2) REVISÃO DA LITERATURA
2.1) Tecido Ósseo: Estrutura e Formação.
Alem de desempenhar o papel de estrutura de sustentação do corpo, o osso tem outras funções como servir de apoio para as contrações dos músculos esqueléticos transformando-as em movimento, proporcionar proteção para as partes moles do organismo e também como reservatório de cálcio, fosfato e outros íons. É formado em cerca de 65% de componente mineral, conhecido como hidroxiapatita, 25% de matriz orgânica e 10% de água (BUSER D, 1994).
A porção mineralizada do osso é composta por envoltórios de periósteo e endósteo, que possuem dois fatores importantes: potencial osteogênico e vascularização abundante, permitindo sua participação nas atividades modeladoras e reparadoras do tecido ósseo.
As células presentes no tecido ósseo são os osteócitos, os osteoblastos e os osteoclastos, que são responsáveis pela constante remodelagem óssea, durante toda a vida do organismo (KATCHBURIAN & ARANA-CHAVEZ, 1999).
Os osteoblastos são as células que formarão o tecido ósseo e estão presentes em todos os locais ativos de formação óssea. Sua função é secretar matriz osteóide que subseqüentemente mineraliza-se (SODEK, 2000) Quando um osteoblasto interrompe a secreção de matriz osteóide e fica encoberto pela matriz calcificada das células adjacentes, ele se torna um osteócito.
Localizados em lacunas no interior da matriz óssea, os osteócitos são células achatadas em forma de amêndoas com inúmeros prolongamentos citoplasmáticos, que
se estendem e se comunicam através dos canalículos, por onde ocorre a difusão dos nutrientes, desempenhando um papel fundamental na manutenção da integridade da matriz óssea (STEVENS, 2001).
Os osteoclastos são células especializadas em decompor matrizes calcificadas e pertencem a uma família de células gigantes, estando localizados em focos de reabsorção óssea (HID, 2003).
A formação do tecido ósseo resulta de uma complexa cascata de ocorrências. Inicialmente ocorre a atração quimiotática dos precursores dos osteoblastos, mediada por fatores locais. Em seguida temos a proliferação dessas, cuja indução mitótica é mediada por fatores de crescimento liberados a partir do tecido ósseo degradado durante o processo de reabsorção. Numa fase mais avançada tem-se a diferenciação dos osteoblastos em células maduras que promovem a síntese de matriz óssea com posterior mineralização (ERIKSEN, 1986).
2.2) Regeneração Óssea.
A regeneração fisiológica pode ser observada em muitos tecidos e sistemas orgânicos que sofrem uma reposição contínua de células, como por exemplo, as células sanguíneas, as células epiteliais, as glândulas e também o endométrio durante o ciclo reprodutivo. Durante a regeneração óssea, o osso cortical (denso) e trabecular (esponjoso) apresentam remodelagem, o que não é observado na cartilagem articular dos adultos, onde raramente ocorre divisão mitótica e a renovação dos componentes da matriz é extremamente lenta.
Quando temos uma lesão ou doença onde há perda de tecidos, o organismo desencadeia uma regeneração reparadora, dando inicio a um processo de cicatrização do local acometido.
Os tecidos apresentam diferentes capacidades de se regenerar após uma lesão. A cartilagem articular é quase sempre substituída por tecido fibroso ou por fibrocartilagem menos diferenciada. Os tecidos conjuntivos altamente diferenciados, como ligamentos e tendões, nunca apresentam um nível original de organização e sempre se restabelecem com uma cicatriz de força mecânica reduzida.
Diferente dos demais tecidos não só na sua estrutura fisioquímica, mas também na sua extraordinária capacidade de reparação e remodelação, o osso retorna completamente a sua estrutura e função originais depois de lesado, sem deixar cicatriz (SCHENK, 1994; SZACHOWICZ, 1995; HOLLINGER, 1996).
O processo de reparação ocorre da mesma forma que o crescimento e desenvolvimento ósseo, onde uma lesão inicial desencadeia uma seqüência contínua de eventos celulares, terminando com a completa remodelação sem deixar cicatriz, sendo esse processo semelhante à ossificação intramembranosa ou endocondral (BOSTROM, 1998; JUNQUEIRA, 2002).
