Seletividade/Especificidade

A seletividade é a capacidade de um método identificar e distinguir um analito específico em uma matriz complexa sem a interferência dos outros componentes. A matriz poderá conter compostos que interferem na medição. Esses interferentes poderão aumentar ou diminuir o sinal, a magnitude do efeito também dependerá da concentração do analito (Pereira, 2016; Guia RELACRE, 2000).

A especificidade de um método é quando este consegue separar o analito dos outros compostos presentes na amostra. Em resumo, é quando o sinal medido é proveniente

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unicamente do analito em estudo. É possível avaliar as interferências, através de um teste de recuperação com uma série de amostras, com a mesma matriz, apenas variando a concentração do analito, em duplicado e em condições de repetibilidade. O método será específico e seletivo quando obter taxas de recuperação próximas a 100%, ou de acordo com os critérios de aceitação pré-determinados pelo laboratório. (Guia RELACRE, 2000).

2.2. Sensibilidade

Irá avaliar a capacidade de um método ou equipamento distinguir as diferenças mínimas na concentração do analito. É definida como o quociente entre o acréscimo do valor lido (∆L) e variação da concentração (∆C) correspondente a esse acréscimo. A sensibilidade corresponde a derivada de primeira ordem da curva de calibração nessa zona de concentração, se a curva de calibração for um modelo linear, a sensibilidade será constante ao longo de toda a gama de trabalho, e equivalente ao declive da reta de calibração (Guia RELACRE, 2000). Sensibilidade = ∆L ∆C

2.3. Limiares analíticos

2.3.1. Limite de deteção (LD)

É o teor mínimo medido, no qual é detetado a presença do analito, entretanto, não necessariamente quantificada como valor exato, com uma certeza estatística razoável (usualmente 95%). Uma leitura inferior ao LD, não significa que o analito esteja ausente na amostra, apenas é afirmado que com a probabilidade definida, a concentração do analito será inferior a um certo valor (Pereira, 2016). É também denominado como a concentração mínima distinguível de uma amostra com a mesma matriz, mas sem o analito (branco).

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Onde:

Sy/x: desvio padrão residual da curva de calibração

b: declive da reta.

2.3.2. Limite de Quantificação (LQ)

Corresponde à menor concentração medida, na qual é possível quantificar o analito com uma determinada exatidão e precisão. Após a determinação de LQ, é necessário recorrer a uma série de padrões internos, em condições de precisão intermédia cuja concentração se encontre próxima ou igual à do limiar de quantificação, de modo a testar e verificar se a exatidão e precisão obtida é satisfatória.

(3)

2.4. Linearidade

Corresponde a capacidade do método analítico produzir um sinal diretamente proporcional à concentração do analito dentro do intervalo da gama de trabalho. Para traçar a curva de calibração são necessários definir no mínimo cinco pontos, excluindo o ponto zero para não proporcionar possíveis erros associados. Este parâmetro pode ser verificado através da visualização da reta de calibração do gráfico e do valor do coeficiente de correlação linear obtido que deve ser maior que 0,995 e por avaliação estatística através do teste RIKILT, o qual analisa a linearidade de cada ponto da curva de calibração (Fernandes, 2016).

y = ax + b (4) Em que: y: sinal instrumental a: declive da reta x: concentração do analito

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Para avaliar é necessário determinar a razão entre o sinal instrumental (yi) e a concentração

do padrão (xi) para cada ponto da reta e a média das razões obtidas (yi/xi)m. Na sequência é

calculada a percentagem da linearidade para cada ponto. E para que o método seja considerado linear, é considerado o valor da média como 100% o que indica uma linearidade perfeita, e cada ponto da reta deverá estar situado entre os 90% e 110%. Se houver algum valor fora deste intervalo, este deverá ser descartado e o teste RIKILT deverá ser novamente aplicado à gama reduzida, até se verificar os requisitos estabelecidos (Fernandes, 2016). A equação a ser utilizada está representada a seguir:

(5)

2.5. Gama analítica

A gama de trabalho corresponde ao intervalo de concentrações no qual o analito pode ser determinado com boa linearidade, precisão e exatidão. A escolha da gama, deve ter em consideração a abrangência de toda a gama de concentração das amostras, sendo recomendado que a concentração mais frequente das amostras incida sobre o centro da gama (Martins, 2016; Pereira, 2016).

2.6. Precisão

A precisão avalia a dispersão dos resultados obtidos em ensaios independentes, repetidos sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas. Permite constatar que o método tem a capacidade de repetir e reproduzir os resultados obtidos em análises sobre a mesma amostra ou padrão. É recomendável a utilização de amostras reais, para que o efeito matriz, que pode influenciar os resultados obtidos bem como a avaliação da precisão, seja considerado.

A dispersão é avaliada através de duas medidas extremas: repetibilidade e reprodutibilidade. Entre ambas existe uma situação intermédia designada por precisão intermédia ou variabilidade interlaboratorial (Guia RELACRE, 2000).

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A precisão pode ser expressa sob a forma de desvio-padrão:

(6)

Ou pelo coeficiente de variação:

(7) Em que s corresponde ao desvio padrão da precisão intermédia e 𝑥̅ a média dos resultados obtidos.

2.6.1. Repetibilidade

Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições idênticas (ensaios realizados sobre a mesma amostra, mesmo laboratório, mesmo analista, mesmo equipamento, mesmo tipo de reagentes e a curtos intervalos de tempo). Para determinar a repetibilidade de um método no próprio laboratório, é realizado uma série de medições (n ≥ 10) sobre uma mesma amostra ou padrões em condições de repetibilidade. O limite de repetibilidade é o valor máximo admissível para a diferença absoluta ente dois ensaios em condições de repetibilidade, determinada para o nível de confiança de 95%.

