UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CARLOS AUGUSTO MOREIRA DE OLIVEIRA
SELEÇÃO DE MEIO DE CRESCIMENTO APROPRIADO PARA O DESENVOLVIMENTO DE TUBO POLÍNICO EM PÓLEN DE MAMONEIRA
(Ricinus communis L.) E COMPARAÇÃO DOS PERFIS DE PROTEÍNAS DE DIFERENTES ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO DO PÓLEN MEDIANTE
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
FORTALEZA 2015
CARLOS AUGUSTO MOREIRA DE OLIVEIRA
SELEÇÃO DE MEIO DE CRESCIMENTO APROPRIADO PARA O
DESENVOLVIMENTO DE TUBO POLÍNICO EM PÓLEN DE MAMONEIRA (Ricinus communis L.) E COMPARAÇÃO DOS PERFIS DE PROTEÍNAS DE DIFERENTES ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO DO PÓLEN MEDIANTE ELETROFORESE EM
GEL DE POLIACRILAMIDA
Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Francisco de Assis de Paiva Campos.
Co-Orientador: Dr. Fabiano de Moura Teixeira.
FORTALEZA 2015
CARLOS AUGUSTO MOREIRA DE OLIVEIRA
SELEÇÃO DE MEIO DE CRESCIMENTO APROPRIADO PARA O
DESENVOLVIMENTO DE TUBO POLÍNICO EM PÓLEN DE MAMONEIRA (Ricinus communis L.) E COMPARAÇÃO DOS PERFIS DE PROTEÍNAS DE DIFERENTES ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO DO PÓLEN MEDIANTE ELETROFORESE EM
GEL DE POLIACRILAMIDA
Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Aprovada em: 02/07/2015.
Dedico esse trabalho a Deus, a minha querida avó Maria Luiza e a todos que contribuíram para a minha formação acadêmica.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu professor e orientador Prof. Francisco de Assis de Paiva Campos pela disposição do seu laboratório, tempo e paciência para me orientar durante o meu trabalho, ensinando-me e corrigindo-me sempre que necessário, de modo a permitir minha evolução pessoal e no ambiente de trabalho.
Aos professores participantes da banca examinadora Dr. Mohibullah Shah e, em especial, ao Dr. Fabiano de Moura Teixeira pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões oferecidas a mim desde o primeiro momento em que iniciei as atividades no laboratório, muito obrigado!
À equipe de alunos de graduação, de mestrado e de doutorado que integram o Laboratório de Biologia Molecular de Plantas (Bioplant): Roberto, João, Isabella, Magda, Claudiane, Emmanoella e Camila.
A todos os professores que estiveram presentes ao longo da minha graduação me ensinando, me aconselhando e me ajudando a fazer escolhas importantes para o meu futuro.
Aos colegas da turma de ciências biológicas, pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas.
À minha família pelo apoio e, especialmente, à minha namorada Izabel, a qual já faz parte da minha família, pelo apoio, paciência, tempo e carinho dedicado a mim.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de iniciação científica durante um ano das minhas atividades.
“Se você tem metas para um ano, planta arroz. Se você tem metas para 10 anos, plante uma árvore. Se você tem metas para 100 anos, então eduque uma criança. Se você tem metas para 1000 anos, então preserve o meio ambiente.”
RESUMO
A espécie Ricinus communis L., membro das Euphorbiaceae, constitui uma importante oleaginosa utilizada, sobretudo, para a produção de biodiesel, o que justifica os diferentes estudos realizados acerca das características bioquímicas dos diferentes tecidos obtidos a partir da planta. O pólen de mamona representa uma estrutura reprodutiva de importância significativa para as pesquisas relativas ao processo de formação e expansão da parede celular, visto que esse mecanismo é responsável pelo alongamento do tubo polínico para conduzir o gameta masculino até o gameta feminino, de modo a permitir a fecundação. O pólen dessa espécie é classificado conforme tricolporado, pois apresenta cólporos facilmente identificáveis por microscopia óptica, além de possuir duas camadas bem delimitadas, a exina e a intina. Nesse estudo foi realizado teste para determinar o meio de crescimento mais eficiente para a germinação do pólen de mamoneira, utilizando dois meios de crescimento para comparar os percentuais de germinação de pólen através do método de contagem em câmara de Neubauer. O primeiro meio (SB) foi composto por diferentes concentrações de sacarose (2,5%, 5,0% e 7,5%), mantendo-se a concentração de boro constante (5,0 mg/L), enquanto que o segundo meio (PGM) continha igualmente a sacarose e o boro, em concentrações distintas, porém adicionado de sais. Posteriormente, foi promovida a extração das proteínas em solução de acetona, TCA (10,0%) e DTT (1,0%). Em seguida, foi realizada a quantificação e a eletroforese em SDS-PAGE das proteínas. Foi utilizado um programa de análise de imagem por densitometria óptica para comparar graficamente os perfis de distribuição das bandas de proteínas presentes nos géis resultantes da eletroforese. Dentre os meios analisados, o meio PGM foi selecionado conforme o mais eficiente para a germinação dos pólens de mamoneira, visto que apresentou os maiores percentuais de germinação. Os valores de quantificação para as amostras advindas da extração de proteínas apresentaram os maiores conteúdos proteicos, a partir de 1,0 mg de MS de pólen, nas amostras de pólen não germinado e os menores nas amostras de pólen com tubo polínico estabelecido, indicando o consumo das proteínas durante a fase de alongamento do tubo polínico. A análise dos perfis de proteínas presentes nos géis permitiu inferir que houve distinção quanto à composição de proteínas presentes nas diferentes fases de desenvolvimento do pólen estudas, uma vez que foi evidenciada a existência de bandas específicas de cada fase.
ABSTRACT
The Ricinus communis L. is species, member of the Euphorbiaceae, is an important oilseed used mainly for biodiesel production, which explains the different studies about the biochemical characteristics of different tissues obtained from the plant. Castor pollen represents a reproductive structure of significant importance for research relating to the formation and expansion of the cell wall, since the mechanism responsible for elongation of the pollen tube to lead the male gamete to female gamete, to allow fertilization. The pollen of this species is classified as tricolporate because it presents colpi easily identifiable by optical microscopy, and has two well-defined layers, the exine and intine. In this study was performed to determine the most efficient means of growth in the germination of castor pollen using two growth media to compare the percentage of pollen germination by counting method in a Neubauer chamber. The first medium (SB) comprised different concentrations of sucrose (2.5%, 5.0% and 7.5%), keeping constant the concentration of boron (5.0 mg / L), while the second medium (PGM) with sucrose, and boron, in various concentrations, but added salts. It was promoted the extraction of the proteins in solution with acetone, TCA (10.0%) and DTT (1.0%). Then, the quantification and electrophoresis in SDS-PAGE of samples was performed. An optical imaging densitometry analysis program was used to graphically compare the distribution of the profiles of protein bands present in the resulting electrophoresis gels. Among the media examined, the middle PGM was selected as the most efficient for the germination of castor pollen, as had the highest percentage of germination. The quantification values for the resulting samples of protein extract from 1.0 mg MS pollen showed the largest protein content in pollen samples were not seeded and lower in samples of pollen with pollen tube elongate indicating the protein consumption during the pollen tube phase of elongation. The analysis of profiles of proteins present in the gels was allowed distinction inferred that as the composition of proteins present at different stages of development of pollen, since the existence of specific bands of each phase was observed.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Mecanismo geral da reação de transesterificação ... 14 Figura 2 Procedimento básico para a análise proteômica do pólen e do tubo
polínico desenvolvido ... 15 Figura 3 Ricinus communis L. ... 16 Figura 4 Estimativa de proteínas solúveis e aminoácidos livres em pólens de
mamoneira ... 17 Figura 5 Esquema geral da microsporogênese em angiospermas ... 18 Figura 6 Fotomicrografia de pólen de R. communis L., em perspectiva equatorial e