2.3) Regeneração Óssea Guiada
A regeneração óssea guiada (ROG) consiste no uso de uma barreira mecânica para promover a formação óssea e impedir a invasão de tecidos competidores não osteogênicos (MUZALFER, 2004).
Vários estudos apresentam o uso da ROG no tratamento do reparo ósseo causado por eventuais patologias ou traumas (MACEDO, 2003).
Como a ROG pode ser aplicada em defeitos ósseos cirúrgicos, ela também constitui um bom modelo para o estudo da reparação óssea. Esses desfeitos cirúrgicos são menos sujeitos aos fatores mecânicos e obstruções do suprimento sanguíneo em relação às fraturas e por isso têm sido amplamente utilizados em estudos com animais experimentais, buscando uma melhor regeneração óssea através da aplicação de diferentes materiais de enxerto (SCHENK, 1984; JUNQUEIRA, 2002).
Inicialmente, o uso de membranas como barreiras foi estudado por Hurley e Boyne e posteriormente as membranas foram aplicadas para promover a regeneração periodontal, sendo um método testado em diferentes tipos de defeitos ósseos e ao redor de implantes dentais (BUSER, 1993).
A neoformação em defeitos cirúrgicos se baseia em dois princípios básicos: osteoindução e osteocondução.
O termo osteoindução tem sido usado para descrever o processo de diferenciação de células osteoprogenitoras em condroblastos e osteoblastos. Na osteocondução, um material condutivo serve como um substrato para novas formações ósseas, auxiliando as células durante a ocupação do local a ser regenerado (OSTRUM, 1994).
A indução óssea pode ser obtida por dois processos: um mediado por células e outro mediado por fatores de crescimento. No primeiro, células mesenquimais indiferenciadas osteogênicas, colhidas da medula óssea, são colocadas na parede do defeito ósseo, pois estas células induzem a neoformação óssea, inclusive quando depositadas em ambiente não ósseo (SANDEBERG, 1993; LIND, 1998). No segundo,
fatores de crescimento específicos, denominados proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), são capazes de estimular a proliferação das células mesenquimais indiferenciadas osteoprogenitoras e a sua migração, reagregação e diferenciação em osteoblastos, com conseqüente deposição de matriz óssea (URIST, 1965; REDDI, 1986). As BMPs podem ser aplicadas isoladamente ou em associação com matriz óssea ou matriz dentinária, e estimular uma extensa osteoindução em defeitos ósseos (WOZNEY, 1992; CATANZARO GUIMARÃES, 1993; GONÇALVES, 1997).
Durante a osteocondução, a neoformação óssea pode ser auxiliada por materiais com estrutura especializada, que atuam como um arcabouço de sustentação para a penetração de células ósseas. O material implantado serve de ancoragem para o crescimento de capilares, tecido perivascular e células indiferenciadas osteoprogenitoras originadas no leito ósseo cirúrgico, mas também deve impedir que tecidos não osteogênicos invadam o local a ser reparado.
A utilização de membranas como barreiras à proliferação de fibroblastos para o interior do defeito ósseo permite um tempo adicional para as células osteogênicas repovoarem a área do defeito, desencadeando com eficiência a neoformação óssea (BUSER, 1994; GOMES, 1998; SCHLEGEL, 2000).
MURRAY (1957), relatou o uso de barreiras mecânicas para isolar um sítio anatômico e direcionar a regeneração da área. O autor removeu um fragmento do osso ilíaco de cães e recobriram o defeito com material plástico, rígido o suficiente para manter um espaço entre o tecido ósseo e a face interna do material. Após dez semanas verificaram crescimento de tecido ósseo com as características histológicas próprias deste tecido.
2.4) Polímeros
Dentre os biomateriais de interesse atual, destacam-se os polímeros como as resinas de poliuretano que são produtos sintetizados a partir de moléculas de ácidos graxos vegetais.
Algumas propriedades devem ser consideradas quando se deseja explorar os polímeros para o reparo ósseo, tais como a composição e estrutura do polímero, que devem ser adequadas às finalidades específicas, como também a biodegradação dada por ligações químicas susceptíveis à hidrólise, quando expostas aos fluidos corporais (WILLIANS, 1983).