∆𝒓 = 𝒕u

𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) × √𝟐 × 𝐒̅𝒓i

(8) Onde o n é o número de réplicas que servem de base para determinar o desvio-padrão S̅𝒓i ,

referente à repetibilidade estimada 𝒕u

𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) o valor crítico da distribuição t-student, com um

nível de significância de 0,05 e com n-1 graus de liberdade.

É necessário também considerar o coeficiente de variação de repetibilidade, CVr que é

numericamente igual à razão entre o desvio-padrão da repetibilidade (Sri) e a média dos

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%𝑪𝑽𝒓 = 𝟏𝟎𝟎 × 𝑺𝒓𝒊

𝒙̅̅

(9) Para verificar o afastamento ou resultados discrepantes das medições, é necessário aplicar o teste de Grubbs: G calculado = |𝒙̅𝒔−𝒙̅̅| 𝒔 (10) xs é o valor suspeito 𝑥̅ é o valor médio s é o desvio padrão

Para n graus de liberdade para um nível de confiança de 99%:

Se Gcalculado < Gtabelado o valor suspeito não é aberrante face ao conjunto de dados

considerados;

Se Gcalculado > Gtabelado o valor suspeito é aberrante face ao conjunto de dados considerados,

logo deve ser rejeitado.

A homogeneidade das variâncias dos diferentes resultados para a análise da repetibilidade são avaliadas de acordo com o teste de Cochran. De modo a verificar se há diferenças significativas entre as variâncias ou não:

(11) Sri2máx é a variância máxima do conjunto de dados considerados

∑ Sri2 é o somatório de todas as variâncias consideradas

Para um nível de confiança de 95% com n-1 graus de liberdade, em que n é o conjunto dos dados considerados, temos:

Se Ccalculado < Ctabelado os conjuntos de dados considerados apresentam variâncias que não são

significativamente diferentes;

Se Ccalculado > Ctabelado os conjuntos de dados considerados apresentam variâncias que são

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2.6.2. Reprodutibilidade

Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições experimentais distintas, realizando o mesmo método de ensaio numa mesma amostra, variando apenas algumas condições como: operador, laboratório, equipamento e intervalo temporal.

A reprodutibilidade definirá a amplitude de erros aleatórios de quantificação a uma escala transnacional e só pode ser estimada através de ensaios interlaboratoriais. Assim é efetuado o envio de uma série de amostras aos laboratórios participantes, e estes realizam ensaios sobre a mesma amostra. A variância associada é calculada de acordo com a seguinte expressão: 𝑺2 𝑹𝒊 = 𝑺2𝑳𝒊 + 𝑺2𝒓𝒊 (12) Onde: 𝑺2 𝑹𝒊 : é a variância da reprodutibilidade 𝑺2 𝑳𝒊 : é a variância interlaboral 𝑺2 𝒓𝒊 : é a variância da repetibilidade

Se o principal foco é implementar um novo método de análise, o estudo da reprodutibilidade de um método é indispensável, pois verifica a precisão do método sobre diferentes condições de trabalho. Já quando o objetivo é a validação, o estudo da reprodutibilidade não possui a mesma importância, uma vez que o método será executado pelo mesmo laboratório, será utilizado o mesmo equipamento e as condições experimentais variam pouco ao longo do tempo.

2.6.3. Precisão intermédia

Exprime a precisão estimada sobre a mesma amostra ou padrão ao utilizar a mesma metodologia, o mesmo laboratório, estabelecendo exatamente as condições que sofrem alterações como operadores distintos, equipamentos distintos e intervalo temporal distinto. Para quantificar a precisão intermédia é necessário realizar várias medições sobre a mesma amostra, variando os parâmetros experimentais em cada análise. É realizada com base nas cartas de controlo de amplitudes, uma vez que, ao realizar as análises em dias diferentes há

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uma variação aleatória considerável dos parâmetros experimentais não controlados, que afetam o desempenho do método. A precisão intermédia é calculada consoante a seguinte expressão:

(13) Em que:

S precisão : é o desvio padrão relativo da precisão intermédia

n: o número de réplicas

t: número de amostras ensaiadas yjk :o resultado replicado

k: (variando k entre 1 e n) do padrão j (variando j entre 1 e t)

𝑦̅ j : a média aritmética dos resultados de n ensaios realizados sobre o padrão j (t – n) deve

ser superior a 15. Quando n= 2 temos:

14) Yj1 – primeiro resultado obtido para a amostra j;

Yj2 – segundo resultado obtido para a amostra j.

2.7. Exatidão

É a concordância do resultado obtido em um ensaio com um valor de referência tido como verdadeiro. Ao ser inserida em uma série de resultados é acompanhada de possíveis erros aleatórios e sistemáticos. Sendo assim, para avaliar a exatidão geralmente é utilizado materiais de referência certificados, ensaios interlaboratoriais e testes comparativos (Guia RELACRE, 2000).

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2.8.

Material de referência – FAPAS

A FAPAS é uma empresa de renome mundial e fornecedora de matrizes alimentares certificadas, utilizadas no controle de qualidade desde 1990. Estes materiais de controle são uma ferramenta de controlo interno dos resultados de um laboratório, assim como são úteis no treino do analista. As matrizes FAPAS são elaboradas com um rigoroso controlo da qualidade. A reprodutibilidade dos seus resultados é obtida mediante um consenso dos laboratórios do grupo, utilizando diferentes métodos analíticos. Geralmente o material de referência apresenta um relatório técnico, com a informação da matriz, gama de concentração e o valor médio medido.

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