polar ... 20 Figura 7 Esquema da biossíntese de celulose pelo complexo terminal ... 21 Figura 8 Esquema do mecanismo de crescimento do tubo polínico com as
principais estruturas intracelulares envolvidas ... 23 Figura 9 Espaço amostral utilizado em câmara de Neubauer para contagem de
pólens ... 30 Figura 10 Fotomicrografias dos estágios do desenvolvimento do pólen de Ricinus
communis L. ... 30 Figura 11 Intervalos dos percentuais de germinação dos pólens nos meios SB, de
acordo com as respectivas datas de contagem ... 34 Figura 12 Fotomicrografias de pólens anômalos com possíveis tubos polínicos
múltiplos ... 34 Figura 13 Intervalos dos percentuais de germinação dos pólens em meio PGM, de
acordo com a respectiva data da contagem ... 35 Figura 14 Valores médios da relação entre a massa de proteínas obtida a partir da
massa seca de pólens utilizada nos respectivos tratamentos ... 38 Figura 15 Gel obtido via eletroforese unidimensional em SDS-PAGE ... 40 Figura 16 Análise de densitometria óptica do gel obtido via eletroforese
unidimensional ... 41 Figura 17 Gel obtido via eletroforese unidimensional em SDS-PAGE ... 42 Figura 18 Análise de densitometria óptica do gel obtido via eletroforese
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
aq Solução aquosa DDP Diferença de potencial 2DE Eletroforese bidimensional DMSO Dimetilsulfóxido
DTT Ditiotreitol
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Ligada à Enzima (do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
GC Grupo controle MS Massa seca
P Amostra de pólen não germinado PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida PG Amostra de pólen germinação
PGM Meio de Crescimento de Pólen (do inglês Pollen Growth Medium) pH Potencial hidrogeniônico
PSA Persulfato de amônio
PTP Amostra de pólen com tubo polínico estabelecido
SBx% Amostra do tratamento com sacarose em diferentes concentrações e boro
SDS Dodecilsulfato de sódio TCA Ácido tricloroacético UDP Uridina difosfato
TEMED Tetrametiletileno diamina WS Work Solution
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem ® Marca registrada
β Tipo de ligação glicosídica º Grau
’ Minuto g Grama
m/v Massa por volume µg Micrograma mg Miligrama µL Microlitro mL Mililitro mm Milímetro L Litro S Sul W Oeste
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 16 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 18 2.1 Ricinus communis L. ... 18 2.2 2.2.1 Formação do grão de pólen ... Morfologia básica do grão de pólen da mamoneira ... 19 21 2.3 2.3.1 Organização e importância da parede celular vegetal ... Formação e germinação in vitro do tubo polínico ... 22 25 2.4 Análise proteômica de pólen ... 27
2.5 2.5.1 Eletroforese em gel ... Análise de imagens ... 27 28 3 OBJETIVOS ... 29 3.1 3.2 Objetivo geral ... Objetivos específicos ... 29 29 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 29 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 Seleção do meio de crescimento de pólen ... Coleta e separação do material biológico ... Preparo e aplicação dos meios de crescimento ... Contagem de pólens e determinação do percentual de germinação ... 29 29 30 31 4.2 Extração de proteínas ... 33 4.3 Quantificação de proteínas ... 34
4.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida ... 34
4.5 Análise digital dos géis de poliacrilamida ... 35
5 5.1 5.2 5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... Comparação da eficiência dos meios de crescimento e seleção do mais adequado para a germinação de pólen de R. communis L. ... Extração e quantificação de proteínas ... Obtenção dos perfis de proteínas mediante eletroforese em SDS-PAGE e posterior análise de densitometria óptica das bandas de proteínas ... 35 35 39 41 6 CONCLUSÃO... 45 REFERÊNCIAS ... 47
16 1 INTRODUÇÃO
Atualmente, há intensas discussões acerca do esgotamento das principais matrizes energéticas no Brasil e no mundo, visto que os principais recursos naturais utilizados para a obtenção de energia advêm de fontes não renováveis de origem fóssil, tal qual o petróleo, o gás natural e o carvão (STANO JUNIOR & TIAGO FILHO, 2007).
Com o intuito de minimizar os danos causados ao meio ambiente pela extração e pelo consumo desenfreado dessas matrizes energéticas não renováveis, pensou-se na utilização de culturas vegetais como fonte alternativa de energia.
A produção de biocombustíveis, obtidos a partir de matrizes vegetais como a soja, o girassol, o pinhão-manso, a mamona e o milho, foi intensificada nas últimas décadas de modo a suprir as exigências do mercado consumidor, bem como garantir uma fonte renovável de energia, em detrimento aos combustíveis fósseis (SILVA NETTO & LEAL, 2012).
Por utilizar uma fonte de origem vegetal para a síntese de biocombustível, é possível o controle da produção, em conformidade com a demanda do mercado, além de gerar uma maior competitividade no mercado de energia, visto que apresenta um menor custo, quando comparada às matrizes esgotáveis de energia, como o petróleo, além de colaborar com a redução dos gases de efeito estufa nocivos ao meio ambiente (SILVA NETTO & LEAL, 2012).
A conversão dos óleos vegetais em biodiesel é realizada por meio da reação de transesterificação (Figura 1), a qual envolve a reação de um álcool com um éster para formar outros tipos de álcoois e de ésteres, comumente na presença de um catalisador (NAKARMI & JOSHI, 2014).
Figura 1 – Mecanismo geral da reação de transesterificação.
Fonte: Modificado de NAKARMI & JOSHI (2014).
A mamoneira representa uma oleaginosa com potencial significativo para a síntese de biodiesel (OLIVEIRA et al, 2005; TURATTI et al, 2002), logo, é imprescindível que haja
17 estudos em Biologia Molecular para analisar a qualidade e a viabilidade produtiva das diferentes linhagens desse gênero agrícola, gerando dados qualitativos para a manipulação segura e eficiente da mamoneira, selecionando as linhagens economicamente viáveis.
A biologia do grão de pólen de muitas espécies disponibiliza diversas características que atraem a atenção dos pesquisadores (CHEN et al, 2007) quanto à caracterização das proteínas presentes nessa estrutura (Figura 2).
Muitos eventos moleculares são processados durante o desenvolvimento do grão de pólen, a exemplo da reorganização da parede celular para o alongamento do tubo polínico (MCCORMICK, 1993; RAVEN et al, 2007), da biossíntese da celulose (GIBEAUT & CARPITA, 1994; LEHNINGER et al, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2013), da orientação bioquímica das fibras de celulose para o rearranjo do tubo polínico mediada por íons livres (CHEN et al, 2007), além da sinalização citoquímica que ocorre durante o alongamento do tubo até a abertura da micrópila (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Para a biologia reprodutiva é importante o estudo direcionado às biomoléculas relacionadas à formação dos microgametas (CHEN et al, 2007).
Figura 2 – Procedimento básico para a análise proteômica do pólen e do tubo polínico desenvolvido.
18 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Ricinus communis L.
A espécie Ricinus communis L. (Figura 3), membro da família Euphorbiaceae, comumente conhecida no Brasil pela denominação de mamona, possui possível origem africana.
Apresenta hábito arbustivo com caule, folhas e frutos bastante diversificados quanto à coloração, possuindo folhas digitolobadas denticuladas com nervuras palminérveas, além de possuir uma inflorescência do tipo panícula racemosa terminal, ou em cacho, com as flores femininas localizadas acima das masculinas, em relação à base (AZEVEDO & LIMA, 2001; GONÇALVES & LORENZI, 2010; HTUN, 2011; LORENZI & MATOS, 2002; VARGAS, 2006; VARGAS et al, 2009).
Figura 3 – Ricinus communis L.
Fonte: Disponível em: <http://www.meemelink.com/prints_images/21904.Ricinus.jpg>. Acesso em: 18 de janeiro de 2015.
19 A mamoneira apresenta uma forma de cultivo relativamente rápida e fácil, uma vez que é tolerante ao estresse hídrico gerado durante os períodos de estiagem, além de revelar uma capacidade adaptativa consistente, pois se adequa rapidamente a diferentes climas e solos (OLIVEIRA et al, 2005).
O óleo de mamona, bem como a pasta, constitui uma importante matéria-prima para a indústria de plásticos, de perfumes, de tintas, de lubrificantes para motores, além de constituir uma fonte importante para a síntese de biodiesel, visto que a mamona apresenta cerca de 40,0 % a 50,0 % de óleo (OLIVEIRA et al, 2005).
