Universidade do Sagrado Coração de Jesus Gisele Blassioli Dalpino

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Gisele Blassioli Dalpino

O EMPREGO DA RESSONÂNCIA DO SPIN ELETRÔNICO

COMO TÉCNICA AUXILIAR NA DETERMINAÇÃO DO GRAU DE

MINERALIZAÇÃO DO OSSO NEOFORMADO EM MODELOS

DE CICATRIZAÇÃO ÓSSEA GUIADA.

Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação, da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, no Programa de Pós-graduação em Biologia Oral.

Orientadora: Prof. Dra. Angela Kinoshita Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio A. Catanzaro Guimarães

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Dalpino, Gisele Blassioli D149e

O emprego da ressonância do spin eletrônico como técnica auxiliar na determinação do grau de mineralização do osso neoformado em modelos de cicatrização óssea guiada / Gisele Blassioli Dalpino--2006.

104f.

Orientadora: Prof. Dra. Ângela Kinoshita

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determinação do grau de mineralização do osso neoformado em modelos de cicatrização óssea guiada.

Dissertação de Mestrado em Biologia Oral apresentada à Universidade do Sagrado Coração de Jesus e aprovada pela seguinte banca examinadora:

Orientadora: Prof(a). Dra. Angela Mitie O. Kinoshita

Programa de Pós Graduação em Biologia Oral da Universidade do Sagrado Coração, Bauru, São Paulo.

Departamento de Física e Matemática da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo.

Prof. Dr. Sérgio Augusto Catanzaro Guimarães

Programa de Pós Graduação em Biologia Oral da Universidade do Sagrado Coração, Bauru, São Paulo.

Prof. Dr. Orivaldo Tavano

Curso de Pós Graduação em Odontologia, sub área: radiologia - Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic – Campinas, São Paulo.

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meus pais Renato e Sueli,

pela dedicação, amor eterno, compreensão, exemplos de comportamento, de força e coragem em que sempre me espelho. Obrigada por tudo.

meu marido Fabio,

pelo incentivo, apoio nas horas difíceis, pelo amor, confiança e cumplicidade em todos os momentos. Eu te amo.

meu irmão João Gabriel

pelo amor, carinho, apoio e compreensão durante toda a minha vida.

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À minha orientadora Professora Doutora Angela Mitie O. Kinoshita, pela imensa sabedoria, capacidade e dedicação em pesquisa científica, pelo apoio, compreensão e confiança em mim depositada desde o início do curso.

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capacidade de administrar muito bem um curso de suma importância, pelo carinho, apoio, colaboração na realização deste trabalho e pela segurança sempre transmitida em todas as decisões. Você sempre será um exemplo a ser seguido.

Ao Professor Doutor Orivaldo Tavano, pela importante colaboração neste trabalho, por toda paciência e disponibilidade de nos ajudar na análise dos resultados.

A todos os professores, colegas e funcionários do curso de Pós-graduação em Biologia Oral da USC, pela convivência e amizade durante todo o curso.

Ao Departamento de Física e Matemática da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP, pelos registros dos espectros da Ressonância do Spin Eletrônico.

Ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares de São Paulo, pela irradiação das amostras.

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atenção.

A técnica e histologia Mayra pela preparação das lâminas.

Ao técnico de laboratório Wilson, pela grande ajuda na fase final da análise histológica das peças.

A FAPESP pelo apoio financeiro através do processo 03/09505-6.

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"Estar presente no próprio corpo, por meio do exercício constante da atenção, conduz a atitudes justas e harmoniosas em todas as nossas relações”.

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diferença estatisticamente significante. Concluímos com este estudo que a RSE pode ser utilizada para avaliar a dinâmica da regeneração óssea, fornecendo informações adicionais às análises radiológica e histológica, oferecendo dados sobre o grau de mineralização do osso neoformado. A análise histométrica, no período de 30 dias, e por RSE, nos períodos de 30 e 120 dias, mostraram a eficiência das barreiras mecânicas, no que se refere à evolução do reparo ósseo. Nestes mesmos períodos, a membrana de Poliuretano apresentou o mesmo desempenho da membrana de Politetrafluoretileno.

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days, and the ESR in the periods of 30 and 120 days, showed the efficiency of the mechanical barriers in the bone repair with the same performance for the Polyurethane and Polytetrafluorethylene membranes.

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FIGURA 1 - Espectro de Ressonância do Spin Eletrônico de um Osso da calvária de coelho irradiado com 3kGy da radiação γ de uma fonte de Cobalto-60... 38

FIGURA 2 - Procedimento cirúrgico: (A) Incisão; (B) Divulsão muscular e periostal; (C) Confecção do defeito; (D) Defeito no tamanho de 5x15mm; (E) Membrana recobrindo a meninge e a superfície do defeito, grupos A e B; (F) Coágulo sanguíneo preenchendo o defeito, grupo Controle; (G) Sutura do Periósteo; (H) Sutura da pele... 46

FIGURA 3 - Sistema Digora ... 48

FIGURA 4 - Imagem colorida da fotografia da lâmina através do software e as 3 regiões consideradas na análise: Osso Maduro Pré-existente, Neoformação na Margem do Defeito e Neoformação no Centro do Defeito... 49

FIGURA 5 - Análise Histométrica da região de Neoformação no Centro do Defeito. Osso Maduro Neoformado em verde e Osso Imaturo em amarelo... 50

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FIGURA 8 - Espectrômetro Varian-E4 pertencente ao Departamento de Física e Matemática – USP – RibeirãoPreto... 53

FIGURA 09 - Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema Digora do crânio de coelho no período de 30 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C... 56

FIGURA 12 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração: Tricrômico de Masson. Aumento original 2,6X. Grupo A, período de 30 dias... 59

FIGURA 13 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo B, período de 30 dias... 61

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FIGURA 15 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo A, período de 60 dias... 64

FIGURA 17 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 60 dias... 66

FIGURA 18 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo A, período de 120 dias... 68

FIGURA 20 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 120 dias... 71

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FIGURA 23 - Espectros de osso da calvária de coelho. (A) irradiado com diferentes doses e (B) espectro do osso irradiado com dose de 1500 Gy, em função do fator g,

mostrando as posições de g⊥ e g//... 77

FIGURA 24 - Curva dose-resposta das amostras de osso temporal de coelho... 77

FIGURA 25 - Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo A, razão INMD/IOMP = 48,6% ... 78

FIGURA 26 - Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo B, razão razão INMD/IOMP = 43,7%... 79

FIGURA 27- Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo Controle razão INMD/IOMP = 52,7%... 79

FIGURA 28 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 30 dias... 80

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FIGURA 31 - Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo Controle razão INMD/IOMP = 60,2% e INCD/IOMP = 46,8%... 82

FIGURA 32 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 60 dias... 83

FIGURA 33 - Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo A, razão INMD/IOMP = 100% e INCD/IOMP = 73%... 84

FIGURA 34 - Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo B, razão INCD/IOMP = 98,2%... 84

