Seleção do meio de crescimento de pólen 1 Coleta e separação do material biológico

Plantas adultas de mamoneira (Ricinus communis L.) da variedade Paraguaçu, cultivadas no Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará, na latitude 3º74‟S e na longitude 38º57‟W, tiveram removidas as flores masculinas contendo as anteras em iminência de abertura e repletas de grãos de pólen.

As flores coletadas foram, então, condicionadas em pequenas sacolas de papel toalha e secas à temperatura ambiente e, posteriormente, passaram por uma etapa mecânica de separação do pólen.

30 Na maioria das coletas realizadas ao longo do experimento foram removidas, aleatoriamente, quinze (15) anteras que foram utilizadas em cada replicata biológica.

Uma pinça metálica foi utilizada para ter acesso às anteras, as quais foram seccionadas das flores masculinas e postas em peneiras sequenciadas.

A primeira peneira apresentava malha 60 e abertura de 0,250 mm, na qual as estruturas da antera foram gentilmente quebradas, por meio de um pistilo em almofariz, permitindo o acesso ao pólen, e na sequência o material selecionado passou por uma nova separação em uma segunda peneira de malha 270 e abertura de 0,053 mm, obtendo-se majoritariamente os pólens advindos das anteras.

A partir de cada grupo de quinze androceus foi obtido cerca de 10,0 mg de massa seca (MS) de pólen.

As coletas ocorreram no período compreendido entre as 7:30 e as 8:30 horas da manhã, visto que nesse período as anteras podem ser encontradas em um estado de deiscência incompleta, o que impede o contato direto dos grãos de pólen com o meio externo, reduzindo ou mesmo anulando a existência de contaminantes na amostra inicial.

4.1.2 Preparo e aplicação dos meios de germinação

Foram utilizados dois meios de crescimento diferentes, o primeiro contendo somente água destilada, sacarose (C12H22O11) e ácido bórico (H3BO3) e um segundo meio

contendo, igualmente, água destilada, sacarose e ácido bórico, além de outros compostos adicionais como cloreto de cálcio (CaCl2), nitrato de cálcio [Ca(NO3)2], sulfato de magnésio

(MgSO4) e DMSO (C2H6OS).

O meio composto por água destilada, sacarose e ácido bórico, denominado SB, foi preparado segundo CUCHIARA et al (2008), mediante algumas modificações.

Foram preparadas três soluções, de 100,0 mL cada, com diferentes concentrações de sacarose (2,5 %, 5,0 % e 7,5 %) (m/v) e ácido bórico (5,0 mg/L) (m/v), às quais foram adicionadas massas equivalentes de pólens (média de 10,0 mg) em tubos de 15,0 mL, obtendo-se triplicatas biológicas para cada concentração utilizada, nomeados de acordo com os constituintes do meio de crescimento e a concentração de sacarose utilizada (SB2,5%1,

SB2,5%2, SB2,5%3, SB5,0%1, SB5,0%2; SB5,0%3; SB7,5%1, SB7,5%2 e SB7,5%3).

O grupo controle (GC) para o experimento constou de pólens imersos em água destilada, na ausência de sacarose e ácido bórico, sendo nomeados (GC1, GC2 e GC3).

31 O material foi incubado durante 24 horas, a temperatura ambiente, e, posteriormente, foram aliquotados 10,0 µL de solução para a confecção de lâminas, a fim de detectar via microscopia óptica a existência de pólens com tubos polínicos desenvolvidos.

O segundo meio, denominado PGM (meio de crescimento de pólen), foi sintetizado de acordo com HARTMAN et al (2014), mediante alterações.

Foi preparada uma solução contendo água destilada, sacarose (0,005%) (m/v), ácido bórico (0,010 %) (m/v), cloreto de cálcio (0,5 mM) (m/v), nitrato de cálcio (0,5 mM) (m/v), sulfato de magnésio (0,5 mM) (m/v), além de dimetilsulfóxido (2,0 %) (v/v), essa solução apresenta pH 6,5.

Massa equivalentes de pólens, aproximadamente 10,0 mg, foram condicionadas em tubos de 15,0 mL e, então, foi adicionado 10,0 mL da solução PGM em cada tubo, formando dois pares de triplicatas biológicas, nomeadas segundo o estágio do pólen pretendido e o respectivo número de 1 a 3 (PG1, PG2, PG3, PTP1, PTP2 e PTP3).

Outros três tubos foram separados, aos quais foram adicionadas as mesmas quantidades anteriores de pólens e o volume de 10,0 mL de meio PGM contendo 10% de DMSO, de modo a constituir a triplicata do grupo controle (GC) do experimento, nomeado do mesmo modo que as amostras anteriores (GC1, GC2 e GC3).

O material foi incubado durante 24 horas, a temperatura ambiente, e, posteriormente, foram aliquotados 10,0 µL de solução para a confecção de lâminas, a fim de detectar a existência de pólens com tubos polínicos desenvolvidos, via microscopia óptica.

Com o intendo de facilitar a contagem celular, alíquotas de 200,0 µL das triplicatas dos tratamentos foram transferidas para uma microplaca de 96 poços de fundo chato para titulação em ELISA, após a imersão dos pólens nos meios de crescimento. As alíquotas removidas para a contagem de pólens e do percentual de germinação de tubo polínico foram retiradas dessa placa.

O percentual mínimo de germinação atingido pelo meio para que esse seja selecionado conforme apropriado para a germinação de pólen de mamoneira é de 50,0%.