Por meio de estudos bioquímicos foi possível determinar a existência de concentrações consideráveis de proteínas solúveis e aminoácidos livres em extratos de pólens (Figura 4) provenientes da mamoneira (SHARMA et al, 2009), justificando a importância dos estudos acerca da proteômica dessa cultura vegetal de grande viabilidade econômica.
Figura 4 – Estimativa de proteínas solúveis e aminoácidos livres em pólens de mamoneira.
Fonte: Adaptado de SHARMA et al (2009).
2.2 Formação do grão de pólen
Dois importantes processos reprodutivos ocorrem para a formação do pólen em fanerógamas: a microsporogênese e a microgametogênese (RAVEN et al, 2007).
O grão de pólen, ou micrósporo, inicia seu processo de formação a partir da microsporogênese (Figura 5), a qual ocorre no interior do saco polínico, ou microsporângio, contido nas anteras. Concomitantemente, se processa a microgametogênese, formando o microgametófito até que esse alcance a fase de desenvolvimento tricelular (MCCORMICK, 1993; RAVEN et al, 2007; VARGAS, 2006).
20 Figura 5 – Esquema geral da microsporogênese em angiospermas.
Fonte: Modificado de MCCORMICK (1993).
Inicialmente, as células da antera apresentam uniformidade morfológica, excetuando as células epidérmicas que se apresentam parcialmente diferenciadas (RAVEN et al, 2007).
Consecutivamente, quatro grupos de células férteis, denominadas esporogênicas, se destacam no interior da antera, mantendo-se envoltas por diversas camadas de células estéreis, as quais se desenvolvem, originando a parede do saco polínico, incluindo um grupo de células que desempenham uma função nutricional, fornecendo alimento para os micrósporos em desenvolvimento (RAVEN et al, 2007)..
21 Essas células nutritivas compõem a camada celular mais interna da parede do saco polínico, chamada tapete ou tapetum, o qual adiciona à superfície do grão de pólen uma camada de natureza lipídica (RAVEN et al, 2007) que o protege da desidratação e permite a adesão do mesmo aos agentes polinizadores, além de formar a esporopolenina que compõe a camada mais externa do pólen, a exina (BEDINGER, 1992; MCCORMICK, 1993; RAVEN et al, 2007).
As células esporogênicas são convertidas em células-mãe de micrósporos, ou microsporócitos diplóides, os quais sofrem meiose, durante a qual ocorre deposição do polissacarídeo calose na região intermediária entre a membrana plasmática dos microsporócitos e a parede primária original do micrósporo, formando-se pontes citoplasmáticas para manter a comunicação entre as células (MCCORMICK, 1993; RAVEN et al, 2007).
Posteriormente à meiose, cada microsporócito origina tétrades de micrósporos haploides, completando assim a microsporogênese (GIBEAUT & CARPITA, 1994; MCCORMICK, 1993; PALANIVELU & TSUKAMOTO, 2011; RAVEN et al, 2007; VARGAS, 2006).
A microgametogênese, por sua vez, é iniciada uniformemente em angiospermas, no momento em que ocorrem divisões mitóticas dos micrósporos haplóides, formando duas células confinadas no interior da parede original do micrósporo (RAVEN et al, 2007).
É formada uma célula volumosa, denominada célula do tubo ou vegetativa, e uma célula pequena, a célula geradora que se desloca para o interior do grão de pólen que se torna bicelular, constituindo o microgametófito imaturo, o qual permanece no estágio bicelular até a liberação dos grãos de pólen pela antera (MCCORMICK, 1993; RAVEN et al, 2007).
Em dois terços das plantas com flores, à proporção que, nas demais espécies, o núcleo da célula geradora sofre mitose antes da liberação dos grãos de pólen, originando dois gametas masculinos, as células espermáticas, gerando um microgametófito tricelular (RAVEN et al, 2007).
2.2.1 Morfologia básica do grão de pólen da mamoneira
O pólen de Ricinus communis L. é classificado conforme tricolporado (BARTH et al, 1976; TAKAHASHI et al, 2000; WILLARD et al, 2004) por possuir três cólporos bem evidentes, apresenta polinização anemófila (BARTH et al, 1976), na qual o vento conduz os grãos de pólen proveniente das flores masculinas até o estigma das flores femininas.
22 Apresenta duas camadas celulares bem delimitadas em microscopia óptica (Figura 6): a exina, externamente, constituída por esporopolenina; e a intina, internamente, composta por celulose e pectina (BARTH et al, 1976; HTUN, 2011; RAVEN et al, 2007; TAKAHASHI et al, 2000; WILLARD et al, 2004).
A exina do pólen de mamona apresenta organização reticulada (HTUN, 2011; WILLARD et al, 2004).
Figura 6 – Fotomicrografia de pólen de R. communis L., em perspectiva equatorial e polar.
Fonte: Dados do autor.
É indispensável que haja atenção especial ao grão de pólen e sua fisiologia, visto que a qualidade dessa estrutura reprodutiva é determinante da produtividade da planta, bem como da qualidade genética das plântulas provenientes das polinizações cruzadas.
2.3 Organização e importância da parede celular vegetal
A parede celular vegetal é composta especialmente pela celulose, perfazendo 50,0 % ou mais da sua composição e constituindo o polissacarídeo mais abundante na biosfera (TAIZ & ZEIGER, 2013).
A celulose, por sua vez, é um polímero formado por subunidades de β-D-glicose, com ligações glicosídicas do tipo β(1→4), determinando uma estrutura insolúvel, altamente estável e resistente à degradação enzimática, além de ser formada por uma organização tridimensional de moléculas extensas e sem ramificações (LEHNINGER et al, 2001; RAVEN et al, 2007; TAIZ & ZEIGER, 2013).
23 A celulose e a calose constituem os únicos polissacarídeos sintetizados a partir de complexos enzimáticos localizados na membrana plasmática e a calose é sintetizada, sobretudo, quando a célula sofre algum dano (GIBEAUT & CARPITA, 1994).
A calose, diferentemente da celulose, consta em um homopolímero de glicose formado por ligações do tipo β(1→3) (GIBEAUT & CARPITA, 1994).
A biossíntese da celulose (Figura 7) é promovida por meio de um complexo enzimático multimérico intramembranar denominado complexo terminal ou roseta, no qual se encontra a celulose-sintase e a sacarose-sintase, as quais atuam sincronicamente para sintetizar a celulose a partir da sacarose (GIBEAUT & CARPITA, 1994; TAIZ & ZEIGER, 2013).
O complexo terminal se liga internamente com o substrato para a síntese da celulose, a sacarose, por meio da sacarose-sintase (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Esse complexo enzimático, então, promove a hidrólise do dímero, produzindo a glicose e a frutose (TAIZ & ZEIGER, 2013).
A glicose, por sua vez, se liga à uridina difosfato, ou UDP, formando a UDP-glicose (FUJII et al, 2010; GIBEAUT & CARPITA, 1994; LEHNINGER et al, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2013).
A outra porção da maquinaria enzimática transmembranar permanece projetada para o exterior da célula, por onde ocorrerá a cristalização das sequências de glucanos, pela formação de pontes de hidrogênio e pelas interações de van der Waals, para formar as microfibrilas de celulose altamente ordenadas, as quais são hidrofóbicas e muito resistentes às enzimas (LEHNINGER et al, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2013).
Figura 7 – Esquema da biossíntese de celulose pelo complexo terminal.
24 Outros polissacarídeos complexos integram as paredes celulares das células vegetais, além da celulose, tais quais as hemiceluloses e as pectinas LEHNINGER et al, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2013.
As hemiceluloses constituem cadeias lineares longas e formam pontes de hidrogênio com as microfibrilas de celulose, estabilizando a parede, ao passo que as pectinas integram as camadas intercelulares que promovem a união entre células vegetais adjacentes, conhecidas conforme lamelas médias, evitando a agregação e o colapso das microfibrilas de celulose, além de influenciar na permeabilidade da parede celular em relação às macromoléculas (LEHNINGER et al, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2013).