FIGURA 35 - Espectros de RSE referente ao período de 120 dias após a cirurgia. Grupo Controle razão INMD/IOMP = 65,2%. ... 84

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Sm-EDTMP – Samarium Etilenodiaminotetrametileno difosfonico

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SrCI2 – Cloreto de Estrôncio

ANOVA – Análise de variância

BMP – Proteína Morfogenética Óssea Ca10(PO4)6(OH)2) – Hidroxiapatita

CO2- - Radical Livre CO2

-FAPESP – Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo Gy - Gray

IPEN – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares Kg – Kilograma

kGy – kilo Gray kVp – kilo Volt mA - miliampere

mAs – miliampere por segundo ml – Mililitro

mm - Milímetro MO – Medula Óssea

m-PTFE – Membrana de Politetrafluoretileno NCD – Neoformação no Centro do Defeito NMD – Neoformação na Margem do Defeito OI – Osso Imaturo

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Radiação UV – Radiação Ultra-Violeta Radiação y – Radiação Gama

ROG – Regeneração Óssea Guiada

RPE – Ressonância Paramagnética Eletrônica RSE – Ressonância do Spin Eletrônico

TC – Tecido Conjuntivo

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Página

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5.2.1) Período de 30 dias ... 58 5.2.2) Período de 60 dias ... 63 5.2.3) Período de 120 dias ... 67 5.3) Análise Histométrica Comparativa ... 72 5.3.1) Período de 30 dias ... 72 5.3.2) Período de 60 dias ... 73 5.3.3) Período de 120 dias ... 73 5.4) Análise por Ressonância do Spin Eletrônico ... 76 5.4.1) Propriedades Dosimétricas de RSE do Osso da Calvária

de Coelho ... 76 5.4.2) Estudo da Dinâmica de Regeneração Óssea por RSE ... 78 6) Discussão . ... 88 7) Conclusão... 93 8) Referência Bibliográfica... 95 Anexos... 101

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1) INTRODUÇÃO

O osso desempenha uma excelente função mecânica para o corpo humano, exibindo um forte potencial de regeneração, sendo capaz de reparar fraturas ou defeitos locais com uma organização estrutural altamente semelhante à original. Quando ocorrem defeitos com muita perda óssea devido a traumas, tumores, infecções ou anomalias do desenvolvimento, o osso ainda enfrenta um grande desafio durante a sua reconstrução, pois o crescimento de tecido conjuntivo frouxo no local da lesão apresenta-se como um obstáculo para a sua reparação, podendo perturbar ou impedir totalmente a osteogênese. Para tentar impedir a ocupação do tecido conjuntivo, vários procedimentos foram utilizados, como o uso de enxertos, implantes e também a técnica da Regeneração Óssea Guiada (ROG), que tem sido preconizada como um método efetivo para estimular a regeneração em defeitos ósseos cirúrgicos por mais de uma década (DUPOIRIEX et al, 1994).

O uso de membranas oclusivas é eficaz na regeneração óssea guiada quando utilizadas como barreiras, formando um obstáculo mecânico que impede a invasão de células e tecidos não-osteogênicos competitivos na área do defeito, como o tecido conjuntivo frouxo, permitindo assim a ocupação local por células osteogênicas que irão orientar a regeneração óssea (SCHENK, 1994).

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Estudos histológicos e radiológicos são normalmente empregados para a avaliação do processo de reparo ósseo. Além destes métodos pode-se usar a Ressonância do Spin Eletrônico (RSE), que consiste em uma técnica espectroscópica capaz de detectar qualquer material com spin eletrônico resultante diferente de zero. Dentre os diversos materiais que possuem essa característica, destacam-se os radicais livres.

Radicais livres não estão presentes “naturalmente” em tecidos calcificados, mas

podem ser criados através da interação com a radiação ionizante (raios X, raios γ ou

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2) REVISÃO DA LITERATURA

2.1) Tecido Ósseo: Estrutura e Formação.

Alem de desempenhar o papel de estrutura de sustentação do corpo, o osso tem outras funções como servir de apoio para as contrações dos músculos esqueléticos transformando-as em movimento, proporcionar proteção para as partes moles do organismo e também como reservatório de cálcio, fosfato e outros íons. É formado em cerca de 65% de componente mineral, conhecido como hidroxiapatita, 25% de matriz orgânica e 10% de água (BUSER D, 1994).

A porção mineralizada do osso é composta por envoltórios de periósteo e endósteo, que possuem dois fatores importantes: potencial osteogênico e vascularização abundante, permitindo sua participação nas atividades modeladoras e reparadoras do tecido ósseo.

As células presentes no tecido ósseo são os osteócitos, os osteoblastos e os osteoclastos, que são responsáveis pela constante remodelagem óssea, durante toda a vida do organismo (KATCHBURIAN & ARANA-CHAVEZ, 1999).

Os osteoblastos são as células que formarão o tecido ósseo e estão presentes em todos os locais ativos de formação óssea. Sua função é secretar matriz osteóide que subseqüentemente mineraliza-se (SODEK, 2000) Quando um osteoblasto interrompe a secreção de matriz osteóide e fica encoberto pela matriz calcificada das células adjacentes, ele se torna um osteócito.

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se estendem e se comunicam através dos canalículos, por onde ocorre a difusão dos nutrientes, desempenhando um papel fundamental na manutenção da integridade da matriz óssea (STEVENS, 2001).

Os osteoclastos são células especializadas em decompor matrizes calcificadas e pertencem a uma família de células gigantes, estando localizados em focos de reabsorção óssea (HID, 2003).

A formação do tecido ósseo resulta de uma complexa cascata de ocorrências. Inicialmente ocorre a atração quimiotática dos precursores dos osteoblastos, mediada por fatores locais. Em seguida temos a proliferação dessas, cuja indução mitótica é mediada por fatores de crescimento liberados a partir do tecido ósseo degradado durante o processo de reabsorção. Numa fase mais avançada tem-se a diferenciação dos osteoblastos em células maduras que promovem a síntese de matriz óssea com posterior mineralização (ERIKSEN, 1986).

2.2) Regeneração Óssea.

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Quando temos uma lesão ou doença onde há perda de tecidos, o organismo desencadeia uma regeneração reparadora, dando inicio a um processo de cicatrização do local acometido.

Os tecidos apresentam diferentes capacidades de se regenerar após uma lesão. A cartilagem articular é quase sempre substituída por tecido fibroso ou por fibrocartilagem menos diferenciada. Os tecidos conjuntivos altamente diferenciados, como ligamentos e tendões, nunca apresentam um nível original de organização e sempre se restabelecem com uma cicatriz de força mecânica reduzida.

Diferente dos demais tecidos não só na sua estrutura fisioquímica, mas também na sua extraordinária capacidade de reparação e remodelação, o osso retorna completamente a sua estrutura e função originais depois de lesado, sem deixar cicatriz (SCHENK, 1994; SZACHOWICZ, 1995; HOLLINGER, 1996).

