UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA

VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA

Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base

de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do

tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação

FORTALEZA, CEARÁ

Dezembro, 2007

VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA

Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base

de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do

tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de mestre em Ciências Veterinárias

Área de Concentração: Reprodução e

Sanidade Animal

Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel

Machado da Silva

Co-orientador: Dr. Airton Alencar de

Araújo

FORTALEZA, CEARÁ Dezembro, 2007

Universidade Estadual do Ceará

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

Título do Trabalho: Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação

Autora: Victor Leão Hitzschky Madeira

Defesa em: 20/ 12 / 2007 Conceito obtido: ________ Nota obtida: ___________

Banca Examinadora

______________________________________ Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva

Universidade Estadual do Ceará

Orientadora

______________________________________ Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo

Universidade Estadual do Ceará

Co-Orientador

______________________________________ Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva Universidade Federal Rural do Semi-Árido

DEDICATÓRIA

Dedico a minha namorada Cynthia Levi Baratta pelo apoio incondicional durante as minhas atividades do mestrado e em todos os outros momentos desde que tive a sorte de tê-la novamente ao meu lado.

HOMENAGEM

Aos meus pais, Germano Hitzschky Madeira e Maria Ângela Leão Hitzschky Madeira, por me reservarem credibilidade e incentivo, nunca pondo barreiras frente ao meu crescimento intelectual.

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo privilégio de sempre ter tido condições de enfrentar os desafios e conseguir crescer a cada dia, pois a mim nunca faltaram saúde, alimento, moradia e o amor de meus familiares.

Aos meus pais pelo amor incondicional e pelo esforço constante de oferecer aos filhos o que tem de melhor.

Aos meus irmãos, Daniel Leão e Germano Leão, pela amizade e companheirismo. A minha namorada Cynthia Levi Baratta por todo o bem que tem me feito, sempre presente na minha vida, seja me ajudando nas madrugadas estressantes do experimento ou nas madrugadas sorridentes escutando Chico Buarque ao lado das minhas cadelas Alcione e Iara e da minha gata Rainha.

À minha orientadora, Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva, pela paciência, pelos ensinamentos e por acreditar em mim, sempre dando oportunidade de me tornar um profissional e uma pessoa melhor. Jamais esquecerei sua inestimável colaboração na minha formação profissional e pessoal.

Ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo, pela importantíssima ajuda na análise estatísca dos resultados e ao Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva que sempre foi muito prestativo.

A todos os que fazem o Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Ao Laboratórios de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino por permitir o uso de equipamentos necessários para que fosse realizado a análise do sêmen auxiliada por computador.

À ACP Biotecnologia na pessoa da Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pelo fornecimento do diluente ACP® 106, objeto de estudo deste trabalho.

A Funcap, pelo apoio financeiro indispensável ao desenvolvimento das atividades relacionadas ao mestrado.

A todos os colegas do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos por tudo que me ensinaram e pela excelente convivência.

Aos estagiários do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos Ricardo Parente Jucá, Ângela Cristina de Oliveira e Áurea Helena Rocha Lima pela solicitude durante a execução dos experimentos.

A companheira de trabalho e amiga Claudia da Cunha Barbosa que sempre esteve disposta a me ajudar e com certeza foi uma pessoa fundamental para realização dos meus experimentos e dessa dissertação.

À minha grande amiga Iracelma Julião de Arruda por sua amizade e por sempre está do meu lado quando preciso.

Ao colega doutorando Daniel Couto Uchoa e ao handler profissional Oiran Filho pela concessão dos animais para a realização dos experimentos.

A todos os animais que fizeram parte do experiemento, pois eles são sem dúvida alguma as figuras mais importantes de toda essa dissertação.

As minhas cadelas Alcione e Iara e a minha gata Rainha pelo amor desinteressado e pela maravilhosa companhia em todos os momentos.

Um agradecimento especial ao meu inesquecível cão Lambão in memorian responsável pelo rumo que optei traçar na minha vida, pois há dez anos atrás lambão precisou fazer uma ultra-sonografia com a Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva e desde então resolvi que faria parte do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos.

RESUMO

Devido ao crescente interesse de criadores de cães em resguardar o potencial genético daqueles animais de alto valor zootécnico e afetivo, vários pesquisadores têm se dedicado ao estudo de técnicas que viabilizem a conservação de sêmen por longos períodos sem comprometer, no entanto, a sua capacidade de fertilização.Dessa forma, esse este trabalho foi dividido em dois experimentos que tiveram como objetivo geral aperfeiçoar o protocolo de congelação do sêmen canino utilizando-se um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) e mais especificamente, no 1° experimento testou-se diferentes taxas de descongelação e, no 2° verificou-se o efeito do tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização.Para tanto, 20 ejaculados de 15 cães foram processados, sendo 10 para cada experimento. A fração espermática foi diluída em ACP-106® contendo 20% de gema de ovo e submetida ao resfriamento a 15°C/40min e 4°C/30 min. Posteriormente, o ACP-106® acrescido de gema de ovo e glicerol foi adicionado ao sêmen diluído (glicerolização). No experimento 1, a primeira alíquota foi descongelada a 37°C/1min, a segunda a 75°C/8s e a terceira a 55°C/5s. No experimento 2, após a glicerolização, a primeira alíquota não foi equilibrada(G0h), a segunda o foi por 1h (G1h) e a terceira por 2h(G2h) para só então serem congelados. Foram avaliados os seguintes parâmetros: volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste hipoosmótico e no caso do experimento 2 foi realizado a CASA.Pela análise dos resultados do sêmen a fresco, observou-se que em ambos os experimentos os parâmetros avaliados apresentavam-se dentro da normalidade para a espécie canina. Com relação ao experimento 1 a motilidade pós-descongelação demonstrou uma diferença entres as três taxas de descongelação, sendo que a taxa de descongelação de 55°C/5s apresentou os melhores resultados por até 30min após a descongelação. Com relação ao vigor as taxas de descongelação 55°C/5s e 37°C/60s foram as que apresentaram os melhores resultados. No tocante as alterações morfológicas, acrossomas intactos, membranas funcionais e pH não houve diferenças entre os tratamentos. Para o experimento 2, após a descongelação, a motilidade total e progressiva e espermatozóides com velocidade média de G2h foram superiores ao G0h, enquanto que o G1h não diferiu nem de G0h, nem de G2h. Na VAP médio e espermatozóides com velocidade rápida, o G2h foi superior ao G0h com 30min após a descongelação. O VAP rápido, bem como as alterações morfológicas, acrossomas intactos e pH não diferiram entre os grupos. Na termoresistência, houve uma queda a partir dos 30min para a maioria dos parâmetros. No teste hipoosmótico, o G2h foi melhor que o G0h e G1h não diferiu de nenhum dos dois. Em vista disso conclui-se que a melhor taxa de descongelação é a de 55°C/5s e que para a congelação do sêmen canino, utilizando-se ACP-106®, deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C

