UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA UNIDADE

TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS

ANA KARLA LIMA FREIRE

MANAUS 2011

ANA KARLA LIMA FREIRE

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA UNIDADE

TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza Co-orientador: Prof. Dr. Bodo Wanke

MANAUS 2011

.

FICHA CATALOGRÁFICA

Catalogação na Fonte: Auxiliadora Queiroz Batista – Bibliotecária - CRB11/ 596.

F866c Freire, Ana Karla Lima

. Caracterização molecular de agentes causadores de Criptococose Isolados de pacientes atendidos em uma unidade terciária de saúde do Estado do Amazonas / Ana Karla Lima Freire. – Manaus: UEA, 2011.

62 fl. : il ; 30 cm

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Profº. Dr. João Vicente Braga de Souza.

Co-orientador: Prof°. Dr. Bodo Wanke.

1. Cryptococcus spp. 2. Genotipagem. 3. PCR-Fingerprinting.

4. URA5-RFLP. 5. ITS5/NL. I. Título.

CDU 616.9

FOLHA DE JULGAMENTO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA

UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS

ANA KARLA LIMA FREIRE

“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca Julgadora:

______________________________________

Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.

Presidente

______________________________________

Prof^a. Ani Beatriz Jackisch Matsuura, Dr^a. Membro

______________________________________

Prof^a. Maria das Graças Vale Barbosa, Dr^a. Membro

AGRADECIMENTOS A Deus pelo sopro da vida e pelos planos, dEle, cumpridos.

Aos meus pais queridos, pelo imenso amor, paciência, incentivo e suporte em todos os momentos.

Ao meu noivo por todo amor, compreensão, pelas orações que nunca cessam e por fazer tudo parecer mais simples.

Ao meu orientador, Dr. João Vicente Braga de Souza, pela oportunidade, aprendizado, idéias, paciência, amizade e pela chance de conhecer essa grande pessoa.

Ao meu co-orientador, Dr. Bodo Wanke pela chance de compartilhar de sua experiência, conhecimento e colaboração.

À Dra. Júlia Ignez Salem pela imensa gentileza na realização e otimização deste trabalho, com suas críticas e sugestões.

Às minhas amigas Ivanete Sampaio e Mirlane Santos, pelos ensinamentos sobre os procedimentos.

Aos funcionários dos Laboratório de Micobacteriologia e Micologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, pelo pronto auxílio.

Ao Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, onde tudo começou.

À Universidade do Estado do Amazonas pela qualificação profissional oferecida.

À Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela oportunidade concedida da utilização das instalações e materiais do Laboratório de Micologia.

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela cedência do espaço nos testes de biologia molecular.

Ao INCQS-RJ pelo envio das cepas fúngicas de referência para a realização desta pesquisa.

À Suframa e Fundação Muraki pelo apoio na estrutura deste Programa de Pós- Graduação.

À CAPES pelo auxílio financeiro.

À FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital n°.014/2006 PPSUS 2006.

RESUMO

A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete órgãos profundos e a pele, decorrente da aquisição de propágulos infectantes por via inalatória das espécies de leveduras patogênicas pertencente à classe dos Basidiomycetes e ao gênero Cryptococcus, afetando pacientes imunodeprimidos ou imunocompetentes. Embora a porta de entrada no hospedeiro humano seja o pulmão, o fungo apresenta tropismo pelo Sistema Nervoso Central (SNC), onde causa quadro grave de meningoencefalite. A partir do conhecimento de que existem 4 grupos moleculares de Cryptococcus neoformans (VNI e VNII, VNIII e VNIV) e 4 de C. gattii (VGI e VGII, VGIII e VGIV) vem se tornando importante a identificação dos grupos incidentes em diferentes regiões geográficas do mundo. Neste sentido foi investigado quais os tipos moleculares de 60 cultivos de Cryptococcus spp., isolados de pacientes atendidos em uma unidade terciária do Estado do Amazonas, entre 2006-2010. Os isolados foram caracterizados pela PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e confirmados por PCR-RFLP do gene URA5. Avaliou-se também um protocolo experimental de PCR-RFLP utilizando como alvo a região ITS do DNAr. A presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies, foi analisada por PCR. Constatou-se que os pacientes em sua maioria são do sexo masculino (66,7%), com idade entre 16-30 anos (51,7%), portadores de HIV (75%) que apresentaram meningite (71,7%), cujos isolados de C.

neoformans (66,7%) em sua maioria foram caracterizados como grupo molecular VNI (97,5%) e os de C. gattii como VGII (100%). Três isolados (5,0%) não puderam ser caracterizados por nenhum dos protocolos estudados e o protocolo experimental avaliado apenas discriminou 2 grupos moleculares de C. gattii (VGII e VGIII). Quanto aos mating types, 58 isolados foram do tipo α e apenas 2 foram do tipo a. C.

neoformans do grupo molecular VNI é o principal agente etiológico. Entretanto, tem- se o encontro do grupo molecular VNII nunca antes relatado para a Região Norte do Brasil. Além do exposto, constatou-se que a nova metodologia sugerida para genotipagem utilizando como gene alvo a região ITS do DNAr caracterizou somente os 2 grupos moleculares de C. gattii.

Palavras-Chaves: Cryptococcus spp.; Genotipagem; PCR-Fingerprinting M13;

URA5-RFLP; ITS5/NL4

ABSTRACT

Cryptococcosis is a systemic mycosis that affects deep organs and skin, resulting from the acquisition of infective propagules inhalation of pathogenic yeast species belonging to the class of Basidiomycetes and the genus Cryptococcus, affecting immunocompetent or immunocompromised patients. Althought the entrance to the human host is the lung, the fungus has tropism for Central Nervous System (CNS), where it causes severe meningoencephalitis. From the knowledge that there are four molecular groups of Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and four of Cryptococcus gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to identify groups of incidents in different geographic regions worldwide. This effect was investigated what molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated from patients in a tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 2006- 2010. The isolates were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite and confirmed by PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using PCR-RFLP targeting the ITS rDNA was also evaluated. The presence of specific genes with mating type locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR.

It was found that patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV (75.0%) with meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were mostly characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three isolates (5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and the experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C.

gattii (VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only two were type a. C. neoformans VNI molecular group was the main etiologic agent.

However, there is the meeting of the VNII molecular group has never been reported for the northern region of Brazil. Besides the above, it was found that the new methodology suggested for genotyping using as a target gene of rDNA ITS region characterized only two groups of C. gattii.