O processo de reparação ocorre da mesma forma que o crescimento e desenvolvimento ósseo, onde uma lesão inicial desencadeia uma seqüência contínua de eventos celulares, terminando com a completa remodelação sem deixar cicatriz, sendo esse processo semelhante à ossificação intramembranosa ou endocondral (BOSTROM, 1998; JUNQUEIRA, 2002).

2.3) Regeneração Óssea Guiada

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Vários estudos apresentam o uso da ROG no tratamento do reparo ósseo causado por eventuais patologias ou traumas (MACEDO, 2003).

Como a ROG pode ser aplicada em defeitos ósseos cirúrgicos, ela também constitui um bom modelo para o estudo da reparação óssea. Esses desfeitos cirúrgicos são menos sujeitos aos fatores mecânicos e obstruções do suprimento sanguíneo em relação às fraturas e por isso têm sido amplamente utilizados em estudos com animais experimentais, buscando uma melhor regeneração óssea através da aplicação de diferentes materiais de enxerto (SCHENK, 1984; JUNQUEIRA, 2002).

Inicialmente, o uso de membranas como barreiras foi estudado por Hurley e Boyne e posteriormente as membranas foram aplicadas para promover a regeneração periodontal, sendo um método testado em diferentes tipos de defeitos ósseos e ao redor de implantes dentais (BUSER, 1993).

A neoformação em defeitos cirúrgicos se baseia em dois princípios básicos: osteoindução e osteocondução.

O termo osteoindução tem sido usado para descrever o processo de diferenciação de células osteoprogenitoras em condroblastos e osteoblastos. Na osteocondução, um material condutivo serve como um substrato para novas formações ósseas, auxiliando as células durante a ocupação do local a ser regenerado (OSTRUM, 1994).

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fatores de crescimento específicos, denominados proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), são capazes de estimular a proliferação das células mesenquimais indiferenciadas osteoprogenitoras e a sua migração, reagregação e diferenciação em osteoblastos, com conseqüente deposição de matriz óssea (URIST, 1965; REDDI, 1986). As BMPs podem ser aplicadas isoladamente ou em associação com matriz óssea ou matriz dentinária, e estimular uma extensa osteoindução em defeitos ósseos (WOZNEY, 1992; CATANZARO GUIMARÃES, 1993; GONÇALVES, 1997).

Durante a osteocondução, a neoformação óssea pode ser auxiliada por materiais com estrutura especializada, que atuam como um arcabouço de sustentação para a penetração de células ósseas. O material implantado serve de ancoragem para o crescimento de capilares, tecido perivascular e células indiferenciadas osteoprogenitoras originadas no leito ósseo cirúrgico, mas também deve impedir que tecidos não osteogênicos invadam o local a ser reparado.

A utilização de membranas como barreiras à proliferação de fibroblastos para o interior do defeito ósseo permite um tempo adicional para as células osteogênicas repovoarem a área do defeito, desencadeando com eficiência a neoformação óssea (BUSER, 1994; GOMES, 1998; SCHLEGEL, 2000).

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2.4) Polímeros

Dentre os biomateriais de interesse atual, destacam-se os polímeros como as resinas de poliuretano que são produtos sintetizados a partir de moléculas de ácidos graxos vegetais.

Algumas propriedades devem ser consideradas quando se deseja explorar os polímeros para o reparo ósseo, tais como a composição e estrutura do polímero, que devem ser adequadas às finalidades específicas, como também a biodegradação dada por ligações químicas susceptíveis à hidrólise, quando expostas aos fluidos corporais (WILLIANS, 1983).

Em 1994, o Grupo de Química Analítica e Tecnologia de Polímeros da Universidade de São Paulo no campus de São Carlos, por intermédio do Professor Gilberto Chierice, iniciou uma pesquisa para o desenvolvimento de um novo poliol derivado da poliuretana da mamona. A mamona, além de ser encontrada em grande quantidade no território brasileiro, apresenta um grande potencial óleo–químico, podendo garantir o fornecimento de polióis e pré-polímeros a partir de ácidos graxos. Esta equipe constatou que a poliuretana da mamona pode ser utilizada na forma pura ou em associação com o carbonato de cálcio, que facilitaria as trocas iônicas na interface osso-resina, aumentado os níveis de dissolução celular e facilitando sua degradação (SOARES, 1994).

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propriedades estruturais, ausência de emissão de vapores tóxicos, bom poder de adesão, não liberação de radicais tóxicos quando implantada e baixo custo (IGNÁCIO, 1997).

Para analisar o grau de irritabilidade aos tecidos causado pela poliuretana derivada da mamona, PASCON (1991) estudou sua citotoxidade in vitro e observou que de início foi baixa, mas aumentou após 24 e 60 horas.

IGNÁCIO (1995) em sua dissertação de mestrado estudou a neoformação óssea e a incorporação do cimento derivado do polímero da mamona através da análise radiológica, histológica e morfológica. O autor concluiu que o polímero da mamona é um material osteocondutor, atuando como um espaçador biológico, permitindo que o osso neoformado desenvolva-se por toda a superfície externa do material, formando uma cortical óssea e um periósteo envolvendo este tecido neoformado. O material testado em sua pesquisa também ofereceu uma resistência mecânica satisfatória e ausência de qualquer reação tóxica.

O polímero da mamona é considerado uma substância promissora para a utilização na Biomedicina. Sua biocompatibilidade foi testada por vários autores, os quais observaram uma grande aceitação orgânica à resina, obtendo em seus estudos a neoformação óssea. Não demonstraram encapsulamento do material, ausência de migração local de células inflamatórias e sem crescimento bacteriano nas culturas obtidas ou qualquer alteração patológica nos rins, fígado e baço (VILARINO, 1996; SOARES, 1994; TEIXEIRA, 1996; TEÓFILO, 1996).

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SCHMITZ (1990) analisou o reparo de alvéolos dentários de humanos, com e sem o uso de m-PTFE em um estudo imuno-histoquímico. Os alvéolos foram recobertos por m-PTFE no grupo teste e observados microscopicamente quatro semanas depois. Observou-se que nos dois grupos analisados havia presença de infiltrado de células inflamatórias mononucleares, porém no grupo teste a quantidade foi escassa.

MACEDO (2003) comparou duas membranas usadas como barreiras físicas na regeneração óssea guiada em defeitos ósseos cirúrgicos na tíbia de ratos. Quinze animais foram divididos em 3 grupos, sendo no grupo I inserida a membrana de politetrafluoretileno, no grupo II inserido pequenos blocos de hidroxiapatita e o grupo III como controle. Durante o procedimento cirúrgico foi feito um defeito ósseo na tíbia de 2x3mm e após os períodos de 7,14,21 e 30 dias os animais foram sacrificados para a remoção da peça neoformada. A análise histológica demonstrou quantidades variadas de osso neoformado em ambos os tipos de polímeros, confirmando as suas biocompatibilidade como barreira física, porém a barreira de politetrafluoretileno mostrou melhores resultados.

