RESULTADOS

Os resultados estão apresentados na forma de Artigo Científico que será submetido à publicação na Revista Mycoses (Alemanha) (B1).

ARTIGO ORIGINAL

Molecular characterization of causative agents of Cryptococcosis isolated from patients in a tertiary healthcare in the State of Amazonas.

Ana Karla Lima Freire,¹ Amaury dos Santos Bentes,²Lucilaide Oliveira Santos,¹ Maurício Morishi Ogusku,² Julia Ignez Salem,² Bodo Wanke ^1,3 and João Vicente Braga de Souza^1,2

1 Laboratório de Micologia, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Universidade do Estado do Amazonas, Brasil ² Laboratório de Micobacteriologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Brasil ³Laboratório de Micologia, Fundação Osvaldo Cruz, Brasil.

SUMMARY From the knowledge that there are four molecular groups of Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and four of Cryptococcus gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to identify groups of incidents in different geographic regions worldwide. This effect was investigated what molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated from patients in a tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 2006-2010. The isolates were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite and confirmed by PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using PCR-RFLP targeting the ITS1 rDNA was also evaluated. The presence of specific genes with mating type locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR. It was found that patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV (75.0%) with meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were mostly characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three isolates (5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and the experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C. gattii (VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only two were type a. It found the prevalence of VNI molecular group, the meeting of the VNII molecular group, never before reported for the northern region of Brazil, and suggested that the new methodology for genotyping using as a target gene of rDNA ITS region characterized only the two molecular groups C. gattii.

Key words: Cryptococcus, Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP, ITS5/NL4.

INTRODUÇÃO

A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete os órgãos internos e a pele, decorrente da inalação de propágulos infectantes das espécies patogênicas leveduriformes - Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A doença apresenta-se de forma subaguda ou crônica, afetando tanto os indivíduos imunodeprimidos (aids, principalmente) como os imunocompetentes. A aids é o fator predisponente mais importante para infecção, sendo que, falhas no sistema imunológico, inato e adaptativo, induzido pelo vírus HIV (Human Immunodeficiency Virus) são responsáveis pela disseminação da Criptococose. Uma das características do gênero Cryptococcus é o tropismo meningoencefálico que resulta em elevada mortalidade na ausência de tratamento.^1-3

A patogenicidade do gênero Cryptococcus é determinada, principalmente, pela cápsula polissacarídica, que promove resistência a fagocitose, proteção da levedura e inativação do sistema complemento; e pela produção da enzima fenol-oxidase responsável pelo neurotropismo do fungo.⁴

Tanto C. neoformans quanto C. gattii, apesar de reproduzirem-se assexuadamente, possuem um sistema complementar com dois mating types: a e α. Para que este tipo de reprodução sexuada ocorra é necessário que haja o encontro entre dois mating types opostos. Geneticamente, o locus mating type é a região do genoma fúngico que regula o ciclo sexual e pode ser diferente entre células de mating types opostos.⁵

A espécie C. neoformans possui distribuição geográfica mundial, enquanto que C.

gattii é encontrado com maior freqüência em regiões tropicais e subtropicais. Porém, este cenário foi remodelado em 1998, quando foi observado um surto de infecção por Cryptococcus gattii, no clima temperado da Ilha de Vancouver, British Columbia (BC), Canadá, caracterizado por ferramentas de PCR-Fingerprinting.^6-9

As técnicas moleculares de tipificação PCR-Fingerprinting fundamentam-se na amplificação de produtos de PCR a partir de regiões gênicas que permitem estudos filogenéticos e propiciam discussões nos vários níveis taxonômicos até mesmo de:

espécie, variedade ou linhagem.^10-11 Atualmente, devido aos estudos realizados por

Meyer et al. [12], foram definidos oito grandes grupos moleculares a partir dos protocolos de PCR-Fingerprinting Minissatélite M13 e PCR-RFLP-URA5. Os grupos moleculares correspondentes a C. neoformans são VNI, VNII, VNIII e VNIV, enquanto o C. gattii é subdividido em VGI, VGII e VGIII e VGIV.^12-13

Outra região gênica que vem sendo utilizada na detecção e identificação de patógenos fúngicos por PCR corresponde as regiões do espaço transcrito interno (ITS), com sequências conservadas, encontradas em genes ribossomais.^14-21 O uso da região ITS foi estabelecida em 1999, quando Irobi et al. [15] descreveram um método molecular para identificação de leveduras do gênero Candida.