Palavras-chave: sêmen, cão, criopreservação, tempo de equilíbrio, descongelação,

ABSTRACT

Due to the increasing interest of dog raisers to guard the genetic potential of animals with high breeding and emotional values, several researchers have been dedicated to develop techniques which enables the semen conservation for long periods, without compromising its fertilization capacity. The present study was divided in two experiments, aiming to improve the canine semen freezing protocol, using an extender powder coconut water diluter (ACP-106®). The first experiment tested different thawing rates and the second one verified the effect of equilibration times at 4° C after glycerol addition. Being thus, twenty ejaculates from fifteen dogs were processed (ten of each experiment). The sperm rich fraction was extended in ACP-106® with 20% egg yolk, and frozen at 15°C/40min and 4°C/30 min. Then, the extender with glycerol was added. In Experiment 1, the first rate was thawed at 37°C/1min, the second at 75°C/8s and the third at 55°C/5s. In Experiment 2, after the addition of glycerol, the first rate was immediately frozen (G0h) while the second (G1h) and the third (G2h) ones were balanced for 1h and 2h, respectively, before the cryopreservation process. The parameter volume, concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrossomic integrity and hyposmotic test were evaluated. In Experiment 2, CASA was also used. To analyze the results regarding to fresh semen, it was observed that, in both experiments, the evaluated parameter were inside the normality values limits to the canine species. In the Experiment 1, the three thawing rates motility presented differences, being the 55°C/5s rate the one which presented better results until 30min after thawing. Regarding to vigor, the thawing rates 55°C/5s and 37°C/60s presented the best results. There were no differences between groups for the parameters morphologic alterations, intact acrosome, functional membranes and pH. In Experiment 2, after thawing, the total and progressive motility and sperm with an average speed of G2h were higher than G0h, while G1h did not differ neither from G0h nor G2h. The average VAP and sperm with fast speed, the G2h was superior to G0h 30min after thawing. The fast VAP, as well as the morphological alterations, acrossomic integrity and pH did not differ between groups. In thermoresistance test, there was a fall starting at 30min for most parameters. In the hyposmotic test, G2h was better than G0h and G1h did not differ from any of the other two groups. In summary, the better thawing rate was at 5°C/5s. For canine semen freezing, using ACP-106 ®, balance period of 2h after glycerol addition at 4ºC must be included.

Keywords: semen, dog, cryopreservation , tempo de equilíbrio, , equilibration time, thawing,

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% : Porcentagem

µ

< : Menor > : Maior ± : Mais ou menos ≤ : Menor ou igual ≥ : Maior ou igual °C : Graus Celsius µm : Micrômeros

ACP - 106® : Diluente à base de água de coco em pó formulado para a espécie canina ACP®

ALH

: Água de coco em pó

: Amplitude do deslocamento lateral da cabeça ANOVA : Análise de variância

BCF BHT BSA BSP

: Freqüência de batimento da cauda : Hidroxitolueno butirado

: Albumina sérica bovina

: Proteínas obrigatórias dos lipídios

CAPES : Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CASA : Análise de sêmen auxiliada por computador

CLONE : Cryogenics Laboratory of New England

cm : Centímetro

CNPq DMSO

: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico : Dimetilsulfoxido

FAVET : Faculdade de Veterinária

FUNCAP : Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico g h IA HOST : Gramas : Horas : Inseminação artificial : Teste hiposmótico L : Litro

LDL : Lipoproteína de baixa densidade LRC

min

: Laboratório de Reprodução de Carnívoros : Minutos mL : Mililitros mOsmol : Miliosmol MP : Motilidade progressiva MT : Motilidade total Ph s : Potencial hidrogeniônico : Segundos SCA SMI SQA

: Sperm Class Analyser

: Indice de motilidade espermática

: Sperm Quality Analizer

sptz : Espermatozóide

sptz/mL STR TES TTR

: Espermatozóides por mililitro : Retilinearidade

: N-tris-metil2ácido sulfônico aminometano : Teste de termo resistência

TRIS : Tris-hidroximetil-aminometano UECE : Universidade Estadual do Ceará

v/v : Volume a volume

VAP : Velocidade média da trajetória VCL : Velocidade curvilinear

VSL : Velocidade linear

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 Página

Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma intacto do sêmen a

fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. 38

Figura 2. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada do sêmen a

fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. 39

Figura 3. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a

37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. 39

CAPÍTULO 2

Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma normal do sêmen a

fresco e descongelado a diferentes tempo de equilíbrio ( 0h / 1h / 2h) 58

Figura 2. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a

diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h, 2h). 59

Figura 3. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada de amostras do

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1 Página

Tabela 1. Média ± desvio padrão do pH, volume, da concentração, motilidade,

vigor, morfologia e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados). 35

Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação

em três diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

36

Tabela 3. Média ± desvio padrão do vigor espermático entre três diferentes taxas

de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

37

Tabela 4. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e

secundárias da cabeça, peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em relação ao sêmen fresco e aos tratamentos 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.

38

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Média ± desvio padrão da concentração, motilidade, vigor,

espermatozóides normais, alterações morfológicas e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).

54

Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação

em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

55

Tabela 3. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação

em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

55

Tabela 4. Média ± desvio padrão da % de SPTZ com velocidade rápida

pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação

56

Tabela 5. Média ± desvio padrão da % de SPTZ com velocidade média

pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação

56

Tabela 6. Média ± desvio padrão da VAP dos SPTZ com velocidade rápida

30, 60, 90, 120min após a descongelação

Tabela 7. Média ± desvio da VAP dos SPTZ com velocidade média

pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação

57

Tabela 8. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e

secundárias da cabeça. Peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em ralação ao sêmen fresco e aos tratamentos 0h, 1h e 2h.

SUMÁRIO

RESUMO... ix

ABSTRACT... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS... xi

LISTA DE FIGURAS... xiii

LISTA DE TABELAS... xiv

1. INTRODUÇÃO... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA... 3

2.1. Criopreservação do sêmen... 3

2.2. Métodos de avaliação seminal... 5

2.2.1 Motilidade e vigor... 5

2.2.2 Morfologia espermática... 6

2.2.3 Integridade acrossomal... 7

2.2.4. Teste hipoosmótico... 8

2.2.5 Teste de termoresistência... 9

2.2.6 Sistema de análise seminal auxiliada por computador... 10

2.3. O diluente água de coco... 14

2.4. A gema de ovo... 16 2.5. O glicerol... 18 2.6. Tempo de equilíbrio... 21 2.7. Taxa de descongelação... 22 3. JUSTIFICATIVA... 25 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 26 5. OBJETIVOS... 27 5.1. Objetivo Geral... 27 5.2. Objetivos Específicos... 27

6. CAPÍTULO 1. Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino criopreservado em um diluidor à base água de coco em pó (ACP-106®)... 28

7. CAPÍTULO 2. Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino diluído em ACP - 106® e criopreservado a – 196°C... 46

8. CONCLUSÕES... 67

9. PERSPECTIVAS... 68

1. INTRODUÇÃO

O processo de conservação de sêmen ocasiona danos espermáticos, tais como: redução da motilidade e do vigor, aumento das alterações morfológicas, entre outros que implicam na redução da qualidade do sêmen preservado. A fim de minimizar esses danos, foram identificadas substâncias de vital importância na tecnologia do sêmen designados de diluidores (RODRIGUES, 1997).

Alguns pesquisadores têm tentado desenvolver diluidores alternativos que sejam atóxicos, isotônicos, tenham atividade tamponante, sejam de baixo custo, práticos e eficientes. Já há alguns anos, têm sido observados bons resultados na criopreservação do sêmen canino utilizando-se, diluidores à base de água de coco in natura (CARDOSO et al., 2003). No entanto, o uso desses diluidores apresenta desvantagens, como a baixa disponibilidade dos frutos com características ideais para a sua fabricação e a impossibilidade de conservação por longo período da água de coco em sua forma in natura. Ademais, a constituição bioquímica de um fruto costuma ser bastante diferente dos demais, o que pode diretamente influenciar a criopreservação da água de coco. Diante dessa problemática, novas pesquisas foram conduzidas no intuito de se desenvolver a água de coco sob a forma de pó (ACP®). A forma em pó apresenta os mesmos constituintes bioquímicos da forma in natura, porém é padronizada e mais fácil de ser conservada, o que facilita sua comercialização para regiões onde o fruto não existe.