Key words: Cryptococcus spp., Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP, ITS5/NL4.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Imagem do ciclo de infecção por Cryptococcus spp... 14

Figura 2. Imagem de leveduras do Gênero Cryptococcus... 19

Figura 3. Imagem do cultivo de Cryptococcus em Ágar Sabouraud... 19

Figura 4. Imagem do cultivo de Cryptococcus em Ágar Níger com produção de melanina... 20

Figura 5. Imagem de cultivo de Cryptococcus em CGB, amarelo, C. neoformans e azul, C. gattii... 20 Figura 6. Imagem da distribuição dos tipos moleculares de acordo com os Estados Brasileiros incluídos na análise... 25

Figura 7. Fluxograma da Reativação e Isolamento Fúngico... 33

Figura 8. Fluxograma da Metodologia de Extração do DNA genômico... 34

Figura 9. Fluxograma da PCR-Fingerprinting do Minissatélite M13... 35

Figura 10. Fluxograma da PCR-RFLP do gene URA5... 36

Figura 11. Fluxograma da PCR dos mating types... 37

Figura 12. Fluxograma da PCR-RFLP da região ITS do DNAr... 38

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fatores de Virulência das espécies patogênicas de Cryptococcus... 18 Tabela 2. Lista de cepas de referência utilizadas neste estudo, incluindo informações gerais, sorotipo (ST), mating type (MAT), tipo molecular (TM)... 29

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

µm Microlitros

BC British Columbia

CEP Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos CGB Canavanina-glicina-azul de bromotimol

CR3 Complement Receptor Type 3

DNA Desoxirribonucleic Acid

dNTP Desoxirribonucleosídeo Trifosfato EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

EUA Estados Unidos da América

FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas FMT-AM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

H Hora

HCl Ácido Clorídrico

HIV Human Immunodeficiency Virus

INPA Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia ITS Espaço Interno Transcrito

ITS5 Espaço Interno Transcrito 5

KCl Cloreto de Potássio

LCR Líquido Cefalorraquidiano

Mg Miligrama

MgCl2 Cloreto de Magnésio

Min Minuto

mL Mililitro

Nm Nanômetro

PCR Polymerase Chain Reaction

pH Potencial Hidrogeniônico

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

Rpm Rotações por Minuto

S Segundo

SNC Sistema Nervoso Central

Tris 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol

U Unidade

UFC Unidade Formadora de Colônia

URA5 Urotidina Monofosfato Pirofosforilase 5

UV Ultravioleta

V Volts

VGI, VGII, VGIII, VGIV Variedade gattii do tipo I, II, III e IV

VNI,VNII, VNIII, VN IV Variedade neoformans do tipo I, II, III e IV.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO... 12

1.1 O Microrganismo... 12

1.2 A doença... 13

1.3 Fatores de Virulência... 16

1.4 O Diagnóstico Laboratorial... 18

1.5 A Epidemiologia e Grupos Moleculares... 21

2. OBJETIVOS... 27

2.1 Geral... 27

2.2 Específicos... 27

3. MATERIAIS E MÉTODOS... 28

3.1 Modelo de Estudo... 28

3.2 Universo de Estudo... 28

3.3 Procedimentos... 29

3.4 Características dos Pacientes... 39

4. RESULTADOS... 40

5. CONCLUSÃO... 56

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 57

7. ANEXOS... 64

1 INTRODUÇÃO

1.1 O Microrganismo

Os estudos com Cryptococcus tiveram início em 1894, na Itália, quando Sanfelice registrou o primeiro isolado deste fungo a partir de suco de pêssego, chamando-o de Saccharomyces neoformans¹. No mesmo ano, foi relatada uma infecção pela levedura em um paciente alemão, sendo a referida levedura chamada de Saccharomyces hominis. Entretanto, observações posteriores demonstraram a ausência dos ascóporos característicos do gênero Saccharomyces ².

Atualmente, esta levedura capsulada é taxonomicamente descrita como fazendo parte da Classe Basidiomycetes, Família Cryptococcaceae e gênero Cryptococcus³. O gênero engloba mais de 50 espécies que se caracterizam morfologicamente por se apresentarem na forma de levedura esférica, que variam de 4 a 10 µm de diâmetro, possuem cápsula e reproduzem-se assexuadamente por brotamento⁴.

As leveduras das espécies de Cryptococcus podem formar hifas verdadeiras durante reprodução sexuada, mas não são considerados fungos dimórficos verdadeiros, porque a fase filamentosa é apenas transitória, surgido após fusão entre dois mating types: a e α resultando no estágio sexuado do fungo denominado Filobasidiella spp⁵. Como patógenos, apresentam-se como intracelulares facultativos, os quais fisiologicamente são capazes de tolerar desde baixas temperaturas ambientais, à temperatura corpórea dos mamíferos (37°C)⁶.

As espécies patogênicas do gênero Cryptococcus atualmente são classificadas em duas: C. neoformans e C. gattii. Passoni (1999) descreveu que C.

neoformans tem a capacidade de colonizar a mucosa do sistema respiratório de pombos (Columba spp.), sem causar doença, comportando-se como endosaprófitas naturais destas aves. A peculiar adaptação de pombos aos centros urbanos proporciona o isolamento do fungo em fontes ambientais, inclusive em poeira domiciliar⁷. Já C. gattii é encontrado isolado em espécies de árvores, principalmente Eucalyptus camaldulensis⁸.

As duas espécies foram classificadas em cinco sorotipos: Cryptococcus neoformans (sorotipos A, D e o híbrido AD) de distribuição cosmopolita e encontrada com facilidade em hábitat de pombos (Columba spp.), e Cryptococcus gattii (sorotipos B e C) predominante em regiões tropicais e subtropicais e originalmente encontrado em restos vegetais de Eucalyptus camaldulensis ^9,10,11,12.

Os sorotipos B e C (C. gattii) são hábeis em infectar e causar doenças em hospedeiros imunocompetentes, enquanto que os sorotipos A e D (C. neoformans) ocorrem em pacientes imunocomprometidos, principalmente naqueles infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ¹³.

Litvintseva et al. (2007)¹⁴ explicam que o sorotipo AD é um híbrido das variedades A e D. Ao contrário do que se pensava, a infecção por esse sorotipo parece ser comum. Em estudo, realizado na América do Norte, foi relatado que 7,5%

dos isolados ambientais eram sorotipo AD¹⁴. Na Europa, Dromer et al. (2007)¹⁵ observaram que 30% dos isolados pertenciam também a esse sorotipo. No Brasil a presença do sorotipo AD foi relatada por Nishikawa et al. (2003)¹¹, isolado tanto em amostras de origem clínica como ambientais.

1.2 A Doença

A Criptococose, antigamente conhecida como torulose ou blastomicose Européia, é uma micose sistêmica que acomete órgãos internos e a pele¹⁴.

O primeiro caso de infecção humana provocada por C. neoformans foi detectado há pouco mais de 100 anos por Busse e Buschke na Alemanha.

