A gema de ovo

A gema de ovo tem sido utilizada para aumentar a habilidade de fertilização do espermatozóide quando presente nos diluidores para o armazenamento do sêmen na temperatura ambiente (DUNN et al., 1950; SHANNON & CURSON, 1983) e parece prevenir danos às células espermáticas durante o resfriamento e congelação (PHILLIPS & LARDY, 1940; DE LEEUW et al., 1993). Entretanto, o mecanismo pelo qual esta proteção é fornecida ao espermatozóide permanece desconhecida. É especulado que a fração lipoprotéica de baixa densidade (LDL) contida na gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide e promova a proteção ao espermatozóide estabilizando a membrana, contudo alguns autores questionam a estabilidade da associação de LDL com a membrana do espermatozóide (WATSON, 1975; FOULKES, 1977; MACDONALD & FOULKES, 1981). Uma segunda hipótese sugere que os fosfolipídios presentes nas LDL protegem os espermatozóides por formar uma película protetora na superfície do espermatozóide (QUINN et al., 1980) ou por substituição dos fosfolipideos da membrana dos espermatozóides que são perdidos ou danificados durante o processo de criopreservação (FOULKES et al., 1980; GRAHAM & FOOTE, 1987). Essa película protetora é formada por esferas de lipoproteínas que contem lipídios neutros de tamanho variável, rodeado de uma capa de lipoproteína composta principalmente de glicoproteínas e fosfolipídios, cujos grupos hidrófobos se orientam para o interior e os grupos hidrófilos para a superfície (EVANS et al., 1973). Um estudo recente mostrou que a fosfatidilcolina da gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide e protege o sêmen do garanhão tão eficientemente quanto a gema de ovo; entretanto, aqueles fosfolipídios não são incorporados na membrana espermática (RICKER et al., 2006). Uma terceira hipótese sugere que as LDLs competem com os peptídeos catiônicos do plasma seminal prejudicial à membrana do espermatozóide e assim protegem os espermatozóides. (VISHWANATH et al.,1992). Recentemente BERGERON & MANJUNATH (2006) descobriram que uma família de proteínas obrigatórias dos lipídeos (proteínas de BSP) presente no plasma seminal do touro interage com a LDL e que esta interação parece ter

efeitos significativos na preservação da integridade do espermatozóide (MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004). Segundo FOULKES (1977), a gema de ovo previne também a liberação da enzima hialuronidase pela célula espermática.

Para a preservação do sêmen canino, uma variedade de concentrações de gema de ovo tem sido utilizada. Visto que a mesma também tem uma capacidade de tampão, sua quantidade no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do diluente (FARSTAD, 1996). As amostras de gema de ovo comumente utilizadas na congelação de sêmen canino são em média 15 – 30% do volume total. Esta variação na concentração é baseada nos resultados obtidos por VAN DEMARK et al., (1957), onde o percentual de espermatozóides móveis após congelação e descongelação foi similar entre estas concentrações. SILVA et al., (2000) constataram uma superioridade do diluidor à base de Tris contendo 20% de gema de ovo em relação a concentração de 10% de gema de ovo quanto aos parâmetros de vigor, alterações espermáticas totais e secundárias. DAVIES (1982) obteve melhores taxas de sobrevivência pós-descongelação incluindo 20% de gema de ovo, frente a 5% (v/v), no entanto, não encontrou diferenças significativas na motilidade pós- descongelação quando comparou taxas de 10 e de 20% (v/v), se bem que, nos resultados absolutos a motilidade pós-descongelação foi superior quando utilizava 20%. LOPES-NETO

et al., (2006) testaram diferentes concentrações de gema de ovo (5%, 10% e 20%) acrescidas

ao diluidor a base de água de coco em pó e não obtiveram diferenças em relação aos parâmetros observados. Nesse contexto, as maiorias dos autores utilizam concentrações de gema em torno de 20% no diluente (FARSTAD & ANDERSEN-BERG, 1989; LINDE- FORSBERG & FORSBERG, 1989; SILVA, 2001; MARTINS, 2005).