Além dos polissacarídeos, existem, também, nas paredes celulares glicoproteínas estruturais, pertencentes a diferentes classes, as quais podem atuar na adesão celular ou mesmo nos mecanismos de sinalização celular (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Algumas estruturas celulares, tal qual a membrana plasmática, as vesículas de secreção advindas do complexo de Golgi e os microtúbulos atuam continuamente durante a síntese das paredes celulares (RAVEN et al, 2007; TAIZ & ZEIGER, 2013).
Para que a parede celular vegetal cresça em superfície e volume é necessário que exista um controle bioquímico eficiente a partir do protoplasto, o conjunto formado pelo citoplasma celular juntamente com o núcleo (RAVEN et al, 2007).
O processo de crescimento envolve a perda da organização original da parede, todavia de modo a permitir a expansão adequada do protoplasto mantendo um mínimo de rigidez, a fim de impossibilitar o rompimento celular (RAVEN et al, 2007).
A desorganização estrutural da parede se dá pela influência das proteínas de parede denominadas expansinas, as quais atuam juntamente com o hormônio giberelina, promovendo tanto a divisão quanto o alongamento celular. Esse último é promovido pela intensificação da extensibilidade da parede (HEPLER et al, 2001; RAVEN et al, 2007).
Os mecanismos de expansão da parede celular seguem dois padrões básicos, tal qual o crescimento apical, de aspecto local e evidenciado em sistemas radiculares e tubos polínicos, e o crescimento difuso, de aspecto amplo e observado nas demais células vegetais (TAIZ & ZEIGER, 2013).
O primeiro padrão se relaciona intensamente ao citoesqueleto e os microfilamentos de actina, ao passo que o segundo se vincula tanto aos microtúbulos, quanto aos microfilamentos de actina (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Na presença de um ambiente ácido, induzido pela aplicação de um tampão ácido, por exemplo, os polímeros presentes na composição das paredes celulares sofrem um
25 fenômeno denominado de deslizamento, o qual representa a extensão irregular resultante do escorregamento relativo desses polímeros, proporcionando uma rápida extensão da parede, dependente do tempo, podendo continuar por muitas horas (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Estudos relacionados ao processo de formação da parede celular são constantemente executados, com o intento de obter informações importantes acerca da fisiologia dessa estrutura que se relaciona diretamente com os diferentes processos efetuados ao longo de todo o ciclo de vida das plantas, inclusive para a formação e o alongamento do tubo polínico.
2.3.1 Formação e germinação in vitro do tubo polínico
O tubo polínico corresponde a uma estrutura vegetal que inicia sua formação no momento em que o grão de pólen atinge o estigma da respectiva flor feminina e algumas condições são requeridas para que ocorra o crescimento do tubo polínico, tais quais: o fluxo iônico, sobretudo o de cálcio, a formação de um pH ácido, em torno de 6,5 ou inferior (HOLDAWAY-CLARKE & HEPLER, 2003), além de necessitar de um mecanismo bioquímico de sinalização celular por mediadores químicos que orientam o seu alongamento (FRANKLIN-TONG, 1999; HOLDAWAY-CLARKE & HEPLER, 2003).
O crescimento do tubo polínico é conspícuo (Figura 8), visto que é especialmente diferenciado do crescimento dos demais tecidos vegetais, em geral, pois ocorre exclusivamente em uma pequena área a partir do ápice da célula em alongamento (FRANKLIN-TONG, 1999; HEPLER et al, 2001; HOLDAWAY-CLARKE & HEPLER, 2003; KROEGER et al, 2008).
Figura 8 – Esquema do mecanismo de crescimento do tubo polínico com as principais estruturas intracelulares envolvidas.
26 Anteriormente ao crescimento do tubo polínico, o pólen é reidratado e a partir desse momento se forma uma pressão de turgor no interior do grão de pólen, promovendo assim um influxo de íons, especialmente o cálcio, além da reorganização do citoesqueleto e da migração das vesículas de secreção, de mitocôndrias e cisternas do retículo endoplasmático, polarizando, desse modo, o citoplasma da célula vegetativa do grão de pólen (CHEBLI & GEITMANN, 2007; FRANKLIN-TONG, 1999; KROEGER et al 2008; SHI & YANG, 2010).
Os íons cálcio apresentam importância significativa para o processo de expansão do tubo polínico nas fanerógamas, uma vez que esses cátions atuam conforme segundos mensageiros, modulando e coordenando o trânsito de vesículas secretórias e a reorganização do citoesqueleto e das fibras de actina (STEINHORST & KUDLA, 2013).
Os estudos acerca do crescimento apical, um padrão de expansão celular vegetal, se mostram extremamente relevantes para explicar o processo de formação de tubos polínicos. Sabe-se que os microfilamentos de actina constituem as estruturas intracelulares relacionadas diretamente ao mecanismo de expansão celular responsável pelo alongamento da ponta do tubo polínico em direção à abertura da micrópila, permitindo a migração das células espermáticas para o interior do saco embrionário, a fim de promover a dupla fecundação nas angiospermas (RAVEN et al, 2007; TAIZ & ZEIGER, 2013).
O tubo polínico de Ricinus communis L. pode constituir um importante sistema modelo para os estudos vinculados ao transporte vesicular, à reorganização do citoesqueleto e aos mecanismos envolvidos na regulação dos fluxos iônicos (STEINHORST & KUDLA, 2013).
O desenvolvimento in vitro de pólens constitui um importante mecanismo laboratorial utilizado para os estudos relativos à germinação do pólen e ao crescimento do tubo polínico, uma vez que permite simular em um tubo as condições necessárias naturalmente para que esses fenômenos ocorram.
Por meio desse processo é possível controlar e modificar as condições do meio, tais quais: a temperatura, o pH, a presença de íons livres, além da concentração dos solutos (CUCHIARA et al, 2015). Portanto, consta em um método eficaz para selecionar o meio mais apropriado para a germinação do pólen de determinada espécie vegetal a partir da análise qualitativa das necessidades nutricionais da mesma (CUCHIARA et al, 2015).
A determinação da viabilidade polínica é realizada mediando o uso de microscopia óptica (CUCHIARA et al, 2015), associada a algum método quantitativo de análise, tal qual a contagem em câmara de Neubauer.
27 2.4 Análise proteômica de pólen
Um método convencional utilizado para a análise proteômica de pólen consta na separação de proteínas em gel, em seguida, a análise por espectrometria de massa é executada e, por fim, a busca em bancos de dados é realizada de modo a permitir a compilação das características das proteínas presentes na amostra, em relação à função bioquímica desempenhada pela mesma (CHEN et al, 2007).
Para obter uma amostra de boa qualidade são requeridos os processos de purificação e enriquecimento das proteínas (CHEN et al, 2007).
Utiliza-se, comumente, o protocolo de extração por meio de acetona e TCA para obter proteínas advindas de pólen e tubo polínico, uma vez que esses tecidos são muito rígidos, necessitando de maceração vigorosa e de meio ácido para que as proteínas sejam extraídas de modo eficiente (CHEN et al, 2007).
Em geral, o transcriptoma dos grãos de pólen é único e diminuto (CHEN et al, 2007). Além do que, a maioria dos genes expressos codificam proteínas relacionadas à sinalização celular, ao transporte de vesículas e aos processos de reorganização do citoesqueleto (CHEN et al, 2007). Esses eventos celulares estão diretamente relacionados à germinação do pólen e à formação do tubo polínico (CHEN et al, 2007).
A partir dos estudos de proteômica relacionados ao desenvolvimento do gametófito masculino em angiospermas, algumas classes de proteínas foram encontradas, as quais se relacionam aos processos importantes para o desenvolvimento do pólen, tais quais: o metabolismo dos açúcares, o alongamento celular e a expansão celular (CHEN et al, 2007).
A realização desses estudos visa ampliar o conhecimento acerca dos processos de regulação do pólen e de desenvolvimento do tubo polínico (CHEN et al, 2007).
2.5 Eletroforese em gel
A eletroforese, bem como suas derivações, representa uma ferramenta importante para a separação e a identificação dos componentes biológicos (COMPRI-NARDY et al, 2011).