Resultados iniciais comparando a água de coco na forma in natura e em pó mostraram que ambas são similarmente eficientes na criopreservação de sêmen canino (CARDOSO et al., 2004). Entretanto, esses resultados podem ainda ser melhorados, haja vista que o protocolo de conservação no uso do diluidor ACP® precisa ainda ser aprimorado.

Diversos fatores podem interferir no sucesso da congelação de sêmen. Dentre estes, destaca-se o tempo de equilíbrio. Segundo WATSON (1979), o tempo de equilíbrio seria importante, tanto para permitir a entrada do glicerol na célula espermática, como para permitir que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram em maior grau. Para a congelação do sêmen canino com o diluidor ACP®, os poucos trabalhos acerca do assunto não fazem uso de um tempo de equilíbrio e preconizam a exposição do sêmen aos vapores de nitrogênio, imediatamente após a glicerolização. Desse modo, é

possível que a alteração do protocolo, através da inclusão de um tempo de equilíbrio após a glicerolização possa incrementar os resultados pós-descongelação.

Outra fase crítica da criopreservação de espermatzóides é a metodologia aplicada na descongelação, pois sabe-se que essa fase é responsável por vários danos às células. Atualmente, existem vários protocolos preconizando diferentes temperaturas de descongelação para o sêmen canino, as quais variam desde 37ºC por um minuto (SILVA et

al., 1998) a 98ºC por 6,5 segundos (NOTHLING et al., 2007). Convencionalmente, o

protocolo de congelação de sêmen canino com o ACP® preconiza a descongelação a 37ºC (CARDOSO et al., 2004) por 1 minuto. Porém, não existem informações acerca da aplicação de outras temperaturas de descongelação no uso deste diluidor para o sêmen de cães.

2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Criopreservação do sêmen

A criopreservação do sêmen é uma biotecnologia de extrema utilidade para criadores de cães. Dentre as principais vantagens dessa biotécnica pode-se destacar o fato de que é possível armazenar o material genético de animais de alto valor zootécnico por um período ilimitado, transmitindo as características desses animais por várias gerações mesmo após a morte do animal. Além disso, a inseminação artificial (IA) com sêmen congelado elimina os riscos de transmissão de algumas doenças sexuais, evita o estresse do animal com o transporte e permite o aproveitamento de machos velhos ou cães que apresentam doenças adquiridas que não estejam aptos a realizar a monta natural (STOCKNER, 1995).

ROWSON em 1954 foi quem primeiro obteve sucesso na criopreservação do sêmen de cães, contudo o relato de nascimento de filhotes da espécie canina utilizando sêmen congelado só foi notificado quinze anos mais tarde (SEAGER, 1969). No Brasil, a primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado foi realizada a pouco mais de 20 anos, tendo sido obtida uma ninhada de seis cães normais da raça Boxer (VASKE et al., 1981).

A -196°C (temperatura do nitrogênio líquido) não existe água na forma líquida, de tal forma que o ambiente celular é altamente viscoso e a difusão é insignificante, sendo assim reações químicas não podem ocorrer (MAZUR, 1984). Diante disso, a criopreservação de células vivas se fundamenta no fato de que, teoricamente, após o resfriamento e permanência a temperaturas extremamente baixas, estas células entram em um estado de quiescência, reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a preservação celular e, dessa forma, podem ser mantidas viáveis por longos períodos, de modo que após a descongelação voltariam a desenvolver suas atividades normais (BATEMAN, 2001).

Infelizmente, ainda existem muitos fatores que influenciam na sobrevivência e funcionalidade dos espermatozóides criopreservados. A maioria das alterações causadas pelo estresse térmico se inicia na membrana espermática (JASKO, 1994; HOLT, 2000). A alteração da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou pH podem

determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de fosfolipídios (GENNIS, 1989). A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de 4-5ºC pode levar ao rearranjo inadequado de alguns fosfolipídios da membrana plasmática. Com este rearranjo, as propriedades básicas da membrana biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas não são mantidas, alterando a funcionalidade da membrana em questão (WATSON, 1981; GENNIS, 1989; PARKS E GRAHAM, 1992; AMANN E GRAHAM, 1993; JASKO, 1994; WATSON, 1995; HOLT, 2000; WATSON, 2000). Segundo a revisão de WATSON (2000), existem ainda alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis a alterações de temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor relatou que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias para permitir a aproximação da membrana plasmática e da membrana acrossomal externa, promovendo a exocitose acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma das explicações para a fusão desorganizada das membranas após o resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides.

Com o declínio constante da temperatura, as células estarão expostas à temperatura de congelação (abaixo de 0ºC), e com isto, as células espermáticas serão expostas a alterações de osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio extracelular encontra-se sob a forma de solução e com a congelação de parte desta água, a saturação de solutos aumenta, tornando hipertônico o meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio osmótico seja atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode levá-la a sofrer um efeito deletério devido a grande desidratação e a exposição a um meio extremamente saturado. Este efeito é chamado de Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos no processo de congelação das células espermáticas (MAZUR et al, 1972; WATSON, 1981; WATSON, 1995; HOLT, 2000).

No que diz respeito à metodologia de congelação observa-se que existe uma ampla variedade de protocolos. Em todas as metodologias busca-se minimizar o dano causado ao espermatozóide pelo processamento, visando recuperar um máximo possível de espermatozóides viáveis (STROM et al., 1997). O método de criopreservação de sêmen canino mais usual é aquele descrito por ANDERSEN (1975). Neste método, foi realizada a diluição do sêmen a 37ºC em Tris acrescido de gema de ovo e glicerol. Em seguida, foi procedido um período de equilíbrio de três horas, seguido do envase em palhetas plásticas e a exposição aos vapores de nitrogênio para só então mergulhar as palhetas em nitrogênio

líquido. Segundo HAMMERSTEDT et al. (1990) o processo de criopreservação do sêmen ocorre em 5 fases : 1) diluição e resfriamento; 2) adição do crioprotetor; 3) congelação em nitrogênio líquido; 4) armazenamento e 5) descongelação. Para esse pesquisador os métodos para cada uma destas etapas devem ser desenvolvidos de acordo com a espécie, porque cada etapa impacta de forma decisiva no sucesso da criopreservação.

2.2. Métodos de avaliação seminal 2.2.1. Motilidade e vigor

A motilidade espermática é definida como sendo a porcentagem de espermatozóides móveis. Atualmente a maioria dos pesquisadores ainda utiliza a motilidade como principal parâmetro para a avaliação da qualidade seminal. NOTHLINGH et al. (1997) observaram que a taxa de gestação em cadelas inseminadas com sêmen congelado estaria relacionada principalmente com o número de espermatozóides móveis após a descongelação, contudo o sêmen que apresenta uma boa motilidade após a congelação pode apresentar espermatozóides incapazes de realizar a fecundação em função de danos acrossomais (PURSEL et al., 1972). NOTHLINGH et al. (1997) complementam que, além da qualidade seminal, a detecção do momento ideal para a realização da inseminação é de fundamental importância para o sucesso da inseminação artificial com o uso de sêmen congelado-descongelado.