Entretanto, a Criptococose começou a receber atenção especial a partir da década de 80, com o aumento da população imunocomprometida decorrente da pandemia de HIV e uso de agentes imunossupressores, para a terapia do câncer ou transplantes de órgãos. Por esta razão, a Criptococose oportunista transformou-se em uma infecção relativamente comum neste começo de milênio¹⁶.

Quanto à patogenia, a doença caracteriza-se pela inalação de basidiósporos ou leveduras desidratadas infectantes que chegam até os espaços alveolares. A

progressão da infecção para as formas sintomáticas depende da competência imunológica do indivíduo, da virulência do isolado e da quantidade do inóculo fúngico inalado (Figura 1)¹⁷.

Figura 1. Imagem do ciclo de infecção por Cryptococcus spp. Fonte:

www.bmolchem.wisc.edu

Mecanismos de defesa do organismo, através da ativação de macrófagos, normalmente são suficientes para uma satisfatória e protetora resposta do hospedeiro. Entretanto, os fatores de virulência podem tornar a resposta imunológica ineficaz, permitindo a infecção pulmonar, bem como a subseqüente disseminação do fungo para outros órgãos e sistemas, em especial ao Sistema Nervoso Central (SNC)^18,19.

Uma maior susceptibilidade de infecção pelo fungo é manifestada por alterações da imunidade celular ou humoral. A infecção pulmonar é o sintoma preliminar da aquisição da Criptococose, resultando em doença pulmonar progressiva ou foco pulmonar assintomático, que pode conduzir à disseminação hematogênica e mais freqüentemente à infecção do SNC ou comprometimento cutâneo. A infiltração nodular pulmonar é o achado clínico mais freqüente da Criptococose pulmonar²⁰.

O neurotropismo de C. neoformans vem sendo associado com sua capacidade em utilizar as catecolaminas (adrenalina, noradrenalina e dopamina) como substratos necessários ao seu desenvolvimento. Isto justifica o fato de que as

Á

Árrvvoorreess oouu

OcOcooss EExxcrcreettaass E

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I

Innaallaaççããoo PuPullmmõeõess

IInnssttaallaaççããoo nnooss a

allvvééoollooss

D

Diisssseemmiinnaaççããoo ppaarraa oo SiSisstteemmaa NNeerrvvoossoo

CCuullttuurraa PoPossiittiivvaa

áreas cerebrais ricas em catecolaminas são as mais afetadas pelo Cryptococcus durante a meningoencefalite, quadro prevalente da doença^17,21.

O quadro de meningoencefalite varia de acordo com o quadro geral de saúde dos indivíduos acometidos. Em pacientes imunocomprometidos, as manifestações clínicas são agudas e predominantes, e em pacientes sem comprometimento imunológico tendem a ser mais crônicas²².

A Criptococose é a infecção fúngica mais frequente e fatal em pacientes com aids e a terceira causa de doença oportunista do SNC. Estudos multicêntricos internacionais demonstraram que a taxa de mortalidade dos pacientes acometidos de HIV aproximou-se de 69%, sendo que a maioria dos pacientes que foram ao óbito, ocorreu nos primeiros 30 dias de co-infecção²³.Sua prevalência varia de 2,9 a 13,3% representando importante causa de mortalidade na aids, apesar do tratamento específico^23,24.

Em indivíduos hígidos, as respostas imunológicas celular e humoral delimitam a contaminação pela espécie C. neoformans, caracterizando um quadro assintomático da doença. A resistência da infecção depende da sensibilização prévia de linfócitos e posterior ativação de macrófagos e neutrófilos, além de uma resposta humoral mediada por anticorpos opsonizantes²⁵.

Quanto ao perfil característico dos indivíduos acometidos por Criptococose, estudos prospectivos realizados na região Sudeste do Brasil, no período entre 1998 e 2003 relataram a presença de 96 pacientes com diagnóstico clínico-laboratorial de Criptococose, sendo que destes a maior predominância (81,3%) foi de pacientes portadores de aids²⁶.

Em recentes estudos brasileiros sobre o perfil epidemiológico dos pacientes acometidos com Criptococose por C. neoformans, constatou-se que a maioria dos pacientes era do sexo masculino, com faixa etária de 30 a 39 anos e portadores de

HIV^27,28 e que casos de infeçcão por C. gattii acometia pacientes sem

imunocomprometimento evidente²⁹.

1.3 Fatores de Virulência

Os fatores de virulência estão abaixo e relacionados na Tabela 1.

1.3.1 A cápsula

A patogenicidade é determinada pela cápsula do Cryptococcus, composta principalmente pelo polissacarídeo glicuronoxilmanana⁴. Este fator de virulência impede a fagocitose e ativação do sistema complemento¹⁶.O processo fagocítico é impelido, uma vez que o potencial zeta negativo dos componentes capsulares decorre, e isto provoca repulsão eletrostática entre o fungo e os macrófagos³⁰.

No meio ambiente, a cápsula possibilita a sobrevivência em condições de baixa umidade, protegendo a levedura contra alta desidratação³¹.

A cápsula criptocócica fornece uma barreira física em torno da parede fúngica e modula respostas imunes do hospedeiro em diversos níveis. O material capsular está relacionado tanto com alterações na eficiência do processo fagocítico fúngico, quanto com a resistência à destruição da parede celular pelos efeitos imunes, redução na produção de citocinas pró-inflamatórias e a apresentação dos antígenos aos linfócitos T. Este fator de virulência, ainda interfere, no funcionamento dos componentes do complemento impossibilitando a ligação aos receptores CR3 dos leucócitos o que prejudica a resposta humoral^30,32.

1.3.2 Lacase e Melanina

As colônias de Cryptococcus, quando semeadas em Ágar Níger apresentam coloração marrom, isso foi observado pela primeira vez, em 1962 por Staib³³. Porém, o mecanismo pelo qual ocorria a produção desse pigmento, no entanto, não havia sido estabelecido ainda^33,34. Todavia, desde então, a detecção da melanina em meio de cultura tem sido utilizada para isolamento, purificação e identificação desse microrganismo em laboratórios de análises clínicas⁴.

A melanina é um fator de virulência muito estudado no gênero Cryptococcus.

Esta é um pigmento carregado negativamente, que resiste à degradação em pH

ácido⁴. Ela é responsável pela proteção da célula fúngicas, contra a ação fagocitária dos macrófagos, atuando como antioxidante, além disso, inibe a produção de TNF- α, citocina importante para desencadeamento da resposta imune celular³⁵.

Tanto C. neoformans quanto C. gattii secretam a lacase, enzima dependente de cobre, substância que catalisa a formação de melanina, quando estes microrganismos crescem em substratos contendo compostos difenólicos⁵, incluindo as catecolaminas⁴.