2.5) Ressonância do Spin Eletrônico (RSE)

A Espectroscopia por Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) ou Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) é uma técnica capaz de detectar qualquer material com elétrons desemparelhados por apresentarem spin eletrônico diferente de zero.

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esta característica são os Birradicais, com dois elétrons desemparelhados, e os metais de transição. Todas estas substâncias podem ser detectadas por RSE.

Como toda técnica espectroscópica, a espectroscopia por RSE monitora a absorção líquida de energia vinda de uma fonte de microondas, enquanto as moléculas mudam seu estado de energia.

Para observar o fenômeno da RSE, a amostra interage com um campo magnético externo e, ao mesmo tempo, com um campo de microondas. O campo magnético externo tem como função orientar os spins presentes na amostra, os quais adquirem 2 orientações: paralela e antiparalela ao campo. O estado paralelo é o de menor energia, enquanto que o estado antiparalelo é instável e de maior energia. Quando a separação entre esses dois níveis corresponde à energia do campo de microondas, ocorre o fenômeno da ressonância. Nesta situação, ocorre uma absorção líquida do campo de microondas, conseqüência da transição entre os dois níveis de energia, o qual é registrado pelo equipamento. Quanto maior o número de spins (ou concentração de radicais livres), maior será a absorção de energia do campo de microondas (SWARTZ, 1972).

Quando a radiação ionizante interage com os tecidos calcificados, radicais livres estáveis são gerados em sua matriz mineral. A hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) está

presente em ossos (60-70%) e dentes (95-98% no esmalte e 70-80% na dentina). O principal radical livre gerado pela radiação ionizante é o CO2- e deve-se à

presença de impurezas de Carbonato (CO32-) em sua matriz (CALLENS, 1989;

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A figura 1 mostra o espectro típico de RSE do osso irradiado. O radical CO2-,

gerado na Hidroxiapatita, é caracterizado pelo fator espectroscópico g, ilustrado na figura.

FIGURA 1: Espectro de Ressonância do Spin Eletrônico de um Osso da calvária de coelho irradiado com 3kGy da radiação γ de uma fonte de Cobalto-60.

A dosimetria por RSE é uma técnica especialmente utilizada em casos de acidente com radiações ionizantes, pois permite a utilização de partes do corpo como dosímetros. A idéia de se utilizar ossos e dentes como indicador da dose em acidentes foi apresentada por MASCARENHAS (1973), no American Physical Society Meeting. O autor observou um sinal de RSE intenso em ossos de vítimas da Bomba-A. Nesta ocasião, propôs-se a avaliação de doses recebida pelas vitimas de Hiroshima através do esmalte dental, a fim de proporcionar um tratamento médico adequado e estudar os efeitos biológicos produzidos pela radiação. Utilizando-se uma amostra de esmalte ou osso da vítima, constroe-se uma curva Resposta. A determinação da curva Dose-Resposta é feita pela técnica chamada Doses Aditivas, onde a amostra é irradiada com doses conhecidas e a intensidade do sinal é obtida a cada dose adicional.

332 334 336 338 340 342 344

Campo Magnético (mT) g

⊥= 2,0025

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CARACELLI (1986) determinou as propriedades dosimétricas dos ossos e recentemente estas propriedades foram aplicadas para avaliar a dose liberada por

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Sm-EDTMP e 89SrCl2, que são compostos utilizados em Radioterapia Sistêmica para tratamento paliativo da dor provocada por metástases ósseas (KINOSHITA, 2001).

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3) OBJETIVOS

O propósito deste trabalho foi analisar o uso da Ressonância do Spin Eletrônico para avaliar o grau de remodelação óssea como método adicional às análises radiográfica e histológica.

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4) MATERIAIS E MÉTODOS

4.1) Local e Grupo de Estudo

As cirurgias foram realizadas no Biotério da Universidade do Sagrado Coração, na cidade de Bauru-SP.

No estudo foram utilizados 29 coelhos adultos brancos da raça New Zeland, divididos em três grupos com 9 coelhos cada. A análise da reparação óssea foi realizada nos períodos de 30, 60, e 120 dias.

Durante todo o procedimento experimental, os coelhos permaneceram em gaiolas individuais e receberam água e dieta de ração balanceada.

Este trabalho foi previamente analisado e aprovado pela Comissão de Ética da Universidade do Sagrado Coração, Bauru – SP (ANEXO).

4.2) Delineamento Experimental

Inicialmente, dos 29 coelhos, dois foram utilizados para a realização do teste da dose da Ressonância do Spin Eletrônico. Os 27 coelhos restantes foram divididos aleatoriamente em três grupos (A, B, C). Em todos foi provocado um defeito ósseo de 5 x 15mm no crânio.

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Levando-se em consideração a fragilidade destes animais, após os procedimentos cirúrgicos os coelhos ficaram sob observação diária durante todo o processo do estudo. Nos períodos de 30, 60, e 120 dias após a cirurgia, 3 coelhos de cada grupo foram sacrificados para posterior análise dos defeitos ósseos.

4.3) Técnicas e Procedimentos

4.3.1) Obtenção das membranas:

As membranas de poliuretano foram fornecidas pelo Prof. Gilberto Chierice, do Instituto de Química de São Carlos, USP, responsável pelo aperfeiçoamento da resina. A membrana de politetrafluoretileno foi adquirida pela empresa Consulmat da cidade de São Paulo.

4.3.2) Técnica Cirúrgica:

Anestesia e Assepsia:

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Após a administração anestésica, o animal ficou posicionado sobre a mesa cirúrgica para a realização da tricotomia na região e posterior assepsia local com iodo-polivinilpirrolidona / PVPI (Polvedine – Parke-Davis).

Procedimento Cirúrgico:

O isolamento da área foi realizado através de campos fenestrados estéreis. Com uma lâmina de bisturi número 15, realizou-se na pele do animal uma incisão linear de aproximadamente 4,5cm ao nível da linha média do osso frontal, seguida de divulsão muscular e periostal. Posteriormente foi realizado o defeito ósseo no crânio de tamanho de 5mm x 15mm com o uso de uma trefina de 5mm de diâmetro, juntamente com abundante irrigação de soro fisiológico para prevenir o aquecimento local, removendo todo o osso cortical e esponjoso, expondo a membrana meníngea.

O grupo A recebeu uma membrana vegetal no assoalho ósseo recobrindo a meninge do crânio e outra membrana na superfície da loja cirúrgica, com posterior sutura do periósteo e pele com fio absorvível.

No grupo B o mesmo procedimento do grupo A foi realizado, porém, a membrana de politetrafluoretileno foi empregada.

No grupo C, controle, o defeito ósseo foi preenchido apenas por coágulo sanguíneo e, em seguida, procedida a sutura por planos, primeiramente do periósteo, seguida da sutura da pele.

No pós-operatório imediato, os animais receberam uma aplicação única de ampicilina sódica, via intramuscular, na dose de 1mL/kg como profilaxia a infecções.