A gema de ovo, sendo um produto de origem animal, representa um risco potencial de contaminação do sêmen e sua composição não é uniforme. Conseqüentemente, está aumentando o interesse de diluidores livres de produtos da origem animal para armazenagem do sêmen (MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004). Por essas razões, pesquisas visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados foram conduzidas e observaram que os análogos do hidroxitolueno butilado (BHT) são interessantes substitutos para a gema, por também protegerem a membrana plasmática da injúria do choque térmico (FARSTAD, 1996). Estudos recentes mostraram ser possível a purificação das LDL, permitindo sua utilização em substituição à gema de ovo integral (MOUSSA et al., 2002). VARELA JR. et al. (2004) avaliaram o efeito de diferentes concentrações de LDL purificada

adicionada ao diluente Tris para a refrigeração do sêmen do cão a 5ºC e observaram que concentrações entre 6 e 10% de LDL são tão eficientes quanto o uso de 20% de gema de ovo integral. Entretanto, a literatura ainda é escassa de informações quanto ao uso das LDL na tecnologia de sêmen de cães.

Além de sua ação em proteger a membrana espermática, a gema de ovo é também conhecida por servir como uma fonte protéica para o diluente (SANTOS, 2004).

2.5. O glicerol

Para a criopreservação dos espermatozóides faz-se necessário a adição de substâncias que protejam estas células contra os danos oriundos da congelação. Muitos são os compostos de ação crioprotetora, os quais são tradicionalmente classificados como tendo ação intra ou extracelular. Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem os álcoois, etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol e polietilenoglicol (DE LEEUW et al., 1993) e também as amidas, incluindo a acetamida, formamida, lactamida e bem como o dimetilsulfoxido (DMSO) (JEYENDRAN & GRAHAM, 1980; ASHWOOD – SMITH, 1987; MEDEIROS et

al., 2002). Já no grupo de ação extracelular se incluem açúcares, lipoproteínas da gema do

ovo e proteínas do leite (AMANN & PICKETT, 1987) e polivinil-pirrolidona (ENGLAND, 1993).

POLGE et al., (1949), demonstraram a eficácia do glicerol como crioprotetor universal e desde então essa substância vem sendo amplamente utilizada. PARKS & GRAHAM (1992) sugeriram que o glicerol penetra a célula através da difusão passiva, permanecendo tanto na membrana quanto no citoplasma. GRAHAM (1996) verificou que a difusão do glicerol é de 30 a 60 vezes mais lenta que a da água. A primeira conseqüência da adição do glicerol em um meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma rápida saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento retorno ao volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula (HAMMERSTED & GRAHAM, 1990; PEÑA, 1997). O modo pelo qual o glicerol atua não se encontra totalmente elucidado. Acredita-se que a ação protetora deste crioprotetor é atribuída a suas propriedades coligativas e ligantes com a água, diminuindo o ponto de congelação da solução, o qual é determinado como a temperatura onde ocorre a formação dos primeiros cristais de gelo. Numa solução contendo glicerol, no momento em que ocorrer a congelação restará mais água

descongelada do que numa solução sem glicerol, havendo com isso, um aumento do volume dos canais de solvente não congelado e uma menor concentração de sais nesses canais (KEITH, 1998) o que reduz com isso os danos do efeito de solução (PEÑA, 1997; HOLT, 2000).

Apesar de imprescindíveis para a sobrevivência dos espermatozóides no processo de congelação, o glicerol apresenta efeitos tóxicos para estas células (HOLT, 2000a). Por promover a remoção da água intracelular o glicerol acarreta o encolhimento celular e o influxo de íons, no entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente, há o influxo de água podendo ocasionar a ruptura da membrana (HOLT, 2000b). O espermatozóide dos mamíferos comporta-se como um osmômetro linear, ocorrendo morte celular caso haja intumescimento ou encolhimento do mesmo quando submetido a níveis superiores da tolerância osmótica espécie específica. As lesões da membrana plasmática podem também estar relacionadas de maneira secundária ao rápido movimento da água através desta (BALL & VO, 2001). Sua toxicidade pode resultar também na inibição da atividade enzimática (FAHY, 1986), na desnaturação de proteínas e as alterações das interações da actina (FAHY, 1990) e originar danos acrossomais (HOLT, 2000). Segundo HAMMERSTEDT & GRAHAM (1992) o glicerol induz a mudanças nos eventos citoplasmáticos por aumentar a viscosidade ao penetrar a célula espermática, causando alterações na polimerização da tubulina, na associação dos microtúbulos, no balanço bioenergético, além de atuar diretamente de modo prejudicial na membrana plasmática, no glicocálix e nas proteínas de superfície celular. A fusogenicidade da membrana e o padrão de respostas induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas mudanças causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática, podendo este fato contribuir para a diminuição da sobrevivência espermática posterior ao processo de congelação/descongelação e acelerar a capacitação espermática (WATSON, 1995).