Um estudo de interrupção gênica revelou que cepas selvagens de Cryptococcus são mais virulentas que seus mutantes albinos²¹, portanto a melanina é importante na patogenicidade da Criptococose.

1.3.3 Mating Types

Cryptococcus spp. possuem dois tipos sexuais ou mating types (MAT) complementares: MATa e MATα³.

C. neoformans e C. gattii se reproduzem assexuadamente por brotamento, estando a grande maioria dos isolados clínicos e ambientais presentes na forma anamórfica haplóide. Apesar disso, essa levedura pode se reproduzir sexuadamente, correspondendo ao estado perfeito, sendo este estágio denominado de Filobasidiella neoformans e F. bacillispora, correspondente aos anamorfos C.

neoformans e C. gattii, respectivamente^3,36,37.

O MATα apresenta maior prevalência tanto em amostras clínicas como ambientais^2,4,38. Essa maior prevalência do mating type α sugere que ele tenha vantagem seletiva permitindo maior sobrevivência do fungo no meio ambiente e também maior virulência³⁹.

Tabela 1. Fatores de Virulência das espécies patogênicas de Cryptococcus.

Fator de

Virulência Funções no Ambiente Funções na Patogênese

Cápsula

Prevenção da dessecação

Proteção contra predadores ameboides

Anti-fagocítico Imunomodulador

Lacase Degradação da Lignina

Proteção contra luz ultravioleta

Interferência no stress oxidativo

Resistência à morte oxidativa

Melanina Tolerância ao calor e frio Redução da susceptibilidade à degradação enzimática

Antifagocítico Imunomodulador

Fosfolipase Função Nutricional (ainda indefinida) Crescimento intracelular

Proteases Função Nutricional Dano Tecidual

Urease Captação de Nitrogênio Crescimento intracelular

Mating Type Reprodução Sexual Regulação dos Fatores de Virulência

Fonte: Casadevall et al., 2003³⁰.

1.4 O Diagnóstico Laboratorial

As leveduras de Cryptococcus spp. podem ser visualizadas facilmente em espécimes clínicos como líquido cefalorraquidiano (LCR), escarro, lavado brônquico, urina e outros tipos de secreções ou fluidos, por microscopia óptica contendo tinta

da China. Nesta coloração, visualiza-se a levedura no interior da cápsula (Figura 2), uma vez que esta contrasta com a tinta⁴⁰.

Figura 2. Imagem de leveduras do Gênero Cryptococcus. Fonte:

www.adam.com

A microscopia é positiva quando há 10³ ou 10⁴ UFC/mL de células fúngicas.

O diagnóstico laboratorial através do teste da tinta da China tem sensibilidade de 70- 90% dos pacientes com aids, porém cai para somente 50% em pacientes imunocompetentes¹⁷.

C. neoformans pode ser isolado em meios de cultivo que contenham uma fonte de carbono, nitrogênio e oxigênio⁴¹, produzindo colônias brancas mucóides (dependendo da espessura da cápsula), usualmente após 48 e 72 h (Figura 3).

Figura 3. Imagem de cultivo de Cryptococcus em Ágar Sabouraud.

Fonte: Acervo Pessoal

As espécies do gênero Cryptococcus tem atividade de urease. A patogenicidade de C. neoformans está relacionada com a sua capacidade de crescer a 37 ºC. No entanto, a temperatura ótima de crescimento está entre 30-

35ºC. Em meios de cultura como o ágar níger, a presença de compostos difenólicos propicia a produção de lacase que leva à formação de melanina (Figura 4), que pode ser observada pelo aparecimento de coloração marrom nas colônias³³.

Figura 4. Imagem de cultivo de Cryptococcus em Ágar Níger com produção de melanina. Fonte: Acervo Pessoal

Alguns sorotipos de C. neoformans podem ser diferenciados pela reação de coloração quando cultivados em meio ágar CGB, pois C. gattii é resistente à canavanina e utiliza a glicina como fonte de Carbono e Nitrogênio, modificando o pH do meio, deixando-o alcalino. O azul de bromotimol funciona como um indicador da mudança de pH, modificando a coloração do meio, de amarelo para azul, caracterizando C. gattii, diferenciando de C. neoformans (Figura 5)⁴².

Figura 5. Imagem de cultivo de Cryptococcus em CGB, amarelo, C. neoformans e azul, C. gattii. Fonte: Severo LC. In: Consenso em Criptococose, 2008⁴³.

Inúmeras técnicas baseadas na análise do DNA têm sido utilizadas para estudos de detecção, caracterização, filogenia e epidemiologia do gênero Cryptococcus. Essas técnicas incluem análises RFLP (fragmentos de DNA gerados

por enzimas de restrição). Em 1997, ao utilizar esta metodologia, Franzot et al.⁴⁴ ao analisarem a diversidade genética de isolados C. neoformans do Brasil e da cidade de Nova York (EUA), através do perfil de RFLP da seqüência do gene URA5, sugeriram uma dispersão global de certos isolados patogênicos.

1.5 A Epidemiologia e Grupos Moleculares

Cryptococcus neoformans possui distribuição geográfica mundial, freqüentemente associa-se a habitat de aves, excretas secas, ricas em fontes de nitrogênio, como uréia e creatinina. Uma vez que tenha condições favoráveis para o seu crescimento abundante, esta levedura forma microfocos, notadamente em centros urbanos e relacionados a pombos⁴⁵.

C. neoformans é mais comum no continente europeu, embora tenha distribuição mundial, onde mais de 30% dos casos da doença são causados por essa espécie². Países como Suíça, Alemanha, Áustria⁴⁶ e França⁴⁷ já informaram sobre seu isolamento.

A Criptococose neoformans ocorre como primeira manifestação oportunista em cerca de 4,4% dos casos de aids no Brasil⁴⁸. Esta micose sistêmica associada à aids predomina nas regiões, Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil ^49,50,51. Por outro lado, Cryptococcus neoformans é capaz de causar infecção fatal em indivíduos aparentemente normais⁵².

Todavia, esta espécie já foi encontrada no Brasil, sendo isolada de árvores em diferentes localidades^53,54,55: Rio de Janeiro (RJ), em Teresina (PI), em Boa Vista e Ilha de Maracá (RR), no interior do Amazonas e na Cidade de São Paulo⁵⁶.

Espécies de C. neoformans são isoladas com maior freqüência na Europa e América do Sul. No Brasil, por ser área endêmica desta espécie, há um grande interesse em se determinar os genótipos dos isolados deste fungo^3,49,54,57.

A Criptococose por Cryptococcus gattii ocorre na América Latina, em países como Argentina, Brasil, Venezuela¹¹, Peru e Colômbia^58,59. No Brasil, principalmente nas regiões Norte e Nordeste, estudos clínico-epidemiológicos vem mostrando a

importância dessa espécie que acomente o SNC de adultos jovens e crianças, com alta letalidade⁶⁰. Sabe-se que Criptococose gattii pode ocorrer em áreas de clima temperado e apresentar-se sob forma de surtos. Em áreas, onde há alta pressão endêmica por C. gattii, observa-se significativa associação deste agente com aids⁵⁰.