Especificamente para Cryptococcus spp., os estudos realizados por Santos et al.

[19], utilizando o mesmo alvo e primers, diferenciaram as espécies C. neoformans e C. gattii. Segundo os autores, os resultados demonstram que a região gênica possui potencial para distinção das espécies e talvez até mesmo dos grupos gênicos.¹⁹ Os estudos de tipificação molecular aperfeiçoam o diagnóstico fúngico, elucidam a diversidade genética e corroboram com bases científicas para estudos epidemiológicos globais.^20,22-23 Atualmente, estes estudos também possuem importância na associação de diferentes grupos moleculares às características de virulência, à sensibilidade aos antifúngicos e a terapêutica.^24-25

Investigar os grupos moleculares do gênero Cryptococcus, isolados de pacientes atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do Amazonas, foi o objetivo do presente estudo. Especificamente pretendeu-se: determinar os grupos moleculares por PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pela PCR-RFLP do gene URA5; avaliar a utilização de uma PCR-RFLP tendo como alvo a região ITS do DNAr para caracterizar os grupos moleculares de Cryptococcus; analisar a presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies por PCR; e caracterizar os pacientes quanto ao gênero, idade, infecção pelo HIV e amostra clínica, de onde os agentes foram isolados.

Materiais e Métodos

Microrganismos analisados

Os 60 isolados de Cryptococcus spp. analisados foram obtidos de amostras de pacientes acometidos por Criptococose, internados na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT/HVD), entre março de 2006 e fevereiro de 2010. Foi analisado apenas o isolado obtido da primeira amostra processada de cada paciente, mantido sob refrigeração (4 ^oC), na Coleção de Fungos da FMT/HVD.

Os microrganismos foram reativados em meio de cultivo Ágar Sabouraud a 37 ^oC por 48h. Posteriormente, foram semeados em Caldo Sabouraud a 30 ºC por 48h para obtenção da massa fúngicas a ser utilizada nos estudos de caracterização molecular. Para a caracterização foram utilizadas cepas padrões: WM 148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII), WM 629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 (sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII), WM 161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Estas foram gentilmente cedidas pela coleção de fungos da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-Brasil.

Extração do DNA Genômico

Na extração foi utilizado o kit comercial QIAamp Tissue and Blood, Qiagen, Hilden, Germany). A concentração do DNA Genômico foi verificada por leitura em espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare), no comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância correspondeu a 50 μg/mL) e a razão de pureza foi determinada pela razão entre as absorbâncias a 260 e 280 nm.

Caracterização dos Grupos Moleculares

PCR-Fingerprinting: Foi utilizada a seqüência específica do minissatélite M13 (5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (MEYER et al. [12]). A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 25 μL contendo 50 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada

dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consistiu em 6 min de desnaturação (94^oC); 40 ciclos de 1 min desnaturação à 94ºC, 1 min de anelamento à 50ºC e 2 min de extensão à 72ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72ºC. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60 V.

Gene URA5 RFLP: A PCR do gene URA5 foi conduzida com um volume final de 50 μL, contendo 50 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 50 ng de cada primer URA5 (5´-ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´-TTAAGACCTCTGAAC ACCGTACTC´-3) e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consitiu em 2 min de desnaturação inicial (94^oC); 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94ºC, 30 s de anelamento à 61ºC e 1 min de extensão à 72ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 10 min à 72ºC. O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com SybrGreen e iluminado com luz ultravioleta. Oito microlitros dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de tampão da enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I (10U/ µL) e Hha I (20U/ µL) em incubação por 3 horas ou overnight à 37°C. Os fragmentos de restrição foram analisados por eletroforese em gel de agarose 3% por 5 h a 100V.

Gene ITS RFLP: A PCR do gene espaço transcrito interno (ITS) do DNAr foi conduzida com um volume final de 50 µL. Cada reação continha 50 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, e 50 pmoles de cada primer ITS5 (5´- GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-´3) e NL4 (5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-´3) e 3,0 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consistiu em 6 min de desnaturação inicial (94^oC); 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94°C, 30 s de anelamento à 55°C e 1 min de extensão à 72°C; por fim foi realizada uma extensão final de 10 min à 72°C. O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram

visualizados por eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com SybrGreen e iluminado com luz ultravioleta. Oito microlitros destes produtos de PCR foram digeridos pela enzima de restrição Ddel (10U/ µL) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) em incubação overnight a 37 °C. Os fragmentos de restrição foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, por 3 h a 110V.