No intuito de se conseguir o máximo efeito crioprotetor com o mínimo de efeitos tóxicos, vários pesquisadores vêm testando diferentes concentrações de glicerol no diluidor a fim de determinar a concentração ideal. Segundo ENGLAND (1992) a concentração de glicerol para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%. Para OLAR et al., (1989) e ROTA et al., (1998) os melhores resultados foram obtidos com concentrações variando entre 2 e 8% no volume de sêmen diluído. PEÑA et al., (1998) compararam concentrações de 2, 4, 6 e 8% de glicerol para congelação do sêmen canino, e concluíram que a glicerolização na

proporção de 8% proporcionou os melhores índices de motilidade, viabilidade e morfologia espermática na pós-descongelação. SILVA et al., (2002d) testaram as concentrações de 4, 6 e 8% de glicerol para a congelação do sêmen canino e verificaram que a morfologia espermática era melhor preservada, quando utilizada a concentração de 6%. SANTOS et al., (2003) compararam as concentrações de 4, 6, 8 e 10% de glicerol e concluíram que a crioproteção do glicerol, na concentração de 8% em associação ao diluente a base de Tris- gema preservou melhor as características morfofisiológicas do espermatozóide canino. CARDOSO et al (2003a) testaram as concentrações de 4,6 e 8% de glicerol no diluidor a base de água de coco não observando diferenças em relação aos parâmetros avaliados.

O efeito da temperatura de adição de glicerol tem sido investigado em estudos de criopreservação do sêmen canino. Os agentes crioprotetores penetrantes, particularmente o glicerol, protegem a célula da crioinjúria durante a fase de cristalização que ocorre entre -6° e

-10°C. Dessa forma, não pareceria ser lógico adicionar o glicerol a temperaturas superiores a

30°C (COLAS, 1975). No entanto, ANDERSEN (1975) realizou a adição de um diluente

glicerolizado ao sêmen a 37°C e obteve bons resultados após inseminação artificial. Já PEÑA et al., (1998) não encontraram diferenças entre a adição de glicerol ao sêmen a 37° ou a 4°C.

FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen canino após a descongelação entre a adição do glicerol à temperatura ambiente (25°C) e a

5°C. Em um estudo mais recente JUCÁ et al., (2007) também não observaram diferenças entre a glicerolização a temperatura ambiente em relação a 4°C utilizando um diluidor a base água de coco em pó. Diante disso pode-se concluir que não há problema em promover a glicerolização a temperatura ambiente.

No que diz respeito à forma de adição do glicerol (simples ou fracionada), FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen canino após a descongelação. SILVA et al., (2003) compararam a adição única e fracionada do glicerol ao sêmen, na temperatura de 4ºC e não observaram diferenças entre as mesmas. Da mesma forma LIMA et al., (2007) ao comparar as duas formas de glicerolização em um diluidor à base de água e coco em pó também não encontraram diferenças.

2.6. Tempo de equilíbrio

O tempo de equilíbrio é considerado o tempo total em que os espermatozóides são mantidos em contato com o glicerol e todos os demais componentes do diluidor, previamente à congelação (BITTENCOURT et al., 2006). Durante esse período, ocorre o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular espermático e extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente ativos presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL, 2000). WATSON (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram.

Outro ponto importante atribuído ao tempo de equilíbrio é que a permanência do sêmen a uma baixa temperatura permite uma melhor adaptabilidade dos espermatozóides a essa temperatura, reduzindo com isso, o efeito negativo do choque térmico já que as alterações físicas e químicas na membrana celular causadas pelo resfriamento podem ser irreversíveis (SANTOS et al., 2003). ENGLAND (1992) sugeriu que o sêmen de várias espécies animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação para que desenvolva uma máxima resistência aos efeitos da congelação e concluiu, ainda, que o tempo de equilíbrio pode ser extremamente variável de acordo com o protocolo de congelação/descongelação e, ainda, de acordo com a espécie em questão. Segundo OETTLÉ (1986), um apropriado período de equilíbrio, assim como adequadas taxas de diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações espermáticas durante o processo de criopreservação espermática.