Esse método biofísico de segregação consiste em submeter uma amostra desejada a um campo elétrico, DDP, a qual é encarregada de promover a migração dos constituintes de acordo com a carga elétrica (COMPRI-NARDY et al, 2011).
28 intensidade da carga elétrica, o grau de dissociação dos compostos, a força do campo elétrico, a presença de substâncias anfóteras, as quais funcionam simultaneamente conforme ácidos ou bases, a distância entre os eletrodos, o tempo de corrida, o tamanho e a forma da partícula, a viscosidade e a concentração eletrolítica do meio (ROCHA et al, 2005; COMPRI-NARDY et al, 2011).
A migração de partículas via eletroforese conserva a estrutura, bem como as propriedades físico-químicas das moléculas, justificando a notável aplicação desse procedimento nas áreas da Bioquímica e da Biologia Molecular (ROCHA et al, 2005), com o intuito de separar os íons orgânicos e inorgânicos, os peptídeos, os ácidos nucléicos, dentre outros compostos carregados (ROCHA et al, 2005; COMPRI-NARDY et al, 2011).
Focando-se na estrutura dos polipeptídeos, especificamente as proteínas, têm-se radicais polares que conferem ao composto a classificação conforme uma substância anfótera comportando-se como ácidos ou bases fracas, portanto, capaz de sofrer ionização de acordo com o pH do meio (COMPRI-NARDY et al, 2011).
Se a proteína permanecer em um meio, cujo pH for igual ao seu pI, o ponto isoelétrico no qual a proteína ou o aminoácido se apresenta na forma zwitteriônica e possui o somatório de suas cargas parciais nula, ela não migrará, permanecendo estacionária, ao passo que ao submeter-se a um pH acima do seu pI, adquire carga negativa e, caso o pH seja inferior ao pI, assume carga positiva (BERKELMAN & STENSTED, 1998; ROCHA et al, 2005; COMPRI-NARDY et al, 2011).
Para a eletroforese das proteínas foi utilizado o gel de poliacrilamida, o qual resulta da copolimerização da acrilamida e da bisacrilamida, formando uma malha composta por microporos, os quais possuem diâmetro inversamente proporcional à concentração de acrilamida (ROCHA et al, 2005).
A fim de manter a estabilidade dos componentes proteicos em solução, diferentes soluções tampões foram utilizadas (LAEMMLI, 1970).
2.5.1 Análise de imagens
O software ImageJ é um freeware, portanto sua licença é gratuita, estando a disponibilidade de todos na internet, e sua análise é baseada na densitometria óptica das bandas presentes nos géis de poliacrilamida escaneados (FERREIRA & RASBAND, 2012).
O programa conta todas as micropontoações de tonalidade escura presentes nas imagens dos géis, permitindo estabelecer uma relação quantitativa entre as densidades ópticas
29 das bandas da sequência-alvo, em relação às bandas do grupo referencial, o qual pode ser representado pelo marcador molecular ou o grupo controle do experimento (FERREIRA & RASBAND, 2012; VIEIRA, 2002).
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Estabelecer um protocolo eficiente para a germinação in vitro de tubo polínico em pólen de mamoneira (Ricinus communis L.).
3.2 Objetivos específicos
Selecionar o meio de crescimento de pólen mais eficiente para o desenvolvimento de tubo polínico em pólen de mamoneira.
Realizar a separação eletroforética dos extratos de proteínas obtidas a partir dos pólens submetidos ao meio de crescimento selecionado conforme mais eficiente.
Comparar os perfis de proteínas relacionados aos respectivos estágios de desenvolvimento do pólen (pólen não germinado, pólen germinado e pólen com tubo polínico estabelecido) por intermédio da análise digital, mediante software de imagens, dos géis de poliacrilamida obtidos via eletroforese SDS-PAGE.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção do meio de crescimento de pólen 4.1.1 Coleta e separação do material biológico
Plantas adultas de mamoneira (Ricinus communis L.) da variedade Paraguaçu, cultivadas no Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará, na latitude 3º74‟S e na longitude 38º57‟W, tiveram removidas as flores masculinas contendo as anteras em iminência de abertura e repletas de grãos de pólen.
As flores coletadas foram, então, condicionadas em pequenas sacolas de papel toalha e secas à temperatura ambiente e, posteriormente, passaram por uma etapa mecânica de separação do pólen.
30 Na maioria das coletas realizadas ao longo do experimento foram removidas, aleatoriamente, quinze (15) anteras que foram utilizadas em cada replicata biológica.
Uma pinça metálica foi utilizada para ter acesso às anteras, as quais foram seccionadas das flores masculinas e postas em peneiras sequenciadas.
A primeira peneira apresentava malha 60 e abertura de 0,250 mm, na qual as estruturas da antera foram gentilmente quebradas, por meio de um pistilo em almofariz, permitindo o acesso ao pólen, e na sequência o material selecionado passou por uma nova separação em uma segunda peneira de malha 270 e abertura de 0,053 mm, obtendo-se majoritariamente os pólens advindos das anteras.
A partir de cada grupo de quinze androceus foi obtido cerca de 10,0 mg de massa seca (MS) de pólen.
As coletas ocorreram no período compreendido entre as 7:30 e as 8:30 horas da manhã, visto que nesse período as anteras podem ser encontradas em um estado de deiscência incompleta, o que impede o contato direto dos grãos de pólen com o meio externo, reduzindo ou mesmo anulando a existência de contaminantes na amostra inicial.
4.1.2 Preparo e aplicação dos meios de germinação
Foram utilizados dois meios de crescimento diferentes, o primeiro contendo somente água destilada, sacarose (C12H22O11) e ácido bórico (H3BO3) e um segundo meio
contendo, igualmente, água destilada, sacarose e ácido bórico, além de outros compostos adicionais como cloreto de cálcio (CaCl2), nitrato de cálcio [Ca(NO3)2], sulfato de magnésio
(MgSO4) e DMSO (C2H6OS).
O meio composto por água destilada, sacarose e ácido bórico, denominado SB, foi preparado segundo CUCHIARA et al (2008), mediante algumas modificações.
Foram preparadas três soluções, de 100,0 mL cada, com diferentes concentrações de sacarose (2,5 %, 5,0 % e 7,5 %) (m/v) e ácido bórico (5,0 mg/L) (m/v), às quais foram adicionadas massas equivalentes de pólens (média de 10,0 mg) em tubos de 15,0 mL, obtendo-se triplicatas biológicas para cada concentração utilizada, nomeados de acordo com os constituintes do meio de crescimento e a concentração de sacarose utilizada (SB2,5%1,
SB2,5%2, SB2,5%3, SB5,0%1, SB5,0%2; SB5,0%3; SB7,5%1, SB7,5%2 e SB7,5%3).
O grupo controle (GC) para o experimento constou de pólens imersos em água destilada, na ausência de sacarose e ácido bórico, sendo nomeados (GC1, GC2 e GC3).
31 O material foi incubado durante 24 horas, a temperatura ambiente, e, posteriormente, foram aliquotados 10,0 µL de solução para a confecção de lâminas, a fim de detectar via microscopia óptica a existência de pólens com tubos polínicos desenvolvidos.
O segundo meio, denominado PGM (meio de crescimento de pólen), foi sintetizado de acordo com HARTMAN et al (2014), mediante alterações.
Foi preparada uma solução contendo água destilada, sacarose (0,005%) (m/v), ácido bórico (0,010 %) (m/v), cloreto de cálcio (0,5 mM) (m/v), nitrato de cálcio (0,5 mM) (m/v), sulfato de magnésio (0,5 mM) (m/v), além de dimetilsulfóxido (2,0 %) (v/v), essa solução apresenta pH 6,5.
Massa equivalentes de pólens, aproximadamente 10,0 mg, foram condicionadas em tubos de 15,0 mL e, então, foi adicionado 10,0 mL da solução PGM em cada tubo, formando dois pares de triplicatas biológicas, nomeadas segundo o estágio do pólen pretendido e o respectivo número de 1 a 3 (PG1, PG2, PG3, PTP1, PTP2 e PTP3).
