Image Tool (versão 3.0 UTHSCSA, USA). Com este programa, foram contados os grãos cinza. As células cuja marcação foi cinco vezes superior ao fundo foram consideradas positivas. Neste sentido, três secções de cada lado da medula espinal por animal foram analisadas.
4.1.6) Western blotting
Para homogeinização tecidual foram utilizados segmentos de 3 mm da intumescência lombar não fixada, divididas em lados direito e esquerdo através da fissura mediana ventral. Aos espécimes foram adicionados 100 µl de tampão Ripa (150mM NaCl, 50mM Tris pH 8.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 0.5% Na-deoxicolato ácido, 0.1% SDS and 1% Triton X-100) e todas as amostras foram homogeinizadas em sonicador durante 1 min. Os homogeinizados foram centrifugados a 10.000 g durante 10 min a -5°C, em centrífuga refrigerada (BioSpinR, BioAgency). Os sobrenadantes foram coletados e estocados a -22°C.
Nessas amostras, foi realizada a quantificação da concentração total de proteína por Bradfords em leitor de Elisa. Foram utilizadas 40 μg (GFAP) ou 100 μg (MHC I) de proteínas na proporção de 1:1 para eletroforese em gel de 10% de poliacrilamida e gel de empacotamento a 4%. As placas contendo os géis foram montadas em cuba vertical para eletroforese (Bio-Rad) contendo tampão constituído de TRIS 0,25 M, glicina 1,9 M e 1% de SDS, pH 8,7. A corrida foi sempre acompanhada por padrão de peso molecular (Precison Plus Protein Standards, Bio-Rad) e fonte de corrente contínua ajustada em 100 V.
Após a corrida foi feita eletrotransferência das proteínas dos géis para membranas de nitrocelulose (Hybond-ECL, Amersham Biosciences), utilizando-se tampão constituído de TRIS 0,25 mM, glicina 12 5mM e 20% de metanol, pH 8,3, durante 1 h com corrente elétrica de 400 mA. As membranas de nitrocelulose foram, então, bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado diluídos em tampão TBS-T (tampão TRIS, 0,2% tween 20) durante 45 ou 60 min e, posteriormente, incubadas com anticorpo primário overnight em temperatura de 4°C, diluições 1:1000 (coelho anti-GFAP, Dako) em solução de 0,1% de