Tempos distintos de resfriamento e equilíbrio, variando de 45 minutos a 5 h, foram relatados para cães (FARSTAD & ANDERSEN BERG, 1989; FERGUSON et al., 1989; FONTBONNE & BADINMD, 1993; NOTHLING et al., 1995; SILVA et al., 1996). OLAR et al., (1989) constataram que a melhor motilidade pós descongelação foi alcançada com o sêmen de cão refrigerado de 37°C a 5°C por 1 h e equilibrado a 5°C por 1 h ou resfriado por 2h e equilibrado a 5°C por mais 2h usando o diluidor Tris-gema contendo 3-4% de glicerol. ENGLAND (1992) encontrou que um tempo de equilíbrio de 4 h a 5°C resultou em melhor motilidade pós descongelação e porcentagem de espermatozóides vivos quando comparada a tempos de equilíbrio de 2 e 6h usando o diluidor Tris/Tes-gema de ovo com 6,5% de glicerol. ROTA (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a 4ºC

durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era atingida após 45 minutos de resfriamento. SANTOS et al., (2003) observou que os melhores resultados de motilidade, vigor, retenção acrossômica e termoresistência foram obtidos com 1 h de equilíbrio a 4°C e concluiu que a estabilização do sêmen com o meio diluidor é de fundamental importância para manter a integridade da membrana do espermatozóide durante o processo de congelação. Por outro lado, HAY (1996) observou que após resfriamento rápido para O°C durante 40 min, com equilíbrio maior que 2 horas, houve uma diminuição na motilidade espermática e na porcentagem de espermatozóides com acrossomas intactos.

Como pode ser constatado, ainda existem algumas divergências entres os pesquisadores quanto ao melhor tempo de equilíbrio para o sêmen de cães. Consequentemente, faz-se necessário mais estudos a fim de elucidar algumas dúvidas que ainda restam sobre esse assunto.

2.7. Taxa de descongelação

Um ponto de extrema importância para a melhoria dos resultados na criopreservação do sêmen é a metodologia empregada na descongelação. Investigações recentes tem levado a hipótese de que os espermatozóides criopreservados são danificados principalmente durante a descongelação (HOLT et al.,1992; GAO et a.l, 1992; CURRY & WATSON, 1994; HOLT & NORTH, 1994; ROTA et al.,1998) e, isso estaria relacionado às mudanças das condições hipertônicas durante a congelação para condições isosmóticas durante a descongelação. Segundo HOLT (2000b), pelo fato do crioprotetor promover a remoção da água intracelular, ele provoca o encolhimento celular e o influxo de íons. No entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente, há o influxo de água podendo ocasionar a ruptura da membrana. Outro problema crítico da descongelação é a formação de cristais de gelo intracelulares (na maioria das vezes pequenos) que apresentam uma tendência a se agregarem para formação de cristais de gelo maiores (recristalização) (FAHY, 1986). As células devem então ser descongeladas de uma maneira capaz de prevenir a recristalização e as conseqüentes alterações de membrana e impedir o influxo exagerado de água que poderia causar alteração nas acomodações das membranas celulares.

Existem várias taxas de descongelação, as quais podem ser classificadas como rápidas ou lentas. Nas taxas de descongelação rápidas, usam-se temperaturas mais elevadas e,

de forma inversa, as taxas de descongelação lenta usam temperaturas medianas. Uma taxa de descongelação excessivamente lenta pode resultar em recristalização dos cristais de gelo intracelular resultando em uma redução na sobrevivência celular. Por outro lado, uma descongelação excessivamente rápida não permite que o crioprotetor penetrante saia suficientemente rápido quebrando assim o equilíbrio osmótico e causando inchaço do espermatozóide devido ao influxo de água (GRIFFTHS et al., 1979).

Por razões práticas, o sêmen canino diluído em TRIS é frequentemente descongelado a 37ºC, embora vários pesquisadores tenham encontrado que a descongelação a taxas maiores melhore a viabilidade dos espermatozóides (DAVES,1982; ENGLAND, 1992; ROTA et al.,1998 apud PEÑA & LINDE-FORSBERG, 2000). IVANOVA-KICHEVA et al., (1995), comparando os processos de descongelação a 37°C por 8s e 55 °C por 5s, observaram que a motilidade espermática, termoresistência, morfologia espermática e reservas energéticas foram mais bem preservadas a 55 °C, segundo esses autores, ao descongelar o sêmen em temperaturas mais altas, os efeitos destrutivos dos processos osmóticos nas estruturas dos espermatozóides são reduzidos. Além disso, o aumento rápido da temperatura de - 196°C a 55°C por 5s impede provavelmente a cristalização intracelular. Por outro lado SILVA et al., (1998) sugerem que a temperatura de 37ºC por 60s promove uma menor porcentagem de alterações morfológicas espermáticas do que a de 50ºC por 30s. BADINAND et al., (1993) descongelaram amostras de sêmen a 37°C por 45 segundos e consideraram este método moderado mais seguro e argumentou que o tempo de permanência em temperaturas altas é sempre crítico e de influência letal sobre a viabilidade dos espermatozóide. Já MINTER & DeLIBERTO (2005), em um estudo com sêmen de coiote, ao comparar a taxa de descongelação de 37° por 120s com 60° por 30s e 70° por 8s, concluiu que o sêmen descongelado a 37°C ou 60°C resultou em uma maior motilidade e viabilidade pós descongelamento com menos anormalidades morfológicas e acrossomais.