Em 1994, o Grupo de Química Analítica e Tecnologia de Polímeros da Universidade de São Paulo no campus de São Carlos, por intermédio do Professor Gilberto Chierice, iniciou uma pesquisa para o desenvolvimento de um novo poliol derivado da poliuretana da mamona. A mamona, além de ser encontrada em grande quantidade no território brasileiro, apresenta um grande potencial óleo–químico, podendo garantir o fornecimento de polióis e pré-polímeros a partir de ácidos graxos. Esta equipe constatou que a poliuretana da mamona pode ser utilizada na forma pura ou em associação com o carbonato de cálcio, que facilitaria as trocas iônicas na interface osso-resina, aumentado os níveis de dissolução celular e facilitando sua degradação (SOARES, 1994).
A poliuretana, derivada do óleo da mamona, apresenta uma forma molecular que tem mostrado certa compatibilidade com os tecidos vivos, apresentando aspectos favoráveis de processabilidade, flexibilidade de formulação, versatibilidade da curva de temperatura e controle de pico exotérmico na transição líquido/gel, excelentes
propriedades estruturais, ausência de emissão de vapores tóxicos, bom poder de adesão, não liberação de radicais tóxicos quando implantada e baixo custo (IGNÁCIO, 1997).
Para analisar o grau de irritabilidade aos tecidos causado pela poliuretana derivada da mamona, PASCON (1991) estudou sua citotoxidade in vitro e observou que de início foi baixa, mas aumentou após 24 e 60 horas.
IGNÁCIO (1995) em sua dissertação de mestrado estudou a neoformação óssea e a incorporação do cimento derivado do polímero da mamona através da análise radiológica, histológica e morfológica. O autor concluiu que o polímero da mamona é um material osteocondutor, atuando como um espaçador biológico, permitindo que o osso neoformado desenvolva-se por toda a superfície externa do material, formando uma cortical óssea e um periósteo envolvendo este tecido neoformado. O material testado em sua pesquisa também ofereceu uma resistência mecânica satisfatória e ausência de qualquer reação tóxica.
O polímero da mamona é considerado uma substância promissora para a utilização na Biomedicina. Sua biocompatibilidade foi testada por vários autores, os quais observaram uma grande aceitação orgânica à resina, obtendo em seus estudos a neoformação óssea. Não demonstraram encapsulamento do material, ausência de migração local de células inflamatórias e sem crescimento bacteriano nas culturas obtidas ou qualquer alteração patológica nos rins, fígado e baço (VILARINO, 1996; SOARES, 1994; TEIXEIRA, 1996; TEÓFILO, 1996).
Outro polímero bastante utilizado como barreira é o politetrafluoretileno (m-PTFE), que consiste em um polímero quimicamente estável e biologicamente inerte, capaz de resistir ao ataque enzimático e microbiológico.
SCHMITZ (1990) analisou o reparo de alvéolos dentários de humanos, com e sem o uso de m-PTFE em um estudo imuno-histoquímico. Os alvéolos foram recobertos por m-PTFE no grupo teste e observados microscopicamente quatro semanas depois. Observou-se que nos dois grupos analisados havia presença de infiltrado de células inflamatórias mononucleares, porém no grupo teste a quantidade foi escassa.
MACEDO (2003) comparou duas membranas usadas como barreiras físicas na regeneração óssea guiada em defeitos ósseos cirúrgicos na tíbia de ratos. Quinze animais foram divididos em 3 grupos, sendo no grupo I inserida a membrana de politetrafluoretileno, no grupo II inserido pequenos blocos de hidroxiapatita e o grupo III como controle. Durante o procedimento cirúrgico foi feito um defeito ósseo na tíbia de 2x3mm e após os períodos de 7,14,21 e 30 dias os animais foram sacrificados para a remoção da peça neoformada. A análise histológica demonstrou quantidades variadas de osso neoformado em ambos os tipos de polímeros, confirmando as suas biocompatibilidade como barreira física, porém a barreira de politetrafluoretileno mostrou melhores resultados.
2.5) Ressonância do Spin Eletrônico (RSE)
A Espectroscopia por Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) ou Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) é uma técnica capaz de detectar qualquer material com elétrons desemparelhados por apresentarem spin eletrônico diferente de zero.
Os radicais livres são moléculas que contém um elétron desemparelhado e, portanto podem ser detectados através da RSE. Outros exemplos de moléculas com
esta característica são os Birradicais, com dois elétrons desemparelhados, e os metais de transição. Todas estas substâncias podem ser detectadas por RSE.