Outros três tubos foram separados, aos quais foram adicionadas as mesmas quantidades anteriores de pólens e o volume de 10,0 mL de meio PGM contendo 10% de DMSO, de modo a constituir a triplicata do grupo controle (GC) do experimento, nomeado do mesmo modo que as amostras anteriores (GC1, GC2 e GC3).
O material foi incubado durante 24 horas, a temperatura ambiente, e, posteriormente, foram aliquotados 10,0 µL de solução para a confecção de lâminas, a fim de detectar a existência de pólens com tubos polínicos desenvolvidos, via microscopia óptica.
Com o intendo de facilitar a contagem celular, alíquotas de 200,0 µL das triplicatas dos tratamentos foram transferidas para uma microplaca de 96 poços de fundo chato para titulação em ELISA, após a imersão dos pólens nos meios de crescimento. As alíquotas removidas para a contagem de pólens e do percentual de germinação de tubo polínico foram retiradas dessa placa.
O percentual mínimo de germinação atingido pelo meio para que esse seja selecionado conforme apropriado para a germinação de pólen de mamoneira é de 50,0%.
4.1.3 Contagem de pólens e determinação do percentual de germinação
A contagem total de pólens e de pólens com tubo polínico desenvolvido foi realizada mediante o uso da câmara de Neubauer, a qual permite a análise quantitativa de amostras biológicas, contendo células ou estruturas microscópicas dissolvidas em solução, via microscopia óptica (Figura 9).
32 Figura 9 – Espaço amostral utilizado em câmara de Neubauer para contagem de pólens.
Fonte: Dados do autor.
A equação utilizada para calcular o número total de pólens, com ou sem tubos polínicos estabelecidos, na alíquota é:
y = m/144 x 4 x 106
Observando-se a equação, y representa o número total de células na alíquota aplicada na câmara e m perfaz a média do número de células contadas nos dois espaços amostrais da câmara.
Os pólens foram caracterizados conforme alteraram a morfologia ao longo de tempo (Figura 10) em: pólens não germinados (P) foram aqueles que não evidenciaram qualquer modificação morfológica relevante após o período de incubação no meio; pólens germinados (PG) foram aqueles que continham um tubo polínico proeminente e se encontravam túrgidos, em relação ao volume inicial do pólen antes da incubação; e pólens com tubo polínico estabelecido (PTP) foram aqueles que apresentaram tubos polínicos com comprimentos iguais ou superiores ao diâmetro do pólen após o fim do período de incubação, em conformidade com CHAGAS et al (2010), seguido de algumas alterações.
Figura 10 – Fotomicrografias dos estágios do desenvolvimento do pólen de Ricinus communis L. A – pólen não germinado (P); B – pólen germinado (PG) e C – pólen com tubo polínico estabelecido (PTP).
33 4.2 Extração de proteínas
O protocolo para extração de proteínas totais das amostras de pólen de R. communis L. foi executado de acordo com SHEORAN et al (2007), seguido de algumas modificações.
A solução de extração de proteínas é constituída por acetona, TCA (10,0 %) (m/v) e DTT (1,0 %) (m/v).
Após o término do período de incubação das amostras em meio de crescimento, as soluções foram centrifugadas, em centrífuga de bancada Eppendorf Centrifuge 5810 R, a 4ºC e submetidas a 14.000 g, durante 15 minutos, e o sobrenadante descartado, com o intuito de remover os meios de crescimento, e o precipitado resultante foi, então, transferido para tubos Eppendorf de 1,5 mL.
Três lavagens com acetona foram realizadas, mediante centrifugação e remoção do sobrenadante, nas mesmas condições anteriores, e, posteriormente, a massa de pólens resultante foi seca, na capela, a temperatura ambiente.
Após a secagem, alíquotas de 600,0 µL de solução de extração foram adicionadas a cada 10,0 mg de amostra e, em seguida, incubadas em freezer, a –20 ºC, overnight.
No dia seguinte, as amostras foram retiradas do freezer e submetidas novamente à centrifugação, nas mesmas condições, o sobrenadante foi novamente descartado e 600,0 µL de uma solução de acetona e DTT (1,0 %) (m/v) foram adicionados a cada tubo.
Os tubos permaneceram guardados no freezer durante uma hora e, em seguida, foram novamente centrifugados para remover a solução adicionada e três lavagens consecutivas com acetona gelada foram promovidas de modo a remover completamente o excesso de TCA.
As triplicatas foram, então, submetidas a uma nova secagem, a fim de prepará-las para a etapa posterior de solubilização das proteínas.
A solubilização das proteínas foi efetuada por meio de uma solução composta por uréia (7,0 M) (m/v), tiouréia (2,0 M) (m/v).
Após a adição dessa mistura às amostras, os tubos permaneceram sobre constante agitação, em mesa agitadora Eppendorf Mixer 5432, durante 20 minutos.
Em seguida, o material foi centrifugado novamente, a –4 ºC e submetido a 14.000 g, por 15 minutos, em centrífuga de bancada Eppendorf Centrifuge 5804 e o sobrenadante foi transferido para novos tubos com o mesmo nome das respectivas amostras e o precipitado foi guardado no freezer para eventual reutilização.
34 4.3 Quantificação de proteínas
Os novos tubos contendo as proteínas solubilizadas a partir das respectivas amostras iniciais foram, então, submetidos à quantificação de proteínas através da metodologia descrita pelo fabricante do equipamento Qubit® 2.0 Fluorometer, produzido pela empresa Life Technologies, o qual consta de um fluorímetro, cujo funcionamento permite a quantificação de proteínas, utilizando-se corantes fluore scentes específicos para os compostos proteicos, revelando alta sensibilidade e especificidade.
Para a quantificação no Qubit é requerida uma solução de trabalho, a work solution ou WS, a qual foi preparada no escuro e é constituída por um tampão e um reagente, específicos para proteínas, de composição química protegida por lei de patente, ambos fornecidos juntamente com o equipamento.
O volume total da WS deve atingir os 200,0 µL de volume final, representando o somatório de 199,0 µL do tampão e 1,0 µL do reagente Qubit para proteínas.
Ao todo, para capa tratamento realizado, foram requeridos volumes da WS diretamente proporcionais ao número de amostras analisadas, acrescido de um volume adicional para uma análise extra em caso de erros no preparo das amostras.
Foram aliquotados 1,0 µL de cada amostra e a esse volume foi adicionado 199,0 µL de work solution, obtendo-se, também, 200,0 µL da solução a ser quantificada. A quantificação foi realizada para todas as amostras, incluindo-se o grupo controle.
4.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida
A obtenção do perfil de proteínas foi realizada mediante eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) de acordo com a metodologia descrita por LAEMMLI (1970), seguida de modificações.
O gel utilizado para a corrida eletroforética unidimensional é composto por duas fases ou géis, o gel de corrida e o gel de aplicação, ambos compostos por água ultrapura, mix de acrilamida 30,0% (contendo acrilamida 29,0 % e bisacrilamida 1,0 %) (m/v), tampões TRIS-HCl com concentrações e pHs diferenciados para cada fase do gel (1,0 M e pH 6,8 para o gel de aplicação e 1,5 M e pH 8,8 para o gel de corrida), SDS 10,0 % (m/v), PSA 10,0 % (m/v) e TEMED em quantidades traço.
Após a preparação dos géis, as amostras foram misturadas ao tampão de amostra e, em seguida, aplicadas nos respectivos poços.
35 Um marcador molecular foi aplicado no primeiro poço de cada gel, de modo a atribuir um referencial de massa para a determinação aproximada do peso das bandas de proteínas obtidas nos géis finais.
Os géis foram, então, submetidos a uma DDP e as proteínas foram separadas via eletroforese unidimensional.
Após a eletroforese, os géis foram imerso em uma solução corante, formada principalmente por PhastGel Blue R para a revelação das bandas de proteínas.
4.5 Análise digital dos géis de poliacrilamida
Os géis obtidos após a corrida eletroforética foram submetidos à análise por densitometria óptica, utilizando o software ImageJ, a partir da qual foram obtidos gráficos para relacionar os parâmetros encontrados durante a análise aos perfis de proteínas presentes nos géis.