Este parâmetro deve ser avaliado depositando-se uma gota do sêmen entre lâmina e lamínulas previamente aquecidas a 37°C ( SANTOS & VANNUCCHI, 1997). A amostra é então avaliada em microscópio, no aumento de 100 ou 400x e, de forma subjetiva, será avaliada a porcentagem de espermatozóides móveis. Uma amostra de sêmen normal deve possuir motilidade superior a 70% e, no caso do sêmen congelado-descongelado, CONCANNON & BATTISTA (1989) sugerem, para a espécie canina, uma motilidade acima de 50% como ideal e, acima de 30% como aceitável para se proceder uma inseminação artificial.

Outro parâmetro importante para avaliação da qualidade espermática e que deve ser avaliado conjuntamente à motilidade é o vigor. Este parâmetro é definido como sendo a velocidade de progressão do espermatozóide onde é atribuído uma nota que varia de 0 a 5

(DOBRINSKY et al., 1993). A presença de vigor 0 indica que o espermatozóide está imóvel, e o vigor 5 indica que o espermatozóide apresenta um movimento flechante e retilíneo. Cães normais devem apresentar vigor espermático superior a três (progressão moderada pra frente) (DOBRINSKY et al., 1993).

2.2.2. Morfologia espermática

Um parâmetro de fundamental importância para avaliação da qualidade espermática é a análise da morfologia das células, uma vez que, espermatozóides com alterações morfológicas comprometem de forma significativa a fertilidade de machos tanto da espécie canina como de outras espécies animais (OETTLÉ, 1993). Alguns estudos correlacionam porcentagem de defeitos espermáticos e infertilidade no cão sendo reconhecido que 80% ou mais dos espermatozóides no ejaculado devem ser livres de alterações estruturais (ROOT E JHONSTON, 1994). OETTLÉ (1993) relatou que, na espécie canina, à medida que se aumenta o percentual de espermatozóides anormais, a fertilidade é reduzida, sendo observado que, quando a proporção de espermatozóides morfologicamente normais estava abaixo de 60%, a fertilidade foi adversamente afetada.

Para a análise das alterações morfológicas existem dois principais métodos de classificação. Um deles divide as alterações morfológicas em primárias e secundárias (JOHNSTON et al., 2001). Segundo SEAGER (1986) as alterações morfológicas primárias são aquelas relacionadas com problemas oriundos da espermatogênese, já as secundárias estão relacionadas a problemas oriundos da maturação espermática no epidídimo ou durante as fases de manipulação do sêmen, como colheita, diluição, resfriamento, congelação, descongelação ou ainda após febre, trauma, processo infeccioso e administração de glicocorticóides. O outro método de análise das alterações morfológicas classifica os espermatozóides como apresentando defeitos maiores ou menores (OETTLÉ, 1993). Os defeitos maiores são aqueles que comprometem gravemente a fertilidade, enquanto que os menores são considerados defeitos de menor gravidade (OETTLÉ & SOLEY, 1988). Tanto um método quanto o outro podem analisar as alterações de acordo com a sua localização, ou seja, cabeça, peça intermediária e cauda (SEAGER, 1986; OETTLÉ, 1993).

Para a visualização da morfologia espermática existem vários métodos disponíveis. Um deles é a realização de esfregaços de sêmen fixados com glutaraldeído ou

tampão salina formolizada para manter as características celulares e permitir uma observação futura sendo então examinados por microscopia de contraste de fase (CBRA, 1998). A morfologia também pode ser avaliada microscopicamente, após o uso de corantes Wright, Rosa de Bengala, Diff-Quik, Spermac_ (PURSWELl et al., 1992; OETTLÉ & SOLEY, 1985; STRÖM et al., 1997), Giemsa (CARDOSO et al., 2003), Hematoxilina-eosina (SILVA et al., 2003) e eosina-nigrosina (PEÑA, 2000).

2.2.3. Integridade Acrossomal

De nada adianta uma amostra de sêmen que apresente uma porcentagem alta de espermatozóides morfologicamente normais e excelentes motilidade e vigor se os acrossomas encontram-se com algum tipo de alteração que comprometa sua funcionalidade, pois para a ocorrência da fecundação é indispensável que esta estrutura seja capaz de realizar a reação acrossômica.

O acrossoma é uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas, incluindo pró-acrosina, hialuronidase, esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de fecundação (GARNER & HAFEZ, 1995), desempenhando um papel crucial na função espermática (CARDOSO et al., 2005).

O armazenamento do sêmen a baixas temperaturas acarreta variadas alterações nas membranas dos espermatozóides, principalmente no acrossoma. Por esse motivo a observação da integridade do acrossoma é fundamental quando se faz necessária a conservação do sêmen. Em sêmen de coelho foi encontrado correlação significativa entre integridade acrossomal e os resultados de fertilização, mas a correlação não foi significativa entre fertilização e motilidade espermática (HELLEMANN, 1976; WEITZE, 1977). No cão foi encontrada relação entre motilidade espermática e integridade acrossomal no sêmen fresco não diluído, o que não foi observado em amostras de sêmen diluído e congelado (OETTLE,1986). PACE et al. (1981), estudando sêmen bovino, observaram correlação positiva entre fertilidade e atividade da acrosina e foi observada em sêmen canino fresco, diluído e congelado a correlação positiva entre fertilidade e integridade acrossomal (FROMAN et al., 1984).

2.2.4. Teste hipoosmótico (HOST)

O HOST baseia-se na observação de que um espermatozóide, com uma membrana celular íntegra, se colocado em solução hipoosmótica, permite a passagem da água pela membrana celular até o restabelecimento do equilíbrio osmótico entre os fluidos extra e intracelulares (SANTOS et al., 2001). Com o influxo da água para o interior da célula, há um aumento do volume celular (edema), com posterior enrolamento da cauda (JEYENDRAN et

al., 1984).

VON KOLLIKER (1856) apud PINTO & KOZINK (2007), estudando a fisiologia do sêmen de diversas espécies de mamíferos, relatou primeiramente que os epermatózoides expostos à água tornam-se imóveis e edemaciados, um fenômeno que poderia ser invertido colocando os espermatozóides imóveis em soluções capazes de repor a isotonicidade (soluções salinas, plasma seminal ou soro). DREVIUS (1963) relatou que as caudas de espermatozóides de touros enrolavam quando estes eram expostos a soluções hipotônicas, um fenômeno documentado também para o sêmen de coelho e do ser humano (DREVIUS & ERIKSSON, 1966). Segundo estes autores, o aumento no volume sofrido pelo espermatozóide exposto a condições hipoosmóticas ocorre com um mínimo de aumento na sua área superficial. Assim, após a expansão da membrana plasmática da sua cauda, os filamentos axiais flexíveis iniciam um processo de enrolamento, conferindo uma aparência mais esférica a célula espermática.

Até então não era atribuída nenhuma aplicabilidade do HOST para indicar a capacidade funcional da membrana dos espermatozóides e isso só foi feito posteriormente por JEYENDRAN et al., (1984). Nesse trabalho, o grau de resposta do espermatozóide quando em um meio hiposmótico foi correlacionado com a habilidade da célula de penetrar oócitos de hamsters. Em um estudo subseqüente, concliu-se que a resposta do espermatozóide a um meio hiposmótico era um indicativo da capacidade de fertilização in vitro em seres humanos (VAN DER VEM et al., 1986).