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FIGURA 2 – Procedimento cirúrgico: (A) Incisão; (B) Divulsão muscular e periostal; (C) Confecção do defeito; (D) Defeito no tamanho de 5x15mm; (E) Membrana recobrindo a meninge e a superfície do defeito, grupos A e B; (F) Coágulo sanguíneo preenchendo o defeito, grupo Controle; (G) Sutura do Periósteo; (H) Sutura da pele;

4.3.3) Análise das Amostras:

Nos períodos de 30, 60 e 120 dias após a cirurgia os coelhos foram sacrificados com uma superdosagem de anestésico geral (Ketamina). A área do crânio foi exposta e

A

B

C

D

E

F

(47)

o local contendo o defeito ósseo foi removido através da osteotomia com o uso de brocas de aço em baixa rotação.

Após a remoção das peças, as mesmas foram colocadas em solução de Formol a 10%.

Primeiramente foi realizada a tomada da radiografia. Posteriormente as peças contendo osso neoformado foram divididas ao meio para as análises histológica e por ressonância do spin eletrônico.

Tomada da radiografia digital

Inicialmente as peças foram absorvidas por um lenço de papel, para a retirada da umidade.

Para as radiografias, utilizou-se um aparelho de raios-X odontológico, regulado para 70kVp e 8mA, com filtragem total equivalente a 2mm de alumínio. Posicionou-se o cilindro localizador de modo que o feixe central incidisse perpendicularmente ao plano do sensor, com distância foco/sensor de 40cm e a exposição de 2mAs previamente selecionado.

A placa de imagem sensibilizada foi posicionada no leitor óptico do Sistema Digora para a captura da imagem latente contida na porção ativa da placa, por meio de varredura a laser.

(48)

FIGURA 3 – Sistema Digora– Pertencente ao Professor Doutor Orivaldo Tavano – Bauru– SP.

Análise Histológica

Inicialmente as peças foram fixadas em formol a 10% por 92 horas, seguida de descalcificação pelo método Morse (solução aquosa de ácido fórmico/citrato de sódio) e incluídas em parafina. Os cortes microscópicos foram obtidos no sentido longitudinal com seis micrômetros de espessura e corados pelo método de Tricômico Masson.

Os cortes histológicos foram analisados e descritos em todas as suas peculiaridades, procurando observar características histológicas como: tecido mesenquimal osteogênico, trabéculas ósseas imaturas, presença de cartilagem, presença de tecido conjuntivo frouxo, presença de coágulo sanguíneo.

(49)

Sérgio A. Catanzaro-Guimarães. A imagem digital adquirida foi analisada pelo Software Image-Pro-Plus, onde foi selecionado 3 regiões do corte histológico, sendo elas denominadas como:

- Osso Maduro Pré-existente na região adjacente ao defeito (OMP); - Neoformação na Margem do Defeito (NMD);

- Neoformação no Centro do Defeito (NCD).

Por meio deste software, foi determinada a proporção entre as áreas correspondentes a Osso Maduro Neoformado (OMN), Osso Imaturo (OI), Medula Óssea (MO) e Tecido Conjuntivo (TC). A razão entre Osso Maduro Neoformado existente em cada região da neoformação e Osso Maduro Pré-existente foi determinada para fins de comparação com os resultados da RSE.

As figuras abaixo são exemplos da aplicação do software (FIGURAS. 4-7).

FIGURA 4 - Imagem colorida da fotografia da lâmina através do software e as 3 regiões consideradas na análise: Osso Maduro Pré-existente, Neoformação na Margem do Defeito e Neoformação no Centro do Defeito.

OMP NMD

(50)

FIGURA 5 - Análise Histométrica da região de Neoformação no Centro do Defeito. Osso Maduro Neoformado em verde e Osso Imaturo em amarelo.

(51)

FIGURA 7 - Análise Histométrica da região de Osso Maduro Pré-existente. Em verde a região de Osso Maduro Neoformado e em magenta, a Medula Óssea.

Análise por Ressonância do Spin Eletrônico:

- Estudo das propriedades dosimétricas de RSE do osso temporal de coelho

(52)

colocadas em cápsulas de gelatina (comprimido) e receberam diferentes doses (500,

1000, 1500, 2000 e 3000 Gy) de radiação γ de uma fonte de Cobalto-60. As irradiações

foram realizadas no IPEN – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares – SP. A seguir, registramos o espectro de RSE de cada fração, a fim de se determinar qual dose de radiação é necessária para se produzir um espectro com boa relação sinal/ruído. Caso a maior dose citada (3000 Gy) fosse insuficiente para esse objetivo, novos valores de dose seriam testados.

Os espectros de RSE foram registrados no espectrômetro Varian-E4, pertencente ao Departamento de Física e Matemática, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP.

- Estudo da dinâmica de regeneração óssea por Ressonância do Spin Eletrônico

As amostras de ossos neoformados de cada grupo (A, B e C) e referentes a cada fase (30, 60, 120 dias) foram lavadas em água destilada e álcool etílico, secas em dessecador por um período de 15 dias e moídas manualmente, como citado anteriormente. Após esse processo, todas as amostras foram irradiadas com uma dose de 3 kGy, determinada no teste anterior. Após o registro dos espectros de RSE, a amplitude do sinal referente ao radical CO2- (gerado na hidroxiapatita) foi determinada e

comparada em relação ao osso normal e também entre os grupos A, B e C.

(53)

regeneração óssea, comparando-se o sinal de RSE do osso regenerado com o de um osso normal.

Uma amostra de cada região do defeito foi retirada e moída manualmente com gral de ágata, sendo elas: neoformação na margem do defeito, neoformação no centro do defeito e osso maduro preexistente. Após este processo foram transferidas aos tubos de quartzo para o registro do espectro de RSE, realizados no Espectrômetro Varian-E4 pertencente ao Departamento de Física e Matemática da Universidade de São Paulo de RibeirãoPreto (FIGURA 8).

Cerca de 60mg de osso moído foram utilizados para o registro dos espectros. A razão entre as amplitudes dos sinais de cada região e a região pré-existente foi adotada como o grau de mineralização da região.

(54)

Análise Estatística

(55)

(56)

5_{) RESULTADOS}

5.1) Análise das Imagens Digitalizadas pelo Sistema Digora

Com a utilização de recursos de software “Digora for Windows” as imagens digitalizadas foram resgatadas do arquivo e apresentadas uma a uma para o examinador, no monitor do computador onde foram observadas as diferenças de radiopacidades, relevos e tons da cor cinza nas imagens.

As figuras abaixo representam as imagens radiográficas digitais dos crânios dos coelhos obtidas digitalmente pelo sensor do Sistema Digora.

5.1.1) Período de 30 dias:

No grupo A observam-se áreas radio transparentes nas extremidades do defeito e uma radiopacidade central indicando ossificação nesta região, no grupo B observam-se áreas radio transparentes mais acentuadas nas extremidades do defeito e pequena área radiopaca na região esquerda do defeito e no grupo C observam-se áreas radio transparentes por toda a extensão do defeito (FIGURA 09).