A análise foi realizada seguindo o especificado no guia do usuário do software de acordo com FERREIRA & RASBAND (2012).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Comparação da eficiência dos meios de crescimento e seleção do melhor meio
O meio composto somente por sacarose e ácido bórico revelou, ao longo das aplicações, uma menor eficiência para promover a germinação dos pólens de R. communis L. (Figura 11), uma vez que o maior percentual de germinação alcançado para a concentração de 7,5 % de sacarose, datada de 2 de julho de 2014, obteve o resultado de 49,0 %, o qual ficou abaixo do mínimo de 50,0 %.
36 Figura 11 – Intervalos dos percentuais de germinação dos pólens nos meios SB, de acordo com as respectivas datas de contagem. As datas apresentadas fazem referência, respectivamente, ao primeiro e ao último grupo de amostras aplicadas em meio SB.
Fonte: Dados do autor.
Em algumas amostras desse tratamento, observadas em microscópio óptico, foi notada a presença de pólens morfologicamente anômalos, uma vez que aparentemente emitiam tubos polínicos a partir dos três cólporos (Figura 12).
Não se sabe ao certo se as estruturas que emergem dessas aberturas são tubos polínicos em alongamento, ou se representam somente o esxudato do material do protoplasma do grão de pólen, indicando que o meio composto somente por sacarose e ácido bórico não é suficiente para o estabelecimento pleno do tubo polínico, gerando anormalidades, em alguns casos.
Figura 12 – Fotomicrografias de pólens anômalos com possíveis tubos polínicos múltiplos.
37 Sabe-se que alguns nutrientes minerais são essenciais para o funcionamento de inúmeros processos nos vegetais, desempenhando diferentes funções bioquímicas (TAIZ & ZEIGER, 2013).
O meio PGM, diferentemente, revelou uma maior eficiência para germinar os pólens de mamona (Figura 13), uma vez que obteve valores normalmente superiores a 50,0 %, além de alcançar em uma das repetições a marca de 93,3 %, justificando sua seleção conforme um meio ideal para a germinação dos pólens de Ricinus communis L.
Figura 13 – Intervalos dos percentuais de germinação dos pólens em meio PGM, de acordo com a respectiva data da contagem.
Fonte: Dados do autor.
A sacarose presente no meio de crescimento apresenta duas funções básicas: fornecer energia para o pólen em desenvolvimento e equilibrar osmoticamente o pólen e a solução nutritiva (JUSTO et al, 2008).
O boro, por sua vez, ainda não apresenta um papel preciso no metabolismo celular vegetal, todavia são atribuídas a esse íon funções relacionadas ao alongamento celular, à síntese de ácidos nucléicos, às respostas hormonais, ao funcionamento da membrana e à regulação do ciclo celular (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Há indícios de que o boro pode afetar diretamente o processo de formação dos polissacarídeos da parede celular, alterando a capacidade dessa estrutura de se reorganizar espacialmente para formar o tubo polínico, além de promover a germinação do pólen e acelerar a chegada do tubo polínico na micrópila (LIU et al, 2013).
38 funções nos organismos vegetais.
O cálcio é requerido para a síntese de novas paredes celulares, mais precisamente a lamela média, sendo necessário para o funcionamento normal das membranas vegetais, além de ser indispensável à formação do fuso mitótico durante a divisão celular (TAIZ & ZEIGER, 2013).
Ao cálcio é atribuído, também, o papel de segundo mensageiro em diversas respostas vegetais aos fatores ambientais ou hormonais, uma vez que esse pode se ligar à calmodulina (STEINHORST & KUDLA, 2013), uma proteína citosólicas vegetal, atuando tanto para a regulação quanto para a integração dos diferentes processos biológicos que ocorrem, concomitantemente, durante as etapas de formação do tubo polínico, a exemplo: controle do crescimento celular, transporte vesicular, sinalização intracelular e autoincompatibilidade em algumas espécies. (STEINHORST & KUDLA, 2013; TAIZ & ZEIGER, 2013).
Os íons nitrato, por sua vez, conferem à planta o elemento nitrogênio, o qual é exigido em maior quantidade pelos organismos vegetais, visto que é um constituinte dos aminoácidos, das proteínas e dos ácidos nucleicos, portanto a deficiência desse íon inibe rapidamente o crescimento vegetal (TAIZ & ZEIGER, 2013).
O magnésio é um íon essencial para a ativação de enzimas envolvidas na respiração celular, na fotossíntese e na síntese de DNA e RNA, além de ser elemento constitutivo da molécula de clorofila (TAIZ & ZEIGER, 2013). Esse íon também possui a capacidade de aumentar a atividade da enzima celulose-sintase (FUJII et al, 2010).
O cloreto é o íon necessário para que ocorra a clivagem das moléculas de água durante a fotossíntese para produzir o oxigênio, além de participar da divisão celular nas folhas e nas raízes (TAIZ & ZEIGER, 2013).
O sulfato é uma importante fonte de enxofre, o qual está presente nos aminoácidos, além de compor, igualmente, as estruturas de várias coenzimas e vitaminas essenciais ao metabolismo (TAIZ & ZEIGER, 2013).
O dimetilsulfóxido é um solvente polar que, em concentrações superiores a 5,0%, afeta negativamente o crescimento e o desenvolvimento celular. O DMSO atua sobre as etapas iniciais de germinação do grão de pólen, porém não inibe completamente o metabolismo celular (DICKINSON & COCHRAN 1968).
Considerando-se o funcionamento sincronizado e complementar dos complexos enzimáticos sacarose-sintase e celulose-sintase durante a polimerização das fibras de celulose da parede celular vegetal é possível sugerir uma provável explicação para a melhor eficiência,
39 quanto à germinação dos pólens, do meio PGM em relação ao meio SB.
No meio SB é fornecida a sacarose, o substrato sobre o qual a sacarose-sintase atua para obter a glicose que será doada à celulose-sintase, via UDP, todavia não são fornecidos os íons promotores de algumas enzimas que atuam nos processos necessários ao alongamento do tubo polínico, a exemplo do íon magnésio, o qual age como potencializador da atividade do complexo celulose-sintase (FUJII et al, 2010), e do íon cálcio, um segundo mensageiro que modula e coordena o trânsito de vesículas secretórias e a reorganização do citoesqueleto e das fibras de actina (STEINHORST & KUDLA, 2013).
Portanto, uma vez que o meio PGM contém, especialmente, os íons cálcio [Ca2+(aq)], magnésio [Mg2+(aq)] nas suas formas aquosas, ele proporciona um suprimento mais eficiente de minerais necessários aos grãos de pólen para a síntese de parede celular, durante o alongamento do tubo polínico.
5.2 Extração e quantificação de proteínas
A solução de extração utilizada foi composta por acetona, TCA (10,0 %) e DTT (1,0 %).
A acetona, um solvente orgânico, juntamente com o TCA, exibe a função de remover os interferentes presentes na amostra inicial, tais quais lipídeos, sais, fenóis e polissacarídeos, a fim de melhorar a resolução do gel final (ZHOU et al, 2002).
O DTT, por sua vez, consta em uma molécula redutora, a qual quebra as pontes dissulfetos, auxiliando no desarranjo das estruturas tridimensionais dos polipeptídeos (ROCHA et al, 2005).
Para a quantificação, as proteínas são, então, solubilizadas em solução de uréia (7,0 M) e tiouréia (2,0 M).
A uréia é um importante agente caotrópico promotor da solubilização das proteínas e sua ação é potencializada pela combinação desse composto com outro agente caotrópico, a tiouréia, um composto orgânico cuja fórmula molecular difere da uréia somente pela substituição do átomo de oxigênio pelo átomo de enxofre (ROCHA et al, 2005).
A tiouréia é mais eficiente do que a uréia isolada, todavia pouco solúvel em água, e atua na solubilização das proteínas por meio do rompimento das interações não covalentes existentes entre os polipeptídeos (ROCHA et al, 2005).
O resultado das médias das quantificações de proteínas apresentou (Figura 14) o maior valor médio para as amostras de pólen (P) datadas de 25 de junho de 2014, de 0,11 mg
40 de proteínas contidas em cada mg de MS de pólen e o respectivo valor bruto de 0,16 mg de proteínas (Tabela 1) para a amostra P1 desse tratamento.