Como toda técnica espectroscópica, a espectroscopia por RSE monitora a absorção líquida de energia vinda de uma fonte de microondas, enquanto as moléculas mudam seu estado de energia.
Para observar o fenômeno da RSE, a amostra interage com um campo magnético externo e, ao mesmo tempo, com um campo de microondas. O campo magnético externo tem como função orientar os spins presentes na amostra, os quais adquirem 2 orientações: paralela e antiparalela ao campo. O estado paralelo é o de menor energia, enquanto que o estado antiparalelo é instável e de maior energia. Quando a separação entre esses dois níveis corresponde à energia do campo de microondas, ocorre o fenômeno da ressonância. Nesta situação, ocorre uma absorção líquida do campo de microondas, conseqüência da transição entre os dois níveis de energia, o qual é registrado pelo equipamento. Quanto maior o número de spins (ou concentração de radicais livres), maior será a absorção de energia do campo de microondas (SWARTZ, 1972).
Quando a radiação ionizante interage com os tecidos calcificados, radicais livres estáveis são gerados em sua matriz mineral. A hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) está presente em ossos (60-70%) e dentes (95-98% no esmalte e 70-80% na dentina).
O principal radical livre gerado pela radiação ionizante é o CO2- e deve-se à presença de impurezas de Carbonato (CO32-) em sua matriz (CALLENS, 1989; SCHRAMM, 2000).
A figura 1 mostra o espectro típico de RSE do osso irradiado. O radical CO2-, gerado na Hidroxiapatita, é caracterizado pelo fator espectroscópico g, ilustrado na figura.
FIGURA 1: Espectro de Ressonância do Spin Eletrônico de um Osso da calvária de coelho irradiado com 3kGy da radiação γ de uma fonte de Cobalto-60.
A dosimetria por RSE é uma técnica especialmente utilizada em casos de acidente com radiações ionizantes, pois permite a utilização de partes do corpo como dosímetros. A idéia de se utilizar ossos e dentes como indicador da dose em acidentes foi apresentada por MASCARENHAS (1973), no American Physical Society Meeting. O autor observou um sinal de RSE intenso em ossos de vítimas da Bomba-A. Nesta ocasião, propôs-se a avaliação de doses recebida pelas vitimas de Hiroshima através do esmalte dental, a fim de proporcionar um tratamento médico adequado e estudar os efeitos biológicos produzidos pela radiação. Utilizando-se uma amostra de esmalte ou osso da vítima, constroe-se uma curva Resposta. A determinação da curva Dose-Resposta é feita pela técnica chamada Doses Aditivas, onde a amostra é irradiada com doses conhecidas e a intensidade do sinal é obtida a cada dose adicional.
332 334 336 338 340 342 344
Campo Magnético (mT) g
⊥= 2,0025
CARACELLI (1986) determinou as propriedades dosimétricas dos ossos e recentemente estas propriedades foram aplicadas para avaliar a dose liberada por
135
Sm-EDTMP e 89SrCl2, que são compostos utilizados em Radioterapia Sistêmica para tratamento paliativo da dor provocada por metástases ósseas (KINOSHITA, 2001).
Através da curva Dose-Resposta, pode-se determinar uma dose desconhecida inicialmente depositada na amostra, como é o caso de uma exposição acidental. Essa técnica foi utilizada para avaliar a dose de radiação recebida por vítimas das bombas de Hiroshima e Nagasaki por NAKAMURA (1998), do acidente em Chernobyl por SKVORTSOV (2000) e também de trabalhadores do complexo nuclear de Mayak e habitantes da região do Rio Techa nos Montes Urais por ROMANYUKHA (1996), ROMANYUKHA (2000), de Goiânia por ROSSI (2000) e de um acidente ocorrido com um trabalhador em Arequipa – Peru por KINOSHITA (2003).
3) OBJETIVOS
O propósito deste trabalho foi analisar o uso da Ressonância do Spin Eletrônico para avaliar o grau de remodelação óssea como método adicional às análises radiográfica e histológica.
Avaliar comparativamente a regeneração óssea guiada em defeitos cirúrgicos experimentais, em crânio de coelhos, com o uso de membrana vegetal de poliuretano e de politetrafluoretileno.