FIGURA 09 – Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema Digora do crânio de coelho no período de 30 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C.

A B

C

(57)

No grupo A observa-se um defeito não ocluído, com áreas radio transparentes centrais, junto às margens superiores do defeito e na margem inferior do defeito observa-se uma região mais radiopaca com limites imprecisos; no grupo B observam-se limites nítidos nas bordas do defeito e radiopacidade menos pronunciada que o defeito ocluído com membrana de poliuretano, porém mais homogênea; e no Grupo C observa -se em toda a extensão do defeito áreas radio transparentes com pequenos pontos de radiopacidade nas margens (FIGURA 10).

FIGURA 10 - Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema Digora do crânio de coelho no período de 60 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C.

No grupo A observam-se áreas radiopacas ao longo de todo o defeito com contornos irregulares junto às bordas e notam-se duas áreas de radio transparência localizadas nas porções centrais do defeito. A linha radiopaca representa a sutura interparietal; no grupo B observa-se uma radiopacidade homogênea com contornos

A B

(58)

regulares junto às bordas do defeito; no grupo C nota-se uma área radio transparente na margem esquerda e central do defeito, com contornos irregulares (FIGURA 11).

FIGURA 11 - Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema Digora do crânio de coelho no período de 120 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C.

5.2) Análise Histológica e Histométrica

Os cortes microscópicos foram confeccionados no Laboratório de Histologia da Universidade do Sagrado Coração de Jesus, na coloração de Tricrômico de Masson. Posteriormente foram fotografados e descritos em todas as suas peculiaridades, ressaltando as diferenças entre os grupos.

Na análise histológica todos os grupos apresentaram processo de reparo por ossificação osteonal direta, com ausência de cartilagem.

A

B

(59)

No grupo A, observou-se trabéculas ósseas em disposição linear e tecido ósseo em processo de remodelação mais avançado.

No grupo B, foi observado tecido ósseo não lamelar e também cavidades medulares de diversos tamanhos.

No grupo C observou-se que o defeito ósseo cirúrgico foi preenchido por tecido conjuntivo osteogênico.

Grupo A (Poliuretano)

Descrição Histológica:

Não foi observada presença de cartilagem. Trabéculas ósseas em disposição linear podem ser vistas estendendo-se na superfície externa e interna do defeito, que se dispõem em duas faixas representando a taboa óssea externa e interna da abóboda craniana. Pontes ósseas constituídas por tecido ósseo imaturo e tecido ósseo em remodelação são observados unindo as taboas ósseas externa e interna. Algumas áreas mostram aspecto de estrutura medular em início de formação (FIGURA 12).

(60)

Análise Histométrica:

A tabela 1 representa os resultados da análise Histométrica da lâmina descrita na figura 12, destacando as regiões: Osso Maduro Pré-existente (OMP), Neoformação na Margem do Defeito (NMD), Neoformação no Centro do Defeito (NCD).

Na última coluna encontra-se a razão entre osso maduro existente em cada região de neoformação em relação ao osso adjacente pré-existente.

TABELA 1- Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo A, período de 30 dias.

Região Osso Maduro Neoformado Osso Imaturo Medula Óssea _ConjuntivoTecido _Razão

Osso Maduro Pré-existente 87,90% - 12,10% - -

Neoformação na Margem do Defeito 32,10% 67,90% 36,52% - 36,52%

Neoformação no Centro do Defeito 12,30% - 14,00% 87,70% 14,00%

Grupo B (Politetrafluoretileno)

(61)

FIGURA 13 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo B, período de 30 dias.

TABELA 2 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo B, período de 30 dias.

Região Osso Maduro Neoformado Osso Imaturo Medula Óssea Tecido

Conjuntivo Razão

Neoformação na Margem do Defeito 37,40% 62,60% - - 38,16%

(62)

Grupo C (Controle)

Não há presença de cartilagem, tecido ósseo imaturo é observado próximo às bordas, na extremidade direita observa-se tecido ósseo imaturo na forma de agrupamentos trabeculares, na extremidade esquerda nota-se tecido ósseo imaturo reticular projetando-se para o centro do defeito e tecido conjuntivo osteogênico preenchendo a parte central do defeito (FIGURA 14).

FIGURA 14 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 30 dias.

(63)

TABELA 3 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo C, período de 30 dias.

Região Osso Maduro Neoformado Osso Imaturo Medula Óssea Tecido

Conjuntivo Razão

Neoformação na Margem do Defeito 27,20% 72,80% - - 29,82%

Neoformação no Centro do Defeito 9,40% - - 90,60% 10,31%

Em todos os grupos foi observado processo por ossificação direta e ausência de cartilagem.

No grupo controle notou-se predominância de osso imaturo e presença de tecido conjuntivo osteogênico.

Tanto no grupo A como no grupo B observou-se processo de remodelação mais avançado, com presença de cavidades medulares irregulares e de diversos tamanhos.

(64)

lamelar, localizado mais internamente. Há presença de cavidades medulares irregulares. Nota-se também predomínio de osso imaturo na região da sutura parietal (FIGURA 15).

FIGURA 15 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo A, período de 60 dias.

TABELA 4 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo A, período de 60 dias.

Região Osso Maduro Neoformado Osso Imaturo Medula Óssea Razão

Osso Maduro Pré-existente 94,40% - 5,60% -

Neoformação na Margem do Defeito 64,00% 34,60% 1,40% 67,80%

(65)

Descrição Histológica

Observa-se presença de membrana oclusiva recobrindo a tábua óssea externa e interna, com processo de remodelação avançado. São observadas cavidades medulares de diversos tamanhos. Área da sutura parietal com maior proporção de osso imaturo. Áreas de osso imaturo são também observados ao longo da tábua óssea externa e interna (FIGURA 16).

FIGURA 16 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo B, período de 60 dias.

Análise Histométrica

(66)

Neoformação na Margem do Defeito 54,50% 45,50% - 74,76%

Neoformação no Centro do Defeito 43,30% 56,70% - 59,40%

Grupo Controle

Observa-se predominância de osso imaturo na tábua óssea interna e no osso intertrabecular em formação. Há um ligeiro predomínio de osso maduro na tábua óssea externa e espaços medulares definidos. Na região da sutura parietal nota-se a presença de tecido conjuntivo osteogênico e predomínio de osso imaturo (FIGURA 17).

(67)

TABELA 6 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo C, período de 60 dias.

Neoformação na Margem do Defeito 61,10% 38,90% - 65,28%

Neoformação no Centro do Defeito 61,20% 38,80% - 65,38%

Em todos os grupos foi observado processo por ossificação direta e ausência de cartilagem.

No grupo controle observou-se um predomínio de tecido ósseo imaturo não lamelar e pouca presença de osso maduro.