ENGLAND & PLUMMER (1993) foram quem primeiro realizaram o HOST em cães e relataram o edemaciamento dos espermatozóides caninos em meio hiposmótico. Esses pesquisadores concluíram que o HOST era um método apropriado para avaliar a integridade da membrana podendo dessa forma ser incorporado em análises rotineiras do sêmen, contudo demonstraram não existir correlação entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados

com outros parâmetros, como motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e mortos. Por outro lado recentemente PINTO & KOZINK (2007) concluíram que o HOST resultou em uma correlação significativa com a motilidade e viabilidade do sêmen fresco e congelado-descongelado. INAMASSU et al., (1999) demonstraram que existe correlação entre a turgidez espermática e a morfologia espermática em resposta ao HOST.

JEYENDRAN et al. (1984), ao descreverem a utilização da técnica para avaliação do espermatozóide humano, testaram soluções com osmolaridades que variaram de 50 a 300 mOsmol, obtendo os melhores índices de reação espermática ao teste ao utilizarem soluções a 150 mOsmol/L, ou menos. Os mesmos autores também testaram diferentes solutos (citrato de sódio, sucrose, melitose, frutose e cloreto de sódio) e associações entre eles, e verificaram que a taxa de reação espermática variava de acordo com a solução usada, dentro da mesma faixa de osmolaridade. Esses pesquisadores obtiveram os melhores resultados com a utilização da associação entre citrato de sódio (50%) e frutose (50%) a 150 mOsmol/L, incubada por 30 minutos a 37°C, razão por que escolheram esse protocolo como padrão para todos os outros experimentos a serem realizados futuramente. Quando o edemaciamento do sêmen canino foi avaliado pelo teste hipoosmótico, recomendou-se a incubação do sêmen em meio hipoosmótico por 30-60 minutos (ENGLAND & PLUMMER, 1993; KUMI-DIAKA, 1993; KUMI-DIAKA & BADTRAM, 1994; RODRIGUEZ-GIL-GIL et al., 1994), contudo em um estudo mais recente, PINTO & KOZINK (2007), observaram que tanto faz incubar o sêmen em meio hipoosmótico por 1min ou por 60min . INAMASSU et al., (1999), recomendaram como protocolo pra realização do teste a mistura de 0,1 mL do sêmen em 0,9 mL da solução hipoosmótica (150 mOsmol). HISHINUMA & SEKINE, 2003 utilizaram água destilada como uma solução hipoosmótica e concluiram que essa solução seria adequada para realização do teste.

2.2.5. Teste de termoresistência (TTR)

O teste de termoresistência (TTR) foi proposto por DIMITROPOULOS (1967), para a avaliação do potencial de fertilidade do sêmen congelado de bovinos, sendo adaptado posteriormente para outras espécies. Esse teste consiste na incubação, em banho-maria, de uma amostra de sêmen descongelado, a uma temperatura e por um tempo pré-determinado, de acordo com a espécie animal.

Geralmente a motilidade espermática e o vigor espermático são as variáveis analisadas durante a execução do teste (BITTENCOURT, 2006), mas caso seja possível a realização de análise computadorizada, outros parâmetros também podem ser avaliados.

O TTR obteve grande aceitação, pois submete o sêmen a condições de temperatura semelhantes à que fica exposto no trato genital de fêmeas em estro, demonstrando e testando a capacidade de resistência do sêmen pós-inseminação (BITTENCOURT, 2006) e segundo DIMITROPOULOS (1967), esse teste apresentou uma correlação positiva e altamente significativa com a fertilidade a campo em bovinos.

No tocante a realização desse teste na espécie canina, STRÖM et al. (1997) relataram que a termorresistência pós-descongelação pode ser mais baixa para o espermatozóide canino, do que para outras espécies. Além disso, observaram que o espermatozóide canino mesmo com uma baixa termorresistência não tem, necessariamente, um baixo potencial fertilizante, visto que o sêmen congelado, com o método CLONE, apresentou uma baixa termorresistência e mostrou índices de fertilidade de 59,3% e 86,4%, após inseminação vaginal e intra-uterina, respectivamente (GOVETTE et al., 1996). Por todos esses motivos, OLAR (1984) sugere que a avaliação da motilidade imediatamente após a descongelação pode ser mais importante do que a sobrevivência espermática após um longo período de incubação.

De acordo com os resultados obtidos por esses pesquisadores percebe-se que é duvidoso relacionar o TTR com a fertilidade do sêmen canino. O argumento de que esse teste mimetiza o trato genital das fêmeas não é de todo verdade, visto que a única variável em comum é a temperatura. Sendo assim é bem provável que o ambiente do trato genital da fêmea seja incomparavelmente mais adequado para sobrevivência dos espermatozóides. Em vista disso, fazem-se necessários mais estudos para que se possa saber até que ponto se avalia com segurança a fertilidade do sêmen por meio desse teste.

2.2.6 Sistema de analise seminal auxiliada por computador (CASA)

Até recentemente, a microscopia óptica tem sido usada rotineiramente para avaliar os parâmetros principais do sêmen do cão, sendo esta uma avaliação subjetiva baseada na avaliação dos parâmetros motilidade, vigor, concentração espermática e anormalidades

morfológicas. Porém, este método clássico, apresenta limitações como a subjetividade e a variabilidade (OETTLE et al., 1993, IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a), além de ser influenciada pela temperatura e pelas habilidades do avaliador, levando a uma elevada variabilidade entre os laboratórios e os observadores ( IGUER-OUADA & VERSTEGEN et

al., 2001b). A qualidade da avaliação depende da qualidade do microscópio, da experiência

do observador e da técnica de fixação e coloração utilizada para análise de morfologia (PEÑA & LINDE-FORSBERG et al.,1999; PEÑA et al., 1999 ).Uma fonte adicional da variação do laboratório é o número relativamente baixo dos espermatozóides analisados com estas técnicas convencionais (PEÑA et al., 1998).

As variações relatadas na estimação da motilidade espermática (MORTIMER et

al., 1986) e dos parâmetros morfológicos (BAKER et al., 1987; KRUGER et al., 1995) do

mesmo ejaculado avaliado por observadores diferentes implicam uma necessidade absoluta para métodos objetivos e padronizados, para as finalidades clínicas e das pesquisas reprodutivas (IGUER-OUADA & VERSTEGEN , 2001b; SMITH & ENGLAND, 2001 ). Isto conduziu ao desenvolvimento de diversos dispositivos de medição semi-computarizado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a, ENGLAND & ALLEN, 1990; RIJSSELAERE et

al., 2002) e computarizado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b; RIJSSELAERE et al., 2003, 2004; SMITH & ENGLAND, 2001) para a avaliação da qualidade do sêmen

canino.

A análise seminal auxiliada por computador (CASA) foi primeiramente proposta por DOTT & FOSTER há 20 anos e é usada atualmente em diversos centros andrológicos humanos e veterinários. Sua primeira descrição para a análise seminal do cão foi relatada por GÜNZEL-APEL et al., (1993) e atualmente tem sido utilizada por diversos pesquisadores (RIJSSELAERE et al., 2003, SCHÄFER-SOMI & AURICH, 2006; ROTA et al., 2006; SILVA, 2005).

AMANN & KATZ (2004) definiram a análise de sêmen assistida por computador (CASA) como um sistema automatizado que visualiza, digitaliza e analisa imagens sucessivas dos espermatozóides, fornecendo informação acurada e precisa que se baseia na avaliação individual do espermatozóide, calculando, de forma rápida, diferentes parâmetros seminais, tais como a motilidade total, motilidade progressiva, linearidade e vários parâmetros de velocidade como: a velocidade curvilinear (VCL) que é a velocidade da trajetória real do

espermatozóide, velocidade média da trajetória (VAP) , que é a velocidade média da trajetória do espermatozóide, velocidade linear (VSL), que é a velocidade em função da linha reta estabelecida entre o primeiro e último ponto da trajetória do espermatozóide (RIJSSELAERE

et al., 2003; IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001) (figura 1), amplitude do deslocamento

lateral da cabeça (ALH) definida como o deslocamento médio da cabeça do espermatozóide em sua trajetória real em relação à trajetória média ou linear, freqüência de batimento cruzado (BCF) definida como freqüência que a cabeça do espermatozóide atravessa a trajetória média. e retilinearidade (STR) definida como a relação percentual entre VSL e VAP.