Outros pesquisadores defendem o uso de taxas de descongelação a temperaturas mais elevadas. NOTHLING & SHUTTLEWORTH (2005) relacionaram o tamanho da palheta com a taxa de descongelação e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5ml e descongeladas a 70°C por 8s foram as que apresentaram os melhores resultados. PEÑA & LINDE-FORSBERG (2000) observaram que todos os parâmetros avaliados foram significativamente melhores quando os espermatozóides foram descongelados a 70ºC por 8 s quando comparados com 37ºC por 15s. CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram

um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente qualidade espermática pós-descongelação. Para PEÑA & LINDE – FORSBERG (2000) existem evidencias que mudanças na fluidez da membrana espermática ocorrem durante o resfriamento, congelação e descongelação, e que algumas dessas mudanças são irreversíveis, provocando um aumento da permeabilidade da membrana, permitindo um influxo de cálcio descontrolado. Esse influxo de cálcio poderia ocasionar hiperatividade das células. Nesse estudo desenvolvido por PEÑA & LINDE – FORSBERG (2000) foram testadas duas taxas de descongelação (37ºC/15s e 70ºC/8s) sendo que a taxa de descongelação de 37ºC/15s proporcionou uma maior entrada de cálcio intracelular. O autor acredita que isso se deve ao fato de que as membranas espermáticas expostas a variações de temperaturas sofrem uma reorganização da membrana lipidica e/ou modificação de proteínas e que essas mudanças são mais severas com taxas de descongelação mais lentas.

O fato é que existem muitas controvérsias quanto ao melhor protocolo de descongelação, de modo que, se fazem necessários mais estudos nesse sentido.

3. JUSTIFICATIVA

O primeiro sucesso na criopreservação do sêmen de cães foi obtido por ROWSON em 1954, contudo o nascimento de filhotes da espécie canina utilizando sêmen congelado só foi relatado quinze anos mais tarde (SEAGER, 1969). Estudos sucessivos foram realizados promovendo a evolução desta biotécnica e, atualmente ela representa uma ferramenta importante no manejo reprodutivo de cães de alto valor zootécnico, de modo que a inseminação artificial das cadelas com sêmen congelado-descongelado é oferecida como um serviço clínico rotineiro por muitos veterinários, inclusive muitos criadores anunciam em sites a disponibilidade do envio de sêmen congelado com teste de congelabilidade aprovado para o uso em cadelas. Apesar de todos esses avanços, a inseminação artificial com sêmen congelado-descongelado costuma resultar em taxas de gestação e tamanho das ninhadas menores quando comparado ao uso do sêmen fresco (LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1993). Nesse sentido, inúmeros pesquisadores têm buscado estabelecer um padrão de resfriamento, congelação e descongelação ideal, associado a um diluidor que seja eficiente, de fácil preparo e de baixo custo.

Desse modo, justifica-se a utilização do diluidor à base de água de coco para a congelação do sêmen de cães, haja vista a abundância de matéria prima para o mesmo na região nordeste do Brasil. Entretanto, existem ainda poucos trabalhos acerca desse assunto, sendo necessário um aprimoramento do protocolo de uso do diluidor ACP®. Assim, é possível que sejam obtidos resultados superiores aos atualmente descritos na literatura através do emprego de uma adequada taxa de descongelação e de um tempo de equilíbrio ideal para a congelação do sêmen de cães. A verificação dessas variáveis será um passo importante visando o aperfeiçoamento do ACP® como diluidor para o sêmen de cães, no sentido de uma futura aplicação comercial e uso em larga escala.

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

• O tempo de equilíbrio de 1h a uma temperatura de 4°C após a glicerolização favorecerá a obtenção de melhores resultados.

• A descongelação do sêmen por meio de temperaturas mais altas e por um curto período melhorará a qualidade espermática pós-descongelação.

5. OBJETIVOS