Em estudo prévio, na Região Norte do Brasil, realizado na Fundação de Medicina Tropical do Estado do Amazonas, Santos (2000)⁶¹ relatou que a frequência da Criptococose infantil entre os anos de 1988-1998, representou uma significante fração dentre os casos reportados (33%, n=75), dado este realmente preocupante, frente à vasta região de florestas, um dos hábitats deste fungo.

Um recente surto de infecção por Cryptococcus gattii, no clima temperado da Ilha de Vancouver, British Columbia (BC), Canadá, deflagrou o início e a colaboração de pesquisadores no esforço de investigação deste distúrbio em relação às descrições geográficas, demográficas e microbiológicas, referenciando as características clínicas dos casos de Criptococose, bem como identificar possíveis reservas ambientais responsáveis pelo surto. Como a maioria dos pacientes eram imunocompetentes, a infecção criptocócica foi listada como doença notificável em BC, Canadá⁶².

A partir de então, muitos questionamentos foram surgindo em relação à virulência da espécie de Cryptococcus que gerou a epidemia em BC. Por isso, ferramentas moleculares foram utilizadas para caracterizar o genótipo envolvido no surto. Os estudos genotípicos utilizando PCR-Fingerprinting e PCR-RFLP realizados por Meyer et al. (1999)⁶³ conseguiram distinguir oito genótipos, sendo 4 de C.

neoformans (VNI e VNII, VNIII e VNIV) e 4 de C. gattii (VGI e VGII, VGIII e VGIV).

Após as análises que reproduziram a metodologia de Meyer et al. (1999)⁶³, um estudo posterior constatou que VGII era o grupo molecular causador do surto na Ilha de Vancouver⁶².

As técnicas moleculares de tipificação incluem a PCR-Fingerprinting onde um lócus de polimorfismo no DNA é amplificado gerando diferentes fragmentos que geram diferentes padrões de bandas de DNA e podem ser relacionados com uma espécie, variedade ou linhagem. A técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) é um fingerprinting que utiliza sequências arbitrárias que geram

diferentes padrões de amplificação, os quais permitem no caso de Cryptococcus spp. discriminar grupos moleculares e também são utilizados em estudos epidemiológicos^64,65.

A metodologia proposta por Meyer et al. (1999)⁶³ propuseram a tipagem molecular de Cryptococcus spp. através do PCR-Fingerprinting que utilizou como primer uma seqüência obtida do “núcleo” do fago M13 para detectar seqüências minissatélites hipervariadas existentes no genoma da levedura. Este protocolo permitiu a separação dos isolados de C. neoformans e C. gattii em oito grandes grupos moleculares, como já foi mencionado.

Em 2003, um dos primeiros grandes estudos multicêntricos de caracterização molecular de espécies de Cryptococcus foi realizado pelo Ibero American Cryptocococcal Study Group, que envolveu oito países da America Latina e a Espanha. O minissatélite M13 foi utilizado para diferenciação dos grupos moleculares das espécies e a confirmação dos mesmos ocorreu por análises de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) do Gene Urotidina Monofosfato Pirofosforilase (URA5), o qual demonstrou a prevalência de VNI dentre as cepas de Cryptococcus neoformans⁶⁶.

Muitos estudos utilizando a classificação de Meyer et al. (1999)⁶³ foram realizados em diversas partes do mundo. Na Austrália, um estudo de 61 isolados clínicos e 49 ambientais (isolados de eucaliptos e outras árvores) de C. gattii revelou que 92% dos clínicos pertenciam ao genótipo VGI e 100% dos ambientais isolados de eucaliptos, eram VGI, além disso, três isolados clínicos e um ambiental de outra árvore, que não o eucalipto, foi VGII e apenas um isolado clínico foi VGIII⁶⁷.

Na Índia, o genótipo VNI mostrou-se predominante ocorrendo em 89% dos 57 isolados clínicos, os genótipos VNIV e VGII também foram encontrados, com porcentagens de 2% e 9%, respectivamente⁶⁸.

Em Barcelona, Espanha, o tipo VNI ocorreu em todos os 22 isolados escolhidos randomicamente para genotipagem, todos foram provenientes de amostras do solo misturadas a excrementos de pombos⁶⁹.

Na América Latina, Meyer et al. (2003)⁶⁶, ao estudarem 304 cepas de Cryptococcus spp. do Brasil, Argentina, Chile, Colômbia, México, Peru, Venezuela, Guatamela e Espanha, encontraram o genótipo VNI em 68,2% dos isolados e o genótipo VNII, em pequena proporção (5,6%) seguido do genótipo VNIII (sorotipo AD) com 4,1% e do VNIV, com 1,8%. Já o genótipo VGI foi encontrado em 3,5% dos isolados, VGII, em 6,2%, VGIII em 9,1% e VGIV em 1,5%. O Brasil participou do estudo com 66 cepas. Dessas 82,3% foram VNI, 3% VNII e 13,6% VGII⁶⁶.

Em relação aos estudos realizados no Brasil, Casali et al. (2003)³⁸ ao estudar 105 cepas clínicas e 19 ambientais relataram que o genótipo VNI era o mais comum na região sul do Brasil (89,3%), seguido pelo genótipo VGI (8,9%) e VNIV (7,3%), ao qual pertenciam todos os isolados obtidos de Eucalyptus spp. O estudo de Abegg et al. (2006)⁹, no Rio Grande do Sul, relatou que todos os genótipos de C. neoformans foram VNI, já os C. gatiii, VGI⁹.

Já em 2008, Trilles e colaboradores⁷⁰ realizaram um estudo verificando a distribuição dos tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii em todo o Brasil, a fim de correlacionar os genótipos com as regiões geográficas e condições dos hospedeiros. Foram analisados 443 isolados, sendo 320 de C. neoformans e 123 de C. gattii, de todas as regiões do Brasil, representadas por onze Estados. Os tipos moleculares mais comuns foram VNI (64%) e VGII (21%), seguido por VNII (5%), VGIII (4%), VGI e VNIV (3% cada), e VNIII (< 1%). O tipo molecular VGIV não foi identificado dentre os isolados estudados no Brasil. O estudo revelou ainda que o genótipo VGII ocorreu predominantemente na macrorregião nordeste, e o VNI na macrorregião sudeste, como ilustra a Figura 6. Do Estado do Amazonas foram obtidos 12 isolados e os tipos moleculares identificados foram VNI e VGII⁷⁰.