Mating Types: O mating type foi determinado por PCR, que foi conduzida para um volume final de 25 µL. Os primers do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'- CTTCACTGCCATCTTCACCA-3') e Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e os primers do tipo a-específicos foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’) e Mat-aR (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’). A reação de PCR continha 20 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). As reações de amplificação foram realizadas de acordo com o procedimento de Chaturvedi et al. [26] modificado. Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, por 3 h a 110 V.

Características dos pacientes

As informações sobre gênero, idade, infecção pelo HIV e tipo de amostra clínica de onde se isolaram os agentes microbianos, foram obtidas das requisições de exames, presentes no Laboratório de Micologia da FMT/HVD.

Dos 60 isolados obtidos, 40 (66,7%) foram caracterizados como C. neoformans, 17 (28,3%) eram C. gattii e apenas 3 (5%) dos isolados não puderam ser caracterizados por nenhum dos protocolos estudados.

As metodologias de PCR-Fingerprinting (Fig. 1) e PCR-RFLP URA-5 (Fig. 2) ilustram que os grupos moleculares encontrados foram VNI (39/60; 65%), VNII (1/60;

1,7%) e VGII (17/60; 28,3%). Estratificando os grupos moleculares incluídos em sua respectiva espécie, tem-se que do total de 40 isolados de C. neoformans, 39 (39/40;

97,5%) eram grupo molecular VNI e 1 (1/40; 2,5%) do VNII; e todos os 17 isolados

da espécie C. gattii foram grupo molecular VGII (17/17; 100%). Foi observada concordância total entre os dados de ambas as metodologias aplicadas.

Conforme indicado na Tabela 1, a correlação entre os grupos moleculares dos isolados, com as características dos pacientes obtidas nas requisições de exames demonstrou a prevalência do sexo masculino (40/60; 66,7%), faixa etária de 16-30 anos (31/60; 51,7%), os isolados obtidos foram derivados principalmente do líquor (43/60; 71,7%) e a maioria do pacientes tinha infecção pelo HIV (45/60; 75%). Ainda em relação à idade, observou-se que C. gattii (VGII) acometeu todos os grupos etários, sendo que 4 (6,7%) casos da doença ocorreram em crianças de 0-15 anos.

Quanto ao achado de VNII, o isolado foi obtido de hemocultura, indivíduo do sexo masculino, 36 anos, portador de HIV, autóctone.

Figura 1. Perfil de PCR-Fingerprinting com o minissatélite M13, das cepas de referência de Cryptococcus spp. 1, 2, 3, 4 e 5 são amostras dos isolados.

Figura 2. Perfil de RFLP-PCR utilizando o gene URA5 e as enzimas de restrição HhaI e Sau96I. 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são isolados.

2200

738

123

pb 1000

600 500

250

M VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV 1 2 3 4 5 6 M VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV 1 2 3 4 5 M

O experimento que visou avaliar a capacidade de descriminar os grupos moleculares através de uma PCR-RFLP da região ITS do DNAr, resultou em três distintos perfis, um dos quais com 60, 120, 500 e 700 pares de base (pb) foi encontrado em todos os quatro grupos moleculares de C. neoformans e em dois C. gattii (VGI e VGIV). Os demais perfis foram observados nos grupos moleculares de C. gattii, sendo um com 60, 300, 400 e 490 pb em VGII e o outro com 60, 110, 150, 300 e 700 pb em VGIII (Fig. 3).

Figura 3. Distinção entre espécimes de Cryptococcus spp, utilizando o par de primers ITS5/NL4 e a digestão feita com a enzima de restrição Ddel.

Quanto à caracterização dos mating types contatou-se que 58 eram do tipo alfa e apenas 2 do tipo a (Fig. 4).

Figura 4. Mating Types dos isolados de Cryptococcus spp, utilizando o par de primers α-MatF/α-MatR, onde o MATα gera um fragmento de 101 pb.

M VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV pb

1000

700

500

250

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pb

1000

250

101

Espécie

Discussão

Cryptococcus neoformans predominou entre os isolados (66,7%), esse agente causa doença quase que exclusivamente entre pacientes imunossuprimidos. De fato, a maioria dos isolados do presente trabalho, foram obtidos a partir de pacientes com aids. Este dado corrobora com a literatura que demonstra que esta espécie é responsável por até 82,3% dos casos de infecção.^13,27 Quanto ao grupo molecular, os resultados obtidos são semelhantes aos estudos anteriores que encontraram perfis característicos de VNI, como tipo molecular predominante.^13,27 Um estudo realizado com isolados Ibero-Americanos, provenientes de nove países, incluindo o Brasil, mostrou a prevalência de VNI dentre as 340 cepas de Cryptococcus neoformans.¹³ Especificamente, das 66 cepas brasileiras três tipos moleculares foram encontrados, sendo VNI predominante, com 82,3%, seguido por VGII (13,6%) e VNII (3,0%), não indicando de quais Estados ou regiões os isolados foram obtidos.¹³ Casali et al. [28], em um importante levantamento sobre Criptococose em amostras da região Sul do Brasil, demonstrou que 105 isolados clínicos e 19 ambientais foram compatíveis com C. neoformans, com predominância do grupo molecular VNI.Em 2008, Trilles et al. [27] realizaram um estudo de verificação da distribuição dos tipos moleculares oriundos de onze Estados do Brasil. Foram analisados 443 isolados, sendo 320 de C. neoformans e 123 de C. gattii. Os 12 isolados do Estado do Amazonas pertenciam aos grupos moleculares VNI e VGII.

No presente estudo, apenas um isolado foi caracterizado como VNII (1,7%).

Este dado está de acordo com a literatura, que vem demonstrando que este é o terceiro grupo molecular com uma frequência de 3 a 5% em análises feitas no Brasil.²⁷ Entretanto, nenhum dos isolados do Estado do Amazonas analisados em estudos anteriores, foram caracterizados como pertencente ao referido grupo molecular.^27,29 Assim sendo, esse é o primeiro relato de existência de C. neoformans do grupo molecular VNII na região Norte do Brasil.

Dentre os 17 isolados de C. gattii, 10 foram obtidos a partir de pacientes sem imunocomprometimento evidente e 7 de pacientes com aids. O C. gattii é considerado um patógeno primário, no entanto, estudos recentes tem demonstrado este causando infecção em imunocomprometidos.^30-33 Apenas o grupo molecular VGII (100%) foi encontrado, sendo esse resultado compatível com recentes estudos que demonstraram ser o referido grupo, o principal causador da doença em

imunocompetentes, em diferentes Estados das regiões Norte e Nordeste do Brasil.

27,29,34

Três isolados ficaram sem caracterização quanto ao grupo molecular. Esta situação pode ser explicada, porque a maioria dos isolados de Cryptococcus são haplóides, no entanto, alguns isolados diplóides ou aneuplóides podem levar a fenótipos instáveis, que podem interferir na genotipagem.³⁵ Estudos são necessários para avaliar este resultado, uma vez que pode se tratar, inclusive, de outras espécies ou subespécies, ainda não classificadas.

O protocolo elaborado para genotipagem (PCR-RFLP ITS1) demonstrou ser adequado somente para a distinção entre os grupos moleculares VGII e VGIII, correspondentes ao Cryptococcus gattii. Para a caracterização dos oito grupos moleculares das espécies, novos estudos precisam ser efetuados utilizando outras regiões gênicas do ITS1 e enzimas de restrição.

O mating type α tem maior prevalência em amostras clínicas^26,36-37, dados esses também encontrado no presente estudo. Kozel sugere que essa maior prevalência do mating type α é devida a vantagens seletivas de maior sobrevivência no meio ambiente e maior virulência.³⁸ A sugestão tem por base, estudos de infecção em camundongos que demonstraram que o, mating type do tipo α é significativamente mais virulento que o a.³⁹

A presente pesquisa constatou ainda que os pacientes do sexo masculino, com idade entre 16-30 anos, portadores do HIV são os principais acometidos por Criptococose no Estado do Amazonas-Brasil. A literatura descreve o gênero masculino como o mais acometido pela infecção, bem como nesta faixa etária, fato esse atribuído à epidemiologia da aids^37,40 e, mais recentemente, tem-se que as mulheres obtém proteção contra a Criptococose gerada por seus próprios hormônios.^36,41