4.1.3 Contagem de pólens e determinação do percentual de germinação

A contagem total de pólens e de pólens com tubo polínico desenvolvido foi realizada mediante o uso da câmara de Neubauer, a qual permite a análise quantitativa de amostras biológicas, contendo células ou estruturas microscópicas dissolvidas em solução, via microscopia óptica (Figura 9).

32 Figura 9 – Espaço amostral utilizado em câmara de Neubauer para contagem de pólens.

Fonte: Dados do autor.

A equação utilizada para calcular o número total de pólens, com ou sem tubos polínicos estabelecidos, na alíquota é:

y = m/144 x 4 x 106

Observando-se a equação, y representa o número total de células na alíquota aplicada na câmara e m perfaz a média do número de células contadas nos dois espaços amostrais da câmara.

Os pólens foram caracterizados conforme alteraram a morfologia ao longo de tempo (Figura 10) em: pólens não germinados (P) foram aqueles que não evidenciaram qualquer modificação morfológica relevante após o período de incubação no meio; pólens germinados (PG) foram aqueles que continham um tubo polínico proeminente e se encontravam túrgidos, em relação ao volume inicial do pólen antes da incubação; e pólens com tubo polínico estabelecido (PTP) foram aqueles que apresentaram tubos polínicos com comprimentos iguais ou superiores ao diâmetro do pólen após o fim do período de incubação, em conformidade com CHAGAS et al (2010), seguido de algumas alterações.

Figura 10 – Fotomicrografias dos estágios do desenvolvimento do pólen de Ricinus communis L. A – pólen não germinado (P); B – pólen germinado (PG) e C – pólen com tubo polínico estabelecido (PTP).

33 4.2 Extração de proteínas

O protocolo para extração de proteínas totais das amostras de pólen de R. communis L. foi executado de acordo com SHEORAN et al (2007), seguido de algumas modificações.

A solução de extração de proteínas é constituída por acetona, TCA (10,0 %) (m/v) e DTT (1,0 %) (m/v).

Após o término do período de incubação das amostras em meio de crescimento, as soluções foram centrifugadas, em centrífuga de bancada Eppendorf Centrifuge 5810 R, a 4ºC e submetidas a 14.000 g, durante 15 minutos, e o sobrenadante descartado, com o intuito de remover os meios de crescimento, e o precipitado resultante foi, então, transferido para tubos Eppendorf de 1,5 mL.

Três lavagens com acetona foram realizadas, mediante centrifugação e remoção do sobrenadante, nas mesmas condições anteriores, e, posteriormente, a massa de pólens resultante foi seca, na capela, a temperatura ambiente.

Após a secagem, alíquotas de 600,0 µL de solução de extração foram adicionadas a cada 10,0 mg de amostra e, em seguida, incubadas em freezer, a –20 ºC, overnight.

No dia seguinte, as amostras foram retiradas do freezer e submetidas novamente à centrifugação, nas mesmas condições, o sobrenadante foi novamente descartado e 600,0 µL de uma solução de acetona e DTT (1,0 %) (m/v) foram adicionados a cada tubo.

Os tubos permaneceram guardados no freezer durante uma hora e, em seguida, foram novamente centrifugados para remover a solução adicionada e três lavagens consecutivas com acetona gelada foram promovidas de modo a remover completamente o excesso de TCA.

As triplicatas foram, então, submetidas a uma nova secagem, a fim de prepará-las para a etapa posterior de solubilização das proteínas.

A solubilização das proteínas foi efetuada por meio de uma solução composta por uréia (7,0 M) (m/v), tiouréia (2,0 M) (m/v).

Após a adição dessa mistura às amostras, os tubos permaneceram sobre constante agitação, em mesa agitadora Eppendorf Mixer 5432, durante 20 minutos.

Em seguida, o material foi centrifugado novamente, a –4 ºC e submetido a 14.000 g, por 15 minutos, em centrífuga de bancada Eppendorf Centrifuge 5804 e o sobrenadante foi transferido para novos tubos com o mesmo nome das respectivas amostras e o precipitado foi guardado no freezer para eventual reutilização.

34 4.3 Quantificação de proteínas

Os novos tubos contendo as proteínas solubilizadas a partir das respectivas amostras iniciais foram, então, submetidos à quantificação de proteínas através da metodologia descrita pelo fabricante do equipamento Qubit® 2.0 Fluorometer, produzido pela empresa Life Technologies, o qual consta de um fluorímetro, cujo funcionamento permite a quantificação de proteínas, utilizando-se corantes fluore scentes específicos para os compostos proteicos, revelando alta sensibilidade e especificidade.

Para a quantificação no Qubit é requerida uma solução de trabalho, a work solution ou WS, a qual foi preparada no escuro e é constituída por um tampão e um reagente, específicos para proteínas, de composição química protegida por lei de patente, ambos fornecidos juntamente com o equipamento.

O volume total da WS deve atingir os 200,0 µL de volume final, representando o somatório de 199,0 µL do tampão e 1,0 µL do reagente Qubit para proteínas.

Ao todo, para capa tratamento realizado, foram requeridos volumes da WS diretamente proporcionais ao número de amostras analisadas, acrescido de um volume adicional para uma análise extra em caso de erros no preparo das amostras.

Foram aliquotados 1,0 µL de cada amostra e a esse volume foi adicionado 199,0 µL de work solution, obtendo-se, também, 200,0 µL da solução a ser quantificada. A quantificação foi realizada para todas as amostras, incluindo-se o grupo controle.