Em recente estudo realizado por Silva (2009)⁷¹, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, foram realizadas tanto a feno quanto a genotipagem de 40 isolados clínicos, sendo que usando o meio CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol), foi observado que 75,5% (n=31) e 22,5% (n=9) dos isolados eram Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, respectivamente. Já a PCR- fingerprinting usando a seqüência M13, mostrou que a maioria dos isolados, 72,5%

(n=29) era do genótipo VNI e que todos os nove isolados da espécie C. gattii eram do genótipo VGII⁷¹.

Figura 6. Imagem da distribuição dos tipos moleculares de acordo com os Estados Brasileiros incluídos na análise. Fonte: Trilles et al., 2008⁷⁰.

Métodos moleculares tem sido desenvolvidos para diagnóstico e monitoramento de infecções fúngicas, bem como para tipificação dos isolados, visando principalmente, estudos epidemiológicos. A reação em cadeia de polimerase (PCR) tem sido a principal ferramenta utilizada no desenvolvimento de protocolos de detecção de DNA de C. neoformans e C. gattii⁷².

Quanto à possibilidade de se utilizar a Região ITS (Internal Transcript Space) para caracterização de Cryptococcus, os genes ribossomais são alvos estudados nos sistemas baseados em PCR, para detecção e identificação deste patógeno fúngico ^73,74. As regiões ITS possuem sequências altamente variáveis que tem sido usadas para identificação de fungos nos mais diferentes formatos de níveis de espécie ^75,76,77.

Em 1999, Irobi e colaboradores⁷⁸ descreveram um método molecular para identificação de leveduras do gênero Candida, tendo como alvo a região ITS. Os primers utilizados foram ITS5 (5’-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e NL4 (5’- GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’). O método provou ser simples e reprodutível, além de oferecer potenciais vantagens sobre os métodos de fenotipagem⁷⁸.

Já em 2009, Santos e colaboradores⁷⁹ identificaram agentes causadores de fungemias (Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii e Histoplasma capsulatum) utilizando PCR/RFLP, e entre as combinações de pares de enzimas de restrição,

somente uma combinação (par de primers ITS5/NL4 e enzima de restrição Ddel) produziu um padrão RFLP específico para cada microrganismo estudado. Neste estudo, a região dos primers ITS5 e NL4, permitiu a distinção de genótipos VGII e VNI⁷⁹.

Diante do contexto, há escassez de estudos desta natureza na região Norte, especialmente no Estado do Amazonas⁷¹. Em um país com dimensões continentais, há necessidade de realizar pesquisas sobre as características genotípicas do gênero Cryptococcus, pois fatores ambientais, geográficos e climáticos propiciam variações tanto na feno quanto na genotipagem, e conseqüentemente na patogenicidade das infecções oportunistas⁴³.

O evento que ocorreu em Vancouver aumentou ainda mais o interesse das comunidades médico-científicas em conhecer os grupos moleculares causadores da doença, pois as espécies estão começando a ocupar novos nichos ecológicos. É de grande importância monitorar onde e quantos casos de infecção por Cryptococcus estão ocorrendo, a fim de identificar os grupos moleculares envolvidos, mesmo em regiões com clima onde não seria esperado encontrar a espécie.Este estudo traz informações particulares sobre os genótipos que causam infecção no Amazonas.

Estas informações são importantes para a epidemiologia da doença no Estado, uma vez que os dados do Amazonas ainda são pouco conhecidos, pois há ausência de outros estudos. Estudos similares devem ser estimulados em todas as áreas endêmicas, determinando o grau de sua potencialidade patogênica em indivíduos imunocomprometidos ou imunocompetentes.

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Caracterizar por métodos moleculares agentes causadores de Criptococose, isolados de pacientes atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do Amazonas.

2.2 Específicos

- Investigar quais os grupos moleculares causadores de Criptococose através do PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pelo perfil de restrição (PCR- RFLP) utilizando o gene URA5;

- Avaliar a possibilidade de se utilizar uma PCR-RFLP, tendo como alvo a região ITS do DNAr, para caracterização dos grupos moleculares de Cryptococcus;

- Verificar a presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies por PCR;

- Descrever e correlacionar as características epidemiológicas dos pacientes com os grupos moleculares, a partir dos dados obtidos nas requisições de exames.

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Modelo de Estudo

Estudo descritivo transversal com a finalidade de caracterizar os isolados causadores de Criptococose no Estado do Amazonas.

3.2 Universo de estudo

Local: Este estudo foi realizado no Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) e no Laboratório de Micobacteriologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).

Período: O período de estudo foi entre Março de 2006 a Fevereiro de 2010.

Amostras: Os isolados foram obtidos de material clínico procedente do Laboratório de Micologia da FMT-HVD.

Aspectos éticos: Este projeto de pesquisa foi registrado e aprovado pelo CEP- FMT/AM, Processo n°. 763/2010-FMT-AM, CAAE – 0007.0.114.000-10 (Anexos).

Financiamento: Este estudo foi financiado pela FAPEAM, através do edital N°.014/2006 PPSUS 2006.

Microrganismos Analisados Isolados Clínicos

Os 60 isolados deste estudo foram obtidos de pacientes acometidos por Criptococose, portadores de HIV ou não, internados na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre março de 2006 a fevereiro de 2010. De cada paciente foi utilizado apenas um único isolado fúngico (o primeiro isolado da amostra enviada ao Laboratório). Estes isolados estavam sendo mantidos sob refrigeração (4^oC), na Coleção de Fungos da FMT-HDV.

Cepas de Referência

As linhagens foram caracterizadas genotipicamente de acordo com as cepas- padrão concedidas gentilmente pela Coleção de Culturas da Fundação Oswaldo

Cruz (FIOCRUZ-RJ) (Tabela 2).

Tabela 2. Lista de cepas de referência utilizadas neste estudo, incluindo informações gerais, sorotipo (ST), mating type (MAT), tipo molecular (TM).

Isolados WM N°. País Fonte ST MAT TM WM 148^R WM 148 Austrália CLIN A Alpha VNI WM 626^R WM 626 Austrália CLIN A Alpha VNII WM 628^R WM 628 Austrália CLIN AD Alpha VNIII WM 629^R WM 629 Austrália CLIN D Alpha VNIV

WM 179^R WM 179 Austrália CLIN B Alpha VGI

WM 178^R WM 178 Austrália CLIN B Alpha VGII WM 161^R WM 161 Austrália CLIN B Alpha VGIII WM 779^R WM 779 África do Sul VET C Alpha VGIV

3.3 Procedimentos

3.3.1 Determinação dos grupos moleculares 3.3.1.1 Reativação dos isolados fúngicos

A fim de reativar os microrganismos, foi utilizado o cultivo em Ágar Sabouraud a 37 ^oC por 48 h. Após este período, foram purificados em placa contendo Ágar Níger, e apenas uma colônia foi retirada e semeada em Caldo Sabouraud a 30 °C, para obtenção da biomassa, utilizada nos estudos genotípicos (extração de DNA) (Figura 7).