(68)

Nota-se processo de remodelação óssea avançado, predomínio de osso maduro lamelar, discretos focos de osso imaturo são observados no interior das trabéculas ósseas. Na região da sutura interparietal ainda há predomínio de osso imaturo. Observa-se presença de cavidades medulares preenchidas por tecido medular ósseo (FIGURA 18).

FIGURA 18 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo A, período de 120 dias.

Análise Histométrica]

(69)

TABELA 7 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo A, período de 120 dias.

Osso Maduro Pré-existente 74,90% 21,50% 3,60% -

Neoformação no Centro do Defeito 31,80% 60,70% 7,50% 42,46%

Observa-se o defeito totalmente preenchido por osso neoformado em processo de remodelação, com presença de osso imaturo na região da sutura interparietal. Nota-se a membrana de politetrafluoretileno recobrindo a superfície superior (sub-periostal) e inferior (assoalho) do defeito (FIGURA 19).

(70)

Neoformação no Centro do Defeito 64,00% 30,30% 5,70% 79,01%

Grupo Controle

(71)

FIGURA 20 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 120 dias.

Na última coluna encontra-se a razão entre osso maduro neoformado em cada região de neoformação em relação ao osso maduro pré-existente na margem e no centro do defeito.

TABELA 9- Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo C, período de 120 dias.

(72)

5.3) Análise Histométrica Comparativa

A tabela 10 mostra os resultados da análise histométrica do período de 30 dias, do Grupo A, Grupo B e Grupo C. Os resultados referem-se a razão entre a porcentagem de Osso Maduro existente nas regiões Neoformação na Margem do Defeito e Neoformação no Centro do Defeito em relação ao Osso Pré-existente em cada amostra.

Utilizando-se o método ANOVA, observou-se que as médias dos grupos A e B não tem diferença estatisticamente significativa tanto na região NMD quanto NCD. Quando comparou-se estes grupos com o controle, houve diferença estatisticamente significativa nas duas regiões.

TABELA 10- Porcentagens de osso maduro neoformado existentes no defeito ósseo dos coelhos do período de 30 dias.

_{Membrana de Poliuretano}Grupo A _{Membrana de PTFE}Grupo B _ControleGrupo C

(73)

A tabela 11 mostra os resultados das análises histométricas do período de 60 dias, do Grupo A, Grupo B e Grupo C. Os resultados referem-se a razão entre a porcentagem de osso maduro existente nas regiões de Neoformação na Margem do Defeito e Neoformação no Centro do Defeito em relação ao Osso Pré-existente em cada amostra.

Comparando-se as médias dos grupos entre si, não houve diferença estatisticamente significativa nas regiões NMD e NCD (ANOVA).

TABELA 11- Porcentagens de osso maduro neoformado existentes no defeito ósseo dos coelhos do período de 60 dias. Grupo A Membrana de Poliuretano Grupo B Membrana de PTFE Grupo C Controle Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Coelho 1 72,30% 65,30% 65,90% 28,54% 65,28% 65,38% Coelho 2 67,80% 66,21% 74,76% 59,40% 67,30% 67,30% Coelho 3 89,01% 89% 72,66% 62,88% 58,73% 42,56% Média 76,37% 73,51% 68,85% 49,36% 63,77% 58,41% Desvio Padrão 11,18% 13,43% 5,88% 15,54% 4,48% 13,76% 5.3.3) Período de 120 dias:

(74)

Defeito e Neoformação no Centro do Defeito em relação ao Osso Pré-existente em cada amostra.

Comparando-se as médias dos grupos entre si, não houve diferença estatisticamente significativa nas regiões NMD e NCD (ANOVA).

TABELA 12- Porcentagens de osso maduro neoformado existentes no defeito ósseo dos coelhos do período de 120 dias. Grupo A Membrana de Poliuretano Grupo B Membrana de PTFE Grupo C Controle Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Coelho 1 85,45% 42,46% 67,50% 60,00% 76,55% 76,20% Coelho 2 85,00% 80,02% 87,32% 65,26% 62,32% 46,89% Coelho 3 83,70% 80,17% 65,93% 79,01% - - Média 84,72% 67,55% 77,37% 64,48% 69,44% 61,55% Desvio Padrão 0,91% 21,73% 10,46% 22,16% 10,06% 20,73%

A tabela abaixo mostra a média e o desvio-padrão da análise histométrica de neoformação na margem do defeito, dos períodos de 30, 60 e 120 dias do grupo A, B e C (TABELA 13).

TABELA 13 – Resultado da media e desvio padrão da análise histométrica de Neoformação na Margem do Defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

Grupo A Membrana de Poliuretano Grupo B Membrana de PTFE Grupo C Controle Neoformação na Margem do Defeito

Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão Média Desvio Padrão

Período de 30 dias 32,25% 3,87% 38,67% 5,64% 28,03% 3,44%

Período de 60 dias 76,37% 11,18% 68,85% 5,88% 63,77% 4,48%

(75)

A figura abaixo mostra a média e o desvio-padrão da análise histométrica de neoformação na margem do defeito, dos períodos de 30, 60 e 120 dias do grupo A, B e C. (FIGURA 21).

30 dias 60 dias 120 dias

0 20 40 60 80 100 %

Neoformação na Margem do Defeito

M é d ia e D e s v io P a d rã o (H is to m e tr ia ) Grupo A - Poliuretana Grupo B - PTFE Grupo C - Controle

FIGURA 21 – Média e desvio padrão da análise histométrica de neoformação na margem do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

A tabela abaixo mostra a média e o desvio-padrão da análise histométrica de neoformação no centro do defeito, dos períodos de 30, 60 e 120 dias do grupo A, B e C (TABELA 14).

TABELA 14 - Resultado da media e desvio padrão da análise histométrica de neoformação no centro do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

Grupo A Membrana de Poliuretano Grupo B Membrana de PTFE Grupo C Controle Neoformação no Centro do Defeito

Período de 30 dias 12,05% 1,53% 13,57% 2,20% 7,55% 4,44%

Período de 60 dias 73,51% 13,43% 49,36% 15,54% 58,41% 13,76%

(76)

A figura abaixo mostra media e desvio padrão da análise histométrica de neoformação no centro do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias (FIGURA 22).

0 20 40 60 80 100

Neoformação no Centro do Defeito

M é d ia e D e s v io P a d rã o (H is to m e tr ia ) Grupo A - Poliuretana Grupo B - PTFE Grupo C - Controle

FIGURA 22 - Media e desvio padrão da análise histométrica de neoformação no centro do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

5.4) Análise por Ressonância do Spin Eletrônico

5.4.1) Propriedades dosimétricas de RSE do osso da calvária de coelho:

A figura 23 mostra os espectros de RSE de osso da calvária do coelho, irradiado com diferentes doses. Na figura 23-A, os sinais estão normalizados pela massa da

amostra. A figura 23-B representa o sinal dosimétrico com fatores g⊥= 2,0030 e g// =

1,9984.