A menor média, por sua vez, de 0,013 mg de proteína por mg de MS de pólen foi encontrada para as amostras PTP, datadas de 29 de maio de 2015.
Figura 14 – Valores médios da relação entre a massa de proteínas obtida a partir da massa seca de pólens utilizada nos respectivos tratamentos. Os valores são expressos em mg de proteínas por mg de massa seca (MS) de pólen.
Fonte: Dados do autor.
Tabela 1 – Valores obtidos a partir da quantificação de proteínas pelo método Qubit.
Data 25.06.14 11.07.14 23.07.14 27.05.15 29.05.15 25.06.14 11.07.14 23.07.14 27.05.15 29.05.15
Amostra µg proteína /µL solução mg proteína / mg MS de pólen
P1 4,84 --- 4,03 0,66 --- 0,16 --- 0,08 0,01 --- P2 2,28 --- 3,36 1,01 --- 0,07 --- 0,06 0,02 --- P3 3,10 --- 2,90 1,44 --- 0,10 --- 0,05 0,02 --- PG1 --- --- 3,15 0,64 0,75 --- --- 0,05 0,01 0,02 PG2 --- --- 3,80 1,13 0,40 --- --- 0,06 0,02 0,01 PG3 --- --- 1,43 --- 0,54 --- --- 0,02 --- 0,01 PTP1 --- 6,50 1,60 0,45 0,39 --- 0,04 0,02 0,009 0,01 PTP2 --- 7,70 1,20 1,38 0,55 --- 0,05 0,02 0,02 0,01 PTP3 --- 6,35 2,58 --- 0,87 --- 0,04 0,04 --- 0,02
41 Fonte: Dados do autor.
As amostras referentes aos pólens que não foram submetidos ao meio de crescimento (P1, P2 e P3) apresentaram as maiores massas de proteínas obtidas a partir de 1,0 mg de MS de pólen, em comparação às demais amostras, nas quais os pólens germinaram, indicando que durante o processo de germinação e alongamento do tubo polínico há a formação de vias metabólicas de degradação do conteúdo proteico do pólen.
5.3 Obtenção dos perfis de proteínas mediante eletroforese em SDS-PAGE e posterior análise de densitometria óptica das bandas de proteínas
O gel é constituído por uma matriz de poliacrilamida, um polímero da acrilamida com ligações cruzadas de N,N-metil-bis-acrilamida (ROCHA et al, 2005).
As duas fases do gel, aplicação e corrida, apresentam pHs diferenciados (WILSON & WALKER, 2010).
O gel de aplicação, ou empilhamento, possui pH 6,8, cuja finalidade é concentrar a amostra, formando bandas proteicas finas, anteriormente à entrada no gel de corrida, ou separação, de pH 8,8 (WILSON & WALKER, 2010).
O pH mais elevado do gel de separação garante a aceleração da corrida do material após a transição entre os géis (WILSON & WALKER, 2010).
O SDS, um surfactante aniônico, rompe as ligações não covalentes presentes entre as proteínas, desnaturando-as, além de possuir uma elevada carga negativa importante para a padronização de cargas das proteínas durante a corrida eletroforética, visto que as carrega negativamente e permite o fluxo unidirecional ao longo do gel (ROCHA et al, 2005).
Um gel contendo amostras referentes aos três estágios do desenvolvimento do pólen (P, PG e PTP) foi obtido (Figura 15).
Nesse gel foi possível identificar, a olho nu, tanto a existência de bandas de proteínas comuns aos três estágios quanto de bandas específicas para cada um, sugerindo que há diferenças quantitativas e qualitativas referentes ao conteúdo de proteínas das amostras analisadas.
42 Figura 15 – Gel obtido via eletroforese unidimensional em SDS-PAGE. Foi aplicada a massa de 20,0 µg de proteínas. Foi aplicado 5,0 µL de marcador molecular (M.M.). (Data: 24/07/2014)
Fonte: Dados do autor.
Em comparação ao marcador molecular, observaram-se bandas de proteínas com pesos moleculares inferiores a 97,4 kDa, relativo ao peso da fosforilase B.
As bandas das amostras P1 e P2 que se apresentaram mais escuras, intensas, se posicionaram próximas aos pesos 66,0 kDa, 20,1 kDa, 14,4 kDa e abaixo desse último; as das amostras PG1 e PG2 se mostraram mais evidentes quanto mais próximas aos pesos 66,0 kDa e 45,0 kDa, ao passo que as amostras PTP1 e PTP2 se revelaram mais intensas nas proximidades do peso 66,0 kDa.
Houve bandas evidentes, para os três estágios, próximas ao peso 66,0 kDa, referente à albumina bovina, sugerindo que a maioria das proteínas integrantes dessas bandas, possivelmente, não estão envolvidas diretamente com o mecanismo de alongamento celular, uma vez que se mantiveram praticamente constantes.
Foi observada, também, a presença de bandas teoricamente restritas às amostras de pólen não germinado, pesando aproximadamente 20,1 kDa, referente ao inibidor da tripsina.
O desaparecimento dessas bandas nas amostras de pólen germinado e de pólen com tubo polínico estabelecido permite inferir que, possivelmente, essas proteínas participaram de algum modo das reações processadas para a síntese de novas paredes celulares, inferindo a partir disso o provável consumo desses polipeptídeos e a eventual ausência das respectivas bandas nesses meios.
43 As linhas de plotagem (Figura 16) relativas aos perfis de proteínas encontrados para as amostras P1, PG1 e PTP1, no gel analisado, apresentaram um padrão de distribuição praticamente homogêneo para a corrida das amostras representado pelo ruído, ou elevações, todavia alguns picos (numerados de 1 a 14) foram identificados, os quais correspondem às bandas de proteínas com maior densidade de escuro, portanto mais destacadas.
Figura 16 – Análise de densitometria óptica do gel obtido via eletroforese unidimensional.
Fonte: Dados do autor.
Através da comparação desses picos foi possível determinar a existência de bandas comuns e exclusivas de cada material.
As bandas 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9 e 13 foram encontradas nos três estágios, indicando que as proteínas que apresentam esses respectivos pesos moleculares perduram no pólen, desde o início da germinação do pólen até o auge de alongamento do tubo polínico, ainda que em termos quantitivos as concentrações dessas proteínas sejam diferentes em relação a cada meio.
A concentração de proteínas em cada banda é estipulada pela área de cada pico, calculada a partir da região contida entre o ápice e a linha traçada abaixo de cada pico.
Por sua vez, a banda 6, de acordo com a análise gráfica, se mostrou presente somente na amostra PG1, sugerindo que, possivelmente, os polipeptídeos integrantes dessa banda podem ter se originado a partir do metabolismo de outros existentes no estágio anterior,
44 P1, e, por conseguinte, consumidos durante a transição do estágio PG para o PTP, explicando a redução acentuada das áreas relativas a essa banda ao longo dos três estágios de desenvolvimento do pólen.
As bandas 11, 12 e 14 foram identificadas graficamente na amostra P1, indicando o provável consumo desses polipeptídeos durante a formação e o alongamento do tubo polínico.
Um segundo gel (Figura 17), datado de 18 de março de 2015 foi obtido e a partir desse foi possível inferir que tal qual no gel anterior, observou-se a presença de bandas de proteínas restritas aos estágios apresentados (P e PTP).
Figura 17 – Gel obtido via eletroforese unidimensional em SDS-PAGE. Foi aplicada a massa de 20,0 µg de proteínas. Foi aplicado 5,0 µL de marcador molecular (M.M.). (Data: 18/03/2015)
Fonte: Dados do autor.
A separação das proteínas obtidas nesse gel não foi tão eficiente, evidenciando bandas proteicas muito agrupadas, todavia ainda foi possível observar bandas específicas para cada estágio, a exemplo das bandas de peso molecular aproximado de 20,1 kDa, referente ao inibidor da tripsina, as quais estão presentes apenas nas amostras P1 e P2.
Por sua vez, nas amostras PTP1 e PTP2 foi possível observar bandas com peso aproximado à lactoalbumina, 14,4 kDa.