3.3.1.2 Extração de DNA genômico

A extração foi baseada na utilização de membrana de sílica (Kit QIAamp Tissue and Blood, Qiagen, Hilden, Germany) (Figura 8).

Cerca de 90 mg de biomassa foram transferidos com auxílio de alça descartável para eppendorf contendo 180 µL de tampão de lise e pérolas de vidro lavadas em ácido (450-600 nm). As células foram rompidas com choque mecânico e depois se procedeu à extração genômica com adição de Proteinase K overnight a 56

°C, em seguida adicionou-se 200 µL de tampão de guanidina e fez-se a agitação a frio em vórtex por 15 s e incubou-se por 10 min a 70 °C. Passado este período, foi adicionado o mesmo volume, 200 µL, desta vez de etanol e foi homogeneizado em

agitador. A mistura foi transferida para as colunas de sílica e foi centrifugada a 8000 rpm em 1 min. O material foi transferido para novo tubo da coluna e 500 µL do primeiro tampão de lavagem foi adicionado à coluna, em seguida, foi centrifugado por 1 min a 8000 rpm. Novamente o tubo da coluna foi trocado, e 500 µL do segundo tampão de lavagem foi adicionado à coluna de sílica, e centrifugado a 14000 rpm por 3 min. Mais uma vez, o tubo da coluna foi retirado e o tampão de eluição do DNA foi adicionado, procedendo com a centrifugação a 8000 rpm por 1 min, desprezando a coluna e armazenando o filtrado a 4 °C.

A concentração de DNA Genômico foi verificada através de leitura em espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare) no comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância correspondeu a 50 μg/mL) e a razão de pureza foi determinada pela razão entre as absorbâncias a 260 e 280 nm.

3.3.1.3 PCR-Fingerprinting RAPD utilizando o minissatélite M13

Foi utilizada a seqüência específica do minissatélite M13 (5’- GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (Meyer et al., 1999)⁶³. A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 25 μL contendo 50 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consitiu em 6 min de desnaturação (94 ^oC); 40 ciclos de 1 min desnaturação à 94 ºC, 1 min de anelamento à 50 ºC e 2 min de extensão à 72 ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72 ºC. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60 V (Figura 9).

3.3.1.4 PCR-RFLP do Gene URA5

A PCR do gene URA5 foi conduzida com um volume final de 50 μL. Cada reação continha 50 ng de DNA molde (extraído com conjunto de extração QIAamp DNA blood kit - Qiagen, Hilden, Germany), solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, e 1,5 U de Taq DNA polimerase

(Recombinante Invitrogen) e 50 ng de cada primer URA5 (5´-ATGTCCTCCCAAGC CCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´-TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC´-3).

A PCR foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, iniciou-se com 2 min de desnaturação (94 ºC) e 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento à 61 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, finalizou-se com um ciclo de extensão final de 10 min à 72 ºC.

Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, por 2 h a 100 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta.

Oito microlitros dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de tampão da enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I (10 U/µL)e Hha I (20 U/µL) em incubação por 3 horas ou overnight a 37 °C, e separados por eletroforese em gel de agarose 3%, por 5 h a 100 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta. Os padrões de RFLP foram visualizados comparando-os com os padrões obtidos das cepas de referência (VNI-VNIV e VGI-VGIV) (Figura 10).

3.3.1.5 Determinação dos Mating Types

O mating type foi determinado por PCR, que foi conduzida para um volume final de 25 µL. Os primers do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'- CTTCACTGC CATCTTCACCA-3') e Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e os primers do tipo a-específicos foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’) e Mat-aR (5’- AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’).

Cada reação conteve 20 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen).

A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, primeiramente foi realizada desnaturação inicial a 94 °C por 3 min, em seguida foram realizados 35 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento a 58 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 7 min

à 72 ºC. As reações de amplificação foram realizadas de acordo com o procedimento de Chaturvedi et al. (2000) modificado⁸⁰.

O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 2% por 3 h a 100 V, corado com SybrGreen e iluminado com luz ultravioleta (Figura 11).

3.3.2 Caracterização dos grupos moleculares utilizando região ITS do DNAr A PCR do gene espaço transcrito interno (ITS) do DNAr foi conduzida com um volume final de 50 µL. Cada reação continha 50 ng de DNA molde (extraído com conjunto de extração QIAamp DNA blood kit - Qiagen, Hilden, Germany), solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, e 3,0 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen) e 50 pM de cada primer ITS5 (5´-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-´3) e NL4 (5´-GGTCCGT GTTTCAAGACGG-´3).

A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, primeiramente com desnaturação inicial por 6 min a 94 °C, em seguida foram realizados 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento à 55 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 10 min à 72 ºC.

O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com SybrGreen e iluminados com luz ultravioleta.

Oito microlitros e meio dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de tampão da enzima Ddel (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) e foram digeridos com 5,0 U da mesma (10 U/µL) em incubação por 3 horas ou overnight a 37 °C , e separados por eletroforese em gel de agarose 2% por 3 h a 110 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta. Os padrões de RFLP foram visualizados comparando-os com os padrões obtidos das cepas de referência (VNI-VNIV e VGI-VGIV) (Figura 12).

Amostra Biológica

Isolamento em Ágar Níger

Conservação a 4 °C Reativação em Ágar Sabouraud

Purificação em

Ágar Níger Uma colônia é cultivada em Caldo Sabouraud

RE AT IV AÇÃ O /I SO LA M . F Ú N G IC O

Figura 7. Fluxograma da Reativação e Isolamento Fúngico

Figura 8. Fluxograma da Metodologia de Extração do DNA Genômico.

E X T RAÇ ÃO

60 Isolados

Colônia do Caldo Sabouraud

90 mg de biomassa fúngica

Extração pelo Kit Qiagen^® Obtenção do DNA

Leitura em Espectrofotômetro da Concentração de DNA e

pureza

Figura 9. Fluxograma da PCR-Fingerprinting do Minissatélite M13

P CR - F ING E RP RINT IN G

Minissatélite (5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’) M13

60 Isolados

DNA

Mix de PCR

Amplificação DNA amplificado Gel de Agarose 1,4%

Primer Oligonucleotídeo

Figura 10. Fluxograma da PCR-RFLP do gene URA5

P CR - R FLP G e n e URA5

60 Isolados

DNA

Mix de PCR

Amplificação DNA

amplificado Gel de Agarose

3%

Primer URA5/SJ01 DNA digerido

Sau96I e HhaI

Gene URA5

URA5 (5'-TGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG-3') SJ01 (5'-TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC-3')

Figura 11. Fluxograma da PCR dos mating types.