Além destas avaliações, o CASA realiza a subdivisão das populações espermáticas de acordo com a categoria de seus movimentos, em rápidos, médios, lentos e espermatozóides estáticos (RIJSSELAERE et al., 2007), e ainda permite a avaliação da morfologia e concentração espermática (RIJSSELAERE et al., 2005).

Durante a última década, diversos sistemas comerciais do CASA ( videomicrografia computadorizada CellSoft, analisador do movimento das células de Strömberg-Mika, Hobson Sperm Tracker, e Hamilton-Thorne-Thorne), baseados predominantemente na avaliação individual do espermatozóide, foram validados para o uso nos cães (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a ,2001b,. SMITH & ENGLAND, 2001, GÜNZEL-APEL, 1993, RIJSSELAERE et al., 2003). Diversos estudos encontraram correlações elevadas entre a motilidade, a motilidade progressiva e a concentração calculada

com auxilio do computador e a avaliação microscópica óptica convencional (GÜNZEL-APEL, 1993, RIJSSELAERE et al., 2003 IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b). Os problemas principais destes dispositivos de medição computarizados são os custos de investimento elevados e a necessidade de padronização e validação do sistema antes que todo o uso prático esteja possível (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b, RIJSSELAERE et

al., 2003, SMITH & ENGLAND, 2001). No entanto, há disponível um equipamento com um

preço mais acessível, o analisador de qualidade espermática (Sperm Quality Analyzer-SQA, United Medical Systems Inc., Santa Ana, CA, USA), que já foi validado para a avaliação do sêmen canino criopreservado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a, 2001b). Esse equipamento registra variações na densidade óptica, convertendo essa informação, por cálculos matemáticos, em um índice de motilidade espermática (SMI). Tal procedimento mostrou uma boa repetibilidade de resultados em amostras seminais de boa e ótima qualidade, observando altas correlações entre vários parâmetros seminais (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001).

Em cães, as alterações significativas das características da motilidade medidas por sistemas de CASA foram descritas devido à diluição da amostra do sêmen (RIJSSELAERE et

al., 2003, SMITH & ENGLAND, 2001), do diluente usado (RIJSSELAERE et al., 2003,

SMITH & ENGLAND, 2001), da temperatura da análise (SMITH & ENGLAND, 2001) e da câmara de contagem (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b). Uma vez que estes sistemas foram padronizados, um grau elevado de repetibilidade pode ser conseguido com coeficientes de variação inter- e intra ensaios <12% para maioria dos parâmetros (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b ; SMITH & ENGLAND, 2001).

RIJSSELAERE et al (2003) avaliando o emprego da análise computadorizada para sêmen de cães afirmaram que sem a atenção aos ajustes técnicos, sobreduto da padronização e do processamento do sêmen, os sistemas do CASA podem fornecer dados enganadores ou errôneos. Entretanto, uma vez que o sistema é padronizado para espécie, podem oferecer uma análise rápida e objetiva de um grande número de espermatozóides, e podem gerar uma caracterização muito detalhada da dinâmica espermática. Além disso, este dispositivo melhora significativamente a exatidão e a precisão de métodos subjetivos existentes da análise do sêmen do cão e faz a comparação entre laboratórios possível.

SILVA (2005), verificou uma relação significativa entre padrões de motilidade avaliados pelo CASA: VAP, VSL e freqüência de batimento cruzado (BCF), com interações

in vitro entre espermatozóides caninos congelados/descongelados e oócitos homólogos,

evidenciando assim a utilização do CASA como uma ferramenta auxiliar para avaliação espermática canina.

2.3. O diluente água de coco

Há cerca de duas décadas, a água de coco começou a freqüentar laboratórios de pesquisadores brasileiros interessados no potencial do produto como meio de conservação celular. Aos poucos, percebeu-se que o produto, muito mais que uma bebida saborosa e nutritiva, oferece uma variada possibilidade de utilização nas áreas da medicina, da veterinária, da biologia, entre outras (GALIZA, 2007).

A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da família

Palmae) é uma solução estéril, ácida que corresponde a aproximadamente 25% do peso do

fruto, possuindo um volume de aproximadamente 400 ml e sua composição básica apresenta 93% de água, 5% de açúcares, além de proteínas, vitaminas, sais minerais, fatores de crescimento (fitormônios) e um baixo teor fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). Com composição química semelhante à das bebidas isotônicas, é considerada como um repositor de sais podendo ser utilizada na forma de soro oral ou intravenoso, em casos de cólera, problemas intestinais e estomacais (ANZALDO et al., 1985., MACIEL et al., 1992). O produto sofre mudanças na sua composição durante o desenvolvimento do fruto. Além do grau de maturação, outros fatores como variedade, região e época do ano também têm influência sobre as suas características físico-químicas (JAYALEKSHMY et al., 1984., MACIEL et al., 1992)

Dentre os componentes da água de coco têm-se os açúcares que, no início da maturação, apresentam-se na forma de açúcares redutores (glicose e frutose), cujas concentrações alcançam níveis máximos de 5%, próximo ao 6° e 7° mês, período em que a quantidade de água também é maior. Com a maturação, a concentração de açúcares redutores diminui em até 1%, porém são formados açúcares não-redutores (sacarose), sendo, ao final da maturação, o teor de açúcares totais de, aproximadamente, 2% (CAMPOS et al., 1996, JAYALEKSHMY et al., 1984 apud MAGALHÃES et al., 2005).

A água de coco contém ainda outros compostos que mostram atividades semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas (difeniluréia), possuindo uma ação benéfica na motilidade espermática de espécies como caprinos ovinos e caninos (NUNES & SALGUEIRO, 1999, UCHOA, 2002). O isolamento da citocinina na água de coco foi realizado por LETHAM (1974 apud NUNES & COMBARNOUS, 1995). Depois de várias pesquisas, verificou-se que a auxina principal era o ácido 3-indol-acético (LETHAM, 1974 apud NUNES &COMBARNOUS, 1995).

A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses (variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mOsmol/L e um pH de 4,5 a 5,0 (NUNES & COMBARNOUS, 1995). Para uma perfeita compatibilização da água de coco in natura como diluente para o sêmen canino, deve ser feita uma correção da osmolaridade para 300-310 mOsmol/L e do pH para 6,2 a 6,6 (SILVA, 1999). Para tal correção, após filtrar a água de coco, adiciona-se água destilada e uma solução de citrato de sódio a 5% (NUNES, 1995).

A solução citada anteriormente já foi utilizada com eficiência na congelação de sêmen canino (CARDOSO et al., 2003b). Testando-se alguns outros protocolos, observaram-se melhores resultados (aproximadamente 50% de espermatozóides móveis) utilizando a solução citada anteriormente contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol.