O achado de C. gattii como agente de meningite em crianças de 0-15 anos não portadoras de HIV, está em de acordo com o exposto na literatura.31,34,42-43

No Brasil, estudo realizado no Estado do Amazonas, região Norte, demonstrou que a frequência da Criptococose infantil entre os anos de 1988-1998, representou uma significante fração dentre os casos reportados (33%, n=75).⁴² Também na região Norte, no Estado do Pará em um período de sete anos, 24% (n=78) dos pacientes com Criptococose, hospitalizados, eram crianças.⁴³ Esta alta frequência de meningite criptocócica continuou sendo observada de 2003-2007 (8/43; 18,6%)

ainda no mesmo Estado.³⁴ Já no Piauí e Maranhão, Estados da região Nordeste, 21% (n=257) eram casos de Criptococose na infância.⁴⁴ A região Norte abrange uma grande área de floresta Amazônica e mais estudos sobre a etiopatogenia da Criptococose em humanos, e mais especificamente em crianças, bem como seus perfis moleculares, precisam ser executados, uma vez que os dados de infecções infantis são preocupantes.³⁴

O líquor foi o principal material biológico de isolamento fúngico, isto pode ser explicado, porque a maioria dos pacientes (dependendo da cepa infectante, do estado imunológico do paciente e do quantidade do inóculo inalado) apresenta disseminação criptocócica e neurocriptococose. Essa advém do fato do gênero Cryptococcus produzir fenol-oxidase que converte uma grande variedade de substratos hidroxibenzóicos, incluindo as catecolaminas, em um pigmento marrom ou preto, conhecido como melanina, a qual funciona como fator de virulência do fungo para sua proliferação no organismo do hospedeiro.^30,45 Como o líquor é rico em substratos fenólicos, tem-se a explicação para o neurotropismo do Cryptococcus.³⁰ Os resultados obtidos dão suporte à literatura, pois demonstram a alta freqüência da retrovirose e alta prevalência do isolamento do agente em líquido cefalorraquidiano. Em estudo recente no Estado do Amazonas, obteve-se a alta prevalência de indivíduos infectados pelo HIV e que desenvolveram co-infecção criptocócica (29/40; 72%).²⁹ Sendo a Criptococose umas das principais causas de morbimortalidade em pacientes com aids. Em muitos indivíduos, essa micose é a primeira indicação da evolução da infecção pelo vírus para o quadro de aids.⁴⁶

Conclusivamente, a Criptococose no Estado do Amazonas mantem-se prevalente em portadores do vírus HIV, tendo o C. neoformans do grupo molecular VNI como principal agente etiológico. Entretanto, tem-se o encontro do grupo molecular VNII nunca antes relatado para a Região Norte do Brasil. Além do exposto, constatou-se que a nova metodologia sugerida para genotipagem utilizando como gene alvo a região ITS do DNAr caracterizou somente os 2 grupos moleculares de C. gattii.

Agradecimentos

À Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pelo suporte, ao Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia pela permissão e cedência do espaço para a realização dos ensaios, aos funcionários do Laboratório de Micobacteriologia (INPA) pelo pronto auxílio, ao INCQS-RJ pelo envio das cepas fúngicas de referência, à CAPES pelo apoio financeiro e à FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital N.014/2006 PPSUS 2006.

Referências

1 Kwon-Chung KJ, Hill WB, Bennett JE. New, special stain for histopathological diagnosis of cryptococcosis. J Clin Microbiol 1981; 13: 383-387.

2 Py EA, Aloé M, Burlamaqui L, Guasti S, Monerat PJT. Relato de cinco casos de meningite criptocócica em crianças com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Arquiv Bras Pediat 1997; 4: 15-20.

3 Yamamoto Y, Kohno S, Koga H et al. Random amplified polymorphic DNA analysis of clinically and environmentally isolated Cryptococcus neoformans in Nagasaki. J Clin Microbiol 1995; 33: 3328–3332.

4 Diamond RD. Cryptococcus neoformans. In: Mandell, G.L., Bennett, J. E. and Dolin, R. (eds.) Principles and practice of infectious diseases. New York:

Churchill Livingstone, 1995; 2331-2340.

5 Bovers M, Hagen F, Boekhout T. Diversity of the Cryptococcus neoformans-Cryptococcus gattii species complex. Rev Iberoam Micol 2008; 25: S4-12.

6 Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL et al. A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia,

No documento UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL (páginas 41-57)