P CR - M a ti n g T y pe s

Mix de PCR

Amplificação DNA

amplificado Gel de Agarose 2%

Par de primers Mat-αF/Mat-αR

ou Mat-aF/mat-aR

MATα

Mat-αF (5'- CTTCACTGC CATCTTCACCA-3') Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3')

MATa

Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’) Mat-aR (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’).

60 Isolados

Figura 12. Fluxograma da PCR-RFLP da região ITS do DNAr.

P CR - R FLP I TS

DNA

Mix de PCR

Amplificação DNA

amplificado Gel de Agarose

2%

Par de primers ITS5/NL4

DNA digerido Ddel

DNAr

ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3) NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')

60 Isolados

3.4 Caracterização Epidemiológica dos Pacientes

O perfil dos pacientes acometidos por Criptococose (gênero, idade, infecção pelo HIV e tipo de amostra clínica de isolamento) foi obtido através da análise das requisições de exames, presentes no Laboratório de Micologia da FMT-HVD.

4 RESULTADOS

Os resultados estão apresentados na forma de Artigo Científico que será submetido à publicação na Revista Mycoses (Alemanha) (B1).

ARTIGO ORIGINAL

Molecular characterization of causative agents of Cryptococcosis isolated from patients in a tertiary healthcare in the State of Amazonas.

Ana Karla Lima Freire,¹ Amaury dos Santos Bentes,² Lucilaide Oliveira Santos,¹ Maurício Morishi Ogusku,² Julia Ignez Salem,² Bodo Wanke ^1,3 and João Vicente Braga de Souza^1,2

1 Laboratório de Micologia, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Universidade do Estado do Amazonas, Brasil ² Laboratório de Micobacteriologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Brasil ³ Laboratório de Micologia, Fundação Osvaldo Cruz, Brasil.

SUMMARY From the knowledge that there are four molecular groups of Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and four of Cryptococcus gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to identify groups of incidents in different geographic regions worldwide. This effect was investigated what molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated from patients in a tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 2006-2010. The isolates were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite and confirmed by PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using PCR-RFLP targeting the ITS1 rDNA was also evaluated. The presence of specific genes with mating type locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR. It was found that patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV (75.0%) with meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were mostly characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three isolates (5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and the experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C. gattii (VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only two were type a. It found the prevalence of VNI molecular group, the meeting of the VNII molecular group, never before reported for the northern region of Brazil, and suggested that the new methodology for genotyping using as a target gene of rDNA ITS region characterized only the two molecular groups C. gattii.

Key words: Cryptococcus, Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP, ITS5/NL4.

INTRODUÇÃO

A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete os órgãos internos e a pele, decorrente da inalação de propágulos infectantes das espécies patogênicas leveduriformes - Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A doença apresenta-se de forma subaguda ou crônica, afetando tanto os indivíduos imunodeprimidos (aids, principalmente) como os imunocompetentes. A aids é o fator predisponente mais importante para infecção, sendo que, falhas no sistema imunológico, inato e adaptativo, induzido pelo vírus HIV (Human Immunodeficiency Virus) são responsáveis pela disseminação da Criptococose. Uma das características do gênero Cryptococcus é o tropismo meningoencefálico que resulta em elevada mortalidade na ausência de tratamento.^1-3

A patogenicidade do gênero Cryptococcus é determinada, principalmente, pela cápsula polissacarídica, que promove resistência a fagocitose, proteção da levedura e inativação do sistema complemento; e pela produção da enzima fenol-oxidase responsável pelo neurotropismo do fungo.⁴

Tanto C. neoformans quanto C. gattii, apesar de reproduzirem-se assexuadamente, possuem um sistema complementar com dois mating types: a e α. Para que este tipo de reprodução sexuada ocorra é necessário que haja o encontro entre dois mating types opostos. Geneticamente, o locus mating type é a região do genoma fúngico que regula o ciclo sexual e pode ser diferente entre células de mating types opostos.⁵

A espécie C. neoformans possui distribuição geográfica mundial, enquanto que C.

gattii é encontrado com maior freqüência em regiões tropicais e subtropicais. Porém, este cenário foi remodelado em 1998, quando foi observado um surto de infecção por Cryptococcus gattii, no clima temperado da Ilha de Vancouver, British Columbia (BC), Canadá, caracterizado por ferramentas de PCR-Fingerprinting.^6-9

As técnicas moleculares de tipificação PCR-Fingerprinting fundamentam-se na amplificação de produtos de PCR a partir de regiões gênicas que permitem estudos filogenéticos e propiciam discussões nos vários níveis taxonômicos até mesmo de:

espécie, variedade ou linhagem.^10-11 Atualmente, devido aos estudos realizados por

Meyer et al. [12], foram definidos oito grandes grupos moleculares a partir dos protocolos de PCR-Fingerprinting Minissatélite M13 e PCR-RFLP-URA5. Os grupos moleculares correspondentes a C. neoformans são VNI, VNII, VNIII e VNIV, enquanto o C. gattii é subdividido em VGI, VGII e VGIII e VGIV.^12-13

Outra região gênica que vem sendo utilizada na detecção e identificação de patógenos fúngicos por PCR corresponde as regiões do espaço transcrito interno (ITS), com sequências conservadas, encontradas em genes ribossomais.^14-21 O uso da região ITS foi estabelecida em 1999, quando Irobi et al. [15] descreveram um método molecular para identificação de leveduras do gênero Candida.

Especificamente para Cryptococcus spp., os estudos realizados por Santos et al.

[19], utilizando o mesmo alvo e primers, diferenciaram as espécies C. neoformans e C. gattii. Segundo os autores, os resultados demonstram que a região gênica possui potencial para distinção das espécies e talvez até mesmo dos grupos gênicos.¹⁹ Os estudos de tipificação molecular aperfeiçoam o diagnóstico fúngico, elucidam a diversidade genética e corroboram com bases científicas para estudos epidemiológicos globais.^20,22-23 Atualmente, estes estudos também possuem importância na associação de diferentes grupos moleculares às características de virulência, à sensibilidade aos antifúngicos e a terapêutica.^24-25

Investigar os grupos moleculares do gênero Cryptococcus, isolados de pacientes atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do Amazonas, foi o objetivo do presente estudo. Especificamente pretendeu-se: determinar os grupos moleculares por PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pela PCR-RFLP do gene URA5; avaliar a utilização de uma PCR-RFLP tendo como alvo a região ITS do DNAr para caracterizar os grupos moleculares de Cryptococcus; analisar a presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies por PCR; e caracterizar os pacientes quanto ao gênero, idade, infecção pelo HIV e amostra clínica, de onde os agentes foram isolados.