Mesmo com os avanços do processamento da água de coco na forma líquida, a mesma, depois de acondicionada e armazenada não pára seu metabolismo. CAMPOS et al. 1996 observaram a presença das enzimas polifenoloxidase e peroxidase na água de coco verde. Estas enzimas apresentam o máximo de atividade em pH 6,0 e 5,5 e a temperatura de 25°C e 35°C, respectivamente. Sabe-se que estas enzimas podem estar relacionadas com as alterações organolépticas que ocorrem após a extração da água do fruto e que catalisam reações que estão associadas à deterioração de diversos nutrientes (GALEAZZI, 1984). Isso levou o pesquisador José Ferreira Nunes durante as décadas de 80 e 90 à elaboração de um produto genuinamente nordestino à base de água de coco em pó (ACP®).

A grande vantagem da água de coco em pó deve-se ao fato de que uma vez processada, não modifica sua composição até sua utilização, garantindo um “padrão” confiável (GALIZA, 2007)

Tal produto foi registrado como ACP ® (ACP Biotecnologia ®, Fortaleza - Ceará, Brasil). A água de coco em pó, após reconstituição, foi testada para a refrigeração do sêmen de eqüinos (SAMPAIO-NETO et al., 2002), diluição para IA em caprinos (SALGUEIRO et

al., 2002), refrigeração do sêmen de cães (MADEIRA et al, 2004), congelação do sêmen de

cães (CARDOSO et al, 2005) mostrando bons resultados.

2.4. A gema de ovo

A gema de ovo tem sido utilizada para aumentar a habilidade de fertilização do espermatozóide quando presente nos diluidores para o armazenamento do sêmen na temperatura ambiente (DUNN et al., 1950; SHANNON & CURSON, 1983) e parece prevenir danos às células espermáticas durante o resfriamento e congelação (PHILLIPS & LARDY, 1940; DE LEEUW et al., 1993). Entretanto, o mecanismo pelo qual esta proteção é fornecida ao espermatozóide permanece desconhecida. É especulado que a fração lipoprotéica de baixa densidade (LDL) contida na gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide e promova a proteção ao espermatozóide estabilizando a membrana, contudo alguns autores questionam a estabilidade da associação de LDL com a membrana do espermatozóide (WATSON, 1975; FOULKES, 1977; MACDONALD & FOULKES, 1981). Uma segunda hipótese sugere que os fosfolipídios presentes nas LDL protegem os espermatozóides por formar uma película protetora na superfície do espermatozóide (QUINN et al., 1980) ou por substituição dos fosfolipideos da membrana dos espermatozóides que são perdidos ou danificados durante o processo de criopreservação (FOULKES et al., 1980; GRAHAM & FOOTE, 1987). Essa película protetora é formada por esferas de lipoproteínas que contem lipídios neutros de tamanho variável, rodeado de uma capa de lipoproteína composta principalmente de glicoproteínas e fosfolipídios, cujos grupos hidrófobos se orientam para o interior e os grupos hidrófilos para a superfície (EVANS et al., 1973). Um estudo recente mostrou que a fosfatidilcolina da gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide e protege o sêmen do garanhão tão eficientemente quanto a gema de ovo; entretanto, aqueles fosfolipídios não são incorporados na membrana espermática (RICKER et al., 2006). Uma terceira hipótese sugere que as LDLs competem com os peptídeos catiônicos do plasma seminal prejudicial à membrana do espermatozóide e assim protegem os espermatozóides. (VISHWANATH et al.,1992). Recentemente BERGERON & MANJUNATH (2006) descobriram que uma família de proteínas obrigatórias dos lipídeos (proteínas de BSP) presente no plasma seminal do touro interage com a LDL e que esta interação parece ter

efeitos significativos na preservação da integridade do espermatozóide (MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004). Segundo FOULKES (1977), a gema de ovo previne também a liberação da enzima hialuronidase pela célula espermática.

Para a preservação do sêmen canino, uma variedade de concentrações de gema de ovo tem sido utilizada. Visto que a mesma também tem uma capacidade de tampão, sua quantidade no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do diluente (FARSTAD, 1996). As amostras de gema de ovo comumente utilizadas na congelação de sêmen canino são em média 15 – 30% do volume total. Esta variação na concentração é baseada nos resultados obtidos por VAN DEMARK et al., (1957), onde o percentual de espermatozóides móveis após congelação e descongelação foi similar entre estas concentrações. SILVA et al., (2000) constataram uma superioridade do diluidor à base de Tris contendo 20% de gema de ovo em relação a concentração de 10% de gema de ovo quanto aos parâmetros de vigor, alterações espermáticas totais e secundárias. DAVIES (1982) obteve melhores taxas de sobrevivência pós-descongelação incluindo 20% de gema de ovo, frente a 5% (v/v), no entanto, não encontrou diferenças significativas na motilidade pós-descongelação quando comparou taxas de 10 e de 20% (v/v), se bem que, nos resultados absolutos a motilidade pós-descongelação foi superior quando utilizava 20%. LOPES-NETO

et al., (2006) testaram diferentes concentrações de gema de ovo (5%, 10% e 20%) acrescidas

ao diluidor a base de água de coco em pó e não obtiveram diferenças em relação aos parâmetros observados. Nesse contexto, as maiorias dos autores utilizam concentrações de gema em torno de 20% no diluente (FARSTAD & ANDERSEN-BERG, 1989; LINDE-FORSBERG & LINDE-FORSBERG, 1989; SILVA, 2001; MARTINS, 2005).

A gema de ovo, sendo um produto de origem animal, representa um risco potencial de contaminação do sêmen e sua composição não é uniforme. Conseqüentemente, está aumentando o interesse de diluidores livres de produtos da origem animal para armazenagem do sêmen (MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004). Por essas razões, pesquisas visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados foram conduzidas e observaram que os análogos do hidroxitolueno butilado (BHT) são interessantes substitutos para a gema, por também protegerem a membrana plasmática da injúria do choque térmico (FARSTAD, 1996). Estudos recentes mostraram ser possível a purificação das LDL, permitindo sua utilização em substituição à gema de ovo integral (MOUSSA et al., 2002). VARELA JR. et al. (2004) avaliaram o efeito de diferentes concentrações de LDL purificada

adicionada ao diluente Tris para a refrigeração do sêmen do cão a 5ºC e observaram que concentrações entre 6 e 10% de LDL são tão eficientes quanto o uso de 20% de gema de ovo integral. Entretanto, a literatura ainda é escassa de informações quanto ao uso das LDL na tecnologia de sêmen de cães.

Além de sua ação em proteger a membrana espermática, a gema de ovo é também conhecida por servir como uma fonte protéica para o diluente (SANTOS, 2004).

2.5. O glicerol

Para a criopreservação dos espermatozóides faz-se necessário a adição de substâncias que protejam estas células contra os danos oriundos da congelação. Muitos são os compostos de ação crioprotetora, os quais são tradicionalmente classificados como tendo ação intra ou extracelular. Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem os álcoois, etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol e polietilenoglicol (DE LEEUW et al., 1993) e também as amidas, incluindo a acetamida, formamida, lactamida e bem como o dimetilsulfoxido (DMSO) (JEYENDRAN & GRAHAM, 1980; ASHWOOD – SMITH, 1987; MEDEIROS et

al., 2002). Já no grupo de ação extracelular se incluem açúcares, lipoproteínas da gema do

ovo e proteínas do leite (AMANN & PICKETT, 1987) e polivinil-pirrolidona (ENGLAND, 1993).