(77)

(A) (B)

FIGURA 23 - Espectros de osso da calvária de coelho. (A) irradiado com diferentes doses e (B) espectro do osso irradiado com dose de 1500 Gy, em função do fator g, mostrando as posições de g⊥⊥⊥⊥ e g//.

A figura 24 mostra a curva dose-resposta, obtida através da medida, pico a pico,

da intensidade do sinal dosimétrico, em g⊥, normalizado pela massa. O erro na medida

foi avaliado a partir da relação sinal/ruído dos espectros. Também observa-se o comportamento linear da amplitude em relação a dose de radiação. A dose de 3kGy foi adotada para os demais experimentos.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 1 2 3 4 5 6 A m p lit u d e ( a .u .) Dose (Gy)

FIGURA 24 - Curva dose-resposta das amostras de osso temporal de coelho

(78)

5.4.2) Estudo da dinâmica de regeneração óssea por Ressonância do Spin Eletrônico:

Período de 30 dias

As figuras abaixo mostram os espectros de RSE relativos ao período de 30 dias, das regiões OMP, NMD e NCD dos grupos A, B e C (FIGURAS 25-27).

As médias dos 3 grupos na região NMD não têm diferença significativa. As médias dos grupos A e B, para a região NCD, não têm diferença estatisticamente significativa. Porém, quando as médias destes dois grupos são comparadas com o controle, houve diferença estatisticamente significante (p<0,1) (ANOVA).

(79)

FIGURA 26- Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo B, razão razão INMD/IOMP = 43,7%

FIGURA 27- Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo Controle razão INMD/IOMP = 52,7%. 332 334 336 338 340 342 344 -4,0x10-4 -2,0x10-4 0,0 2,0x10-4 4,0x10-4 6,0x10-4 8,0x10-4 1,0x10-3 1,2x10-3 A m p li tu d e ( u .a .) Campo Magnético (mT) OMP NMD RRC

Grupo Controle - 30 dias

(80)

A tabela a seguir mostra o grau de mineralização óssea obtida pela RSE em cada região de neoformação no período de 30 dias, para cada grupo estudado (TABELA 15).

TABELA 15 - Resultado do grau de mineralização óssea obtida pela RSE em todos os grupos no período de 30 dias.

_{Membrana de Poliuretano}Grupo A _{Membrana de PTFE}Grupo B _ControleGrupo C

Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Coelho 1 48,6% 48,6% 55,5% 55,5% 52,7% 0% Coelho 2 41,9% 41,9% 43,7% 43,7% 63% 0% Coelho 3 30,8% 30,8% 52,9% 52,9% 47,7% 5,2% Média 40,4% 40,4% 50,7% 50,7% 54,4% 1,7% Desvio Padrão 8,9% 8,9% 6,2% 6,2% 7,8% 3,0%

A figura abaixo mostra a média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 30 dias (FIGURA 28).

Grupo A Grupo B Grupo C

0 10 20 30 40 50 60 70 80 M é d ia e D e s v io P a d rã o (R S E ) Período 30 dias

Neoformação margem defeito Neoformação centro defeito

FIGURA 28 – Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 30 dias.

(81)

Período de 60 dias

As figuras abaixo mostram os espectros de RSE relativos ao período de 60 dias, das regiões OMP, NMD e NCD do grupo A, B e C (FIGURAS 29-31).

As médias dos grupos não têm diferença estatisticamente significativa nas regiões NMD e NCD (ANOVA).

FIGURA 29- Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo A razão INMD/IOMP = 70,9% e INCD/IOMP = 52,0%

(82)

FIGURA 31- Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo Controle razão INMD/IOMP = 60,2% e INCD/IOMP = 46,8%.

(83)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % M é d ia e D e s v io P a d rã o (R S E ) Período 60 dias

Neoformação na Margem do Defeito Neoformação no Centro do Defeito

FIGURA 32 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 60 dias.

Período de 120 dias

As figuras abaixo mostram os espectros de RSE relativos ao período de 120 dias, das regiões OMP, NMD e NCD de cada grupo (FIGURAS 33-35).

As médias dos 3 grupos das regiões NMD e NCD são estatisticamente diferentes em relação ao grupo C (p<0.1). A média do grupo A não tem diferença estatisticamente significativa em relação à média do grupo B.

(84)

FIGURA 33- Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo A, razão INMD/IOMP = 100% e INCD/IOMP = 73%.

FIGURA 34- Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo B, razão INCD/IOMP = 98,2%.

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TABELA 17 - Resultado do grau de mineralização óssea obtida pela RSE em todos os grupos no período de 120 dias.

_{Membrana de Poliuretano}Grupo A _{Membrana de PTFE}Grupo B Grupo C _Controle

Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Neoformação Margem do Defeito Neoformação Centro do Defeito Coelho 1 100% 73% 98,2% 98,2% 65,2% 65,2% Coelho 2 80,8% 80,8% 95,7% 95,7% 74,9% 74,9% Coelho 3 85,1% 85,1% 82,6% 82,6% 77,2% 77,2% Média 88,6% 79,6% 92,1% 92,1% 72,4% 72,4% Desvio Padrão 10,0% 6,1% 8,3% 8,3% 6,3% 6,3%

0 20 40 60 80 100 M é d ia e D e s v io P a d rã o (R S E ) Período 120 dias

Neoformação margem do defeito Neoformação centro do defeito

FIGURA 36 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 120 dias.

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A tabela 18 e a figura 37 mostram a média e desvio padrão de neoformação na margem do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

TABELA 18 – Média e desvio padrão de neoformação na margem do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

Grupo A Membrana de Poliuretano Grupo B Membrana de PTFE Grupo C Controle Neoformação na Margem do Defeito

Período de 30 dias 40,4% 8,9% 50,7% 6,2% 1,7% 3,0%

Período de 60 dias 62,3% 15,4% 78,8% 13,0% 61,4% 16,8%

Período de 120 dias 79,6% 6,1% 92,1% 8,3% 72,4% 6,3%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Neoformação na Margem do Defeito

M é d ia e D e s v io P a d rã o (R S E ) Grupo A - Poliuretana Grupo B - PTFE Grupo C - Controle

FIGURA 37 - Média e desvio padrão de neoformação na margem do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

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A tabela 19 e a figura 38 mostram a média e desvio padrão de neoformação no centro do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

TABELA 19 - Média e desvio padrão de neoformação no centro do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias.

Grupo A Membrana de Poliuretano Grupo B Membrana de PTFE Grupo C Controle Neoformação no Centro do Defeito

Período de 30 dias 40,4% 8,9% 50,7% 6,2% 54,4% 7,8%

Período de 60 dias 7,8% 7,7% 78,8% 13,0% 67,5% 7,0%

Período de 120 dias 88,6% 10,0% 92,1% 8,3% 72,4% 6,3%

0 20 40 60 80 100

Neoformação no Centro do Defeito

M é d ia e D e s v io P a d rã o (R S E ) Grupo A - Poliuretana Grupo B - PTFE Grupo C - Controle

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