POLGE et al., (1949), demonstraram a eficácia do glicerol como crioprotetor universal e desde então essa substância vem sendo amplamente utilizada. PARKS & GRAHAM (1992) sugeriram que o glicerol penetra a célula através da difusão passiva, permanecendo tanto na membrana quanto no citoplasma. GRAHAM (1996) verificou que a difusão do glicerol é de 30 a 60 vezes mais lenta que a da água. A primeira conseqüência da adição do glicerol em um meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma rápida saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento retorno ao volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula (HAMMERSTED & GRAHAM, 1990; PEÑA, 1997). O modo pelo qual o glicerol atua não se encontra totalmente elucidado. Acredita-se que a ação protetora deste crioprotetor é atribuída a suas propriedades coligativas e ligantes com a água, diminuindo o ponto de congelação da solução, o qual é determinado como a temperatura onde ocorre a formação dos primeiros cristais de gelo. Numa solução contendo glicerol, no momento em que ocorrer a congelação restará mais água

descongelada do que numa solução sem glicerol, havendo com isso, um aumento do volume dos canais de solvente não congelado e uma menor concentração de sais nesses canais (KEITH, 1998) o que reduz com isso os danos do efeito de solução (PEÑA, 1997; HOLT, 2000).

Apesar de imprescindíveis para a sobrevivência dos espermatozóides no processo de congelação, o glicerol apresenta efeitos tóxicos para estas células (HOLT, 2000a). Por promover a remoção da água intracelular o glicerol acarreta o encolhimento celular e o influxo de íons, no entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente, há o influxo de água podendo ocasionar a ruptura da membrana (HOLT, 2000b). O espermatozóide dos mamíferos comporta-se como um osmômetro linear, ocorrendo morte celular caso haja intumescimento ou encolhimento do mesmo quando submetido a níveis superiores da tolerância osmótica espécie específica. As lesões da membrana plasmática podem também estar relacionadas de maneira secundária ao rápido movimento da água através desta (BALL & VO, 2001). Sua toxicidade pode resultar também na inibição da atividade enzimática (FAHY, 1986), na desnaturação de proteínas e as alterações das interações da actina (FAHY, 1990) e originar danos acrossomais (HOLT, 2000). Segundo HAMMERSTEDT & GRAHAM (1992) o glicerol induz a mudanças nos eventos citoplasmáticos por aumentar a viscosidade ao penetrar a célula espermática, causando alterações na polimerização da tubulina, na associação dos microtúbulos, no balanço bioenergético, além de atuar diretamente de modo prejudicial na membrana plasmática, no glicocálix e nas proteínas de superfície celular. A fusogenicidade da membrana e o padrão de respostas induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas mudanças causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática, podendo este fato contribuir para a diminuição da sobrevivência espermática posterior ao processo de congelação/descongelação e acelerar a capacitação espermática (WATSON, 1995).

No intuito de se conseguir o máximo efeito crioprotetor com o mínimo de efeitos tóxicos, vários pesquisadores vêm testando diferentes concentrações de glicerol no diluidor a fim de determinar a concentração ideal. Segundo ENGLAND (1992) a concentração de glicerol para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%. Para OLAR et al., (1989) e ROTA et al., (1998) os melhores resultados foram obtidos com concentrações variando entre 2 e 8% no volume de sêmen diluído. PEÑA et al., (1998) compararam concentrações de 2, 4, 6 e 8% de glicerol para congelação do sêmen canino, e concluíram que a glicerolização na

proporção de 8% proporcionou os melhores índices de motilidade, viabilidade e morfologia espermática na pós-descongelação. SILVA et al., (2002d) testaram as concentrações de 4, 6 e 8% de glicerol para a congelação do sêmen canino e verificaram que a morfologia espermática era melhor preservada, quando utilizada a concentração de 6%. SANTOS et al., (2003) compararam as concentrações de 4, 6, 8 e 10% de glicerol e concluíram que a crioproteção do glicerol, na concentração de 8% em associação ao diluente a base de Tris-gema preservou melhor as características morfofisiológicas do espermatozóide canino. CARDOSO et al (2003a) testaram as concentrações de 4,6 e 8% de glicerol no diluidor a base de água de coco não observando diferenças em relação aos parâmetros avaliados.

O efeito da temperatura de adição de glicerol tem sido investigado em estudos de criopreservação do sêmen canino. Os agentes crioprotetores penetrantes, particularmente o glicerol, protegem a célula da crioinjúria durante a fase de cristalização que ocorre entre -6° e

-10°C. Dessa forma, não pareceria ser lógico adicionar o glicerol a temperaturas superiores a

30°C (COLAS, 1975). No entanto, ANDERSEN (1975) realizou a adição de um diluente

glicerolizado ao sêmen a 37°C e obteve bons resultados após inseminação artificial. Já PEÑA et al., (1998) não encontraram diferenças entre a adição de glicerol ao sêmen a 37° ou a 4°C.

FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen canino após a descongelação entre a adição do glicerol à temperatura ambiente (25°C) e a

5°C. Em um estudo mais recente JUCÁ et al., (2007) também não observaram diferenças entre a glicerolização a temperatura ambiente em relação a 4°C utilizando um diluidor a base água de coco em pó. Diante disso pode-se concluir que não há problema em promover a glicerolização a temperatura ambiente.

No que diz respeito à forma de adição do glicerol (simples ou fracionada), FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen canino após a descongelação. SILVA et al., (2003) compararam a adição única e fracionada do glicerol ao sêmen, na temperatura de 4ºC e não observaram diferenças entre as mesmas. Da mesma forma LIMA et al., (2007) ao comparar as duas formas de glicerolização em um diluidor à base de água e coco em pó também não encontraram diferenças.

2.6. Tempo de equilíbrio

O tempo de equilíbrio é considerado o tempo total em que os espermatozóides são mantidos em contato com o glicerol e todos os demais componentes do diluidor, previamente à congelação (BITTENCOURT et al., 2006). Durante esse período, ocorre o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular espermático e extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente ativos presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL, 2000). WATSON (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram.

Outro ponto importante atribuído ao tempo de equilíbrio é que a permanência do sêmen a uma baixa temperatura permite uma melhor adaptabilidade dos espermatozóides a essa temperatura, reduzindo com isso, o efeito negativo do choque térmico já que as alterações físicas e químicas na membrana celular causadas pelo resfriamento podem ser irreversíveis (SANTOS et al., 2003). ENGLAND (1992) sugeriu que o sêmen de várias espécies animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação para que desenvolva uma máxima resistência aos efeitos da congelação e concluiu, ainda, que o tempo de equilíbrio pode ser extremamente variável de acordo com o protocolo de congelação/descongelação e, ainda, de acordo com a espécie em questão. Segundo OETTLÉ (1986), um apropriado período de equilíbrio, assim como adequadas taxas de diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações espermáticas durante o processo de criopreservação espermática.

Tempos distintos de resfriamento e equilíbrio, variando de 45 minutos a 5 h, foram relatados para cães (FARSTAD & ANDERSEN BERG, 1989; FERGUSON et al., 1989; FONTBONNE & BADINMD, 1993; NOTHLING et al., 1995; SILVA et al., 1996). OLAR et al., (1989) constataram que a melhor motilidade pós descongelação foi alcançada com o sêmen de cão refrigerado de 37°C a 5°C por 1 h e equilibrado a 5°C por 1 h ou resfriado por 2h e equilibrado a 5°C por mais 2h usando o diluidor Tris-gema contendo 3-4% de glicerol. ENGLAND (1992) encontrou que um tempo de equilíbrio de 4 h a 5°C resultou em melhor motilidade pós descongelação e porcentagem de espermatozóides vivos quando comparada a tempos de equilíbrio de 2 e 6h usando o diluidor Tris/Tes-gema de ovo com 6,5% de glicerol. ROTA (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a 4ºC