Validação e revalidação de métodos para a análise de micotoxinas: Aflatoxina B1, B2, G1, G2, Desoxinivalenol, Zearalenona e Ocratoxina

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Validação e

revalidação de

métodos para a

análise de

micotoxinas:

Aflatoxina B1, B2,

G1, G2,

Desoxinivalenol,

Zearalenona e

Ocratoxina

Jefferson Vieira Santos

Mestrado em Tecnologia e Ciência Alimentar

Departamento de Química e Bioquímica 2018

Orientador

Luis F. Guido, Professor Auxiliar, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

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Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri,

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“A falta de conhecimento de ontem é o preconceito de hoje

gerando um amanhã de pura ignorância.”

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Agradecimentos

Os meus mais sinceros e sentidos agradecimentos vão para os meus familiares, em especial aos meus pais, que mesmo distantes sempre me encorajaram a lutar pelos meus objetivos, a enfrentar os obstáculos. Conseguiram transmitir conhecimentos que julgo serem de grande importância e que levarei sempre comigo: ter princípios e manter-se sempre humilde.

Aos meus irmãos, que acreditaram e acreditam no meu potencial e constantemente torcem por mim.

As minhas cunhadas, que as considero irmãs, muito obrigado por todo o apoio e pelas palavras de conforto.

Ao meu companheiro, o qual foi o principal motivador para eu ingressar no mestrado. Obrigado pelos momentos felizes e também por todas as dificuldades que passamos, porém, sempre nos apoiamos um ao outro, és uma das razões pelo qual luto todos os dias.

Aos meus poucos, mas bons amigos, por todas as boas vibrações. À “Francisquinha” a qual de colega, transformou-se em amiga, muito obrigado pelas palavras de apoio, pelo companheirismo, e por sermos parceiros de profissão e ajudar um ao outro mutuamente. À “Magg” por toda a solidariedade, preocupação, ajuda e por mostrar-se uma grande pessoa sempre disposta a ajudar.

Às técnicas de laboratório Joana Rangel e Olga Delgado, por todo o conhecimento transmitido, pela ajuda, pelas chamadas de atenção, pelas palavras de conforto e encorajamento.

Aos técnicos do laboratório de “MIA” por acreditarem no meu trabalho. E ao grupo Mérieux NutriScience Portugal, pela oportunidade em fazer parte desta equipa.

Ao meu professor orientador Luís Guido, pelo apoio, paciênca e por auxiliar a concretizar mais uma etapa na minha vida prossional/acadêmica.

A Portugal, este país maravilhoso, o qual considero minha segunda casa, e que no qual, trouxe tantas coisas boas para a minha vida.

A todos que diretamente ou indiretamente puderam fazer parte de mais este ciclo que se encerra, o meu muito obrigado.

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Resumo

O presente projeto de dissertação foi desenvolvido no âmbito do Mestrado em Tecnologia e Ciência Alimentar, como componente da unidade de estágio curricular em parceria com a empresa Mérieux NutriScience Portugal.

Com o objetivo de avaliar os níveis de contaminações de Aflatoxina B1, B2, G1, G2, Desoxinivalenol, Zearalenona e Ocratoxina, este trabalho teve como finalidade, validar e revalidar as metodologias analíticas utilizadas para a deteção e quantificação por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e adequação dos métodos utilizados no laboratório da Mérieux NutriSciences Portugal com a Mérieux NutriSciences Espanha. De forma a garantir a fiabilidade dos resultados, foram estudados parâmetros como: a repetibilidade do método, a precisão intermédia, os limiares analíticos, a gama de trabalho e a realização de testes de recuperação. Devido ao número extenso de matrizes a serem validadas para cada método e ao grande volume de trabalho nas instalações da empresa, consequentemente a indisponibilidade do equipamento (HPLC), não foi possível realizar todas as validações. Sendo assim, o principal foco deste projeto será nas Aflatoxinas.

O método para a análise das Aflatoxinas apresentou-se específico e seletivo ao cumprir os critérios de ensaios de recuperação estabelelecidos pelo Regulamento (EU) N° 519/2014 (50 a 120%), tendo os resultados obtidos ficado entre 76 e 119%. A exatidão foi constatada ao comparar os resultados obtidos com o das matrizes FAPAS, onde os resultados se enquadraram nos limites de concentrações descritos nos boletins. A linearidade fora comprovada com o teste de RIKILT e o modelo foi considerado linear. O limite de quantificação da reta obtido foi maior que a concentração do padrão de menor concentração, isto surge como um fator de segurança, pois, caso este não cumpra com os critérios de repetibilidade, é possível eleger o padrão subsequente, de modo a garantir resultados consistentes e coerentes. Parâmetros como a repetibilidade e precisão intermédia, também foram estudados, o coeficiente de variação manteve-se entre 11% e 6,4% respectivamente. Resultados estes considerados satisfatórios.

Palavras-chave: micotoxinas, Aflatoxina, Desoxinivalenol, Zearalenona, Ocratoxina, HPLC,

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Abstract

The following dissertation was developed under the Technology and Food Science Master’s Degree, as a component of a curricular unit internship done in partnership with Mérieux NutriScience Portugal.

With the objective of evaluating the contamination levels of Aflatoxin B1, B2, G1, G2, Deoxynivalenol, Zearalenone and Ochratoxin, this project aimed to validate and revalidate the analytical methodology used for detection and quantification through HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) and the adequacy of the methodology used in the Mérieux NutriSciences Portugal - Mérieux NutriSciences Spain laboratory. In order to guarantee the reliability of the results, parameters such as the following were studied: methodological repeatability, intermediate precision, analytical thresholds, the array of work and the realization of recovery tests. Due to the substantial number of evaluated matrices for each method, to the great amount of work done in company facilities, and to the consequent unavailability of equipment (HPLC), it wasn’t possible to execute every validation. Therefore, the main focus of this project will be aflatoxins.

The method used for aflatoxin analysis was specific and selective, complying with the recovery testing criteria established by rule No. 519/2014 of the Commission Regulation (EU) (50 to 120%), with results obtained lying between 76 and 119%. Accuracy was assured by comparing the obtained results with those of the FAPAS matrices, where the results fit the concentration ranges described in the data sheets. Linearity was validated with the RIKILT test and the model was considered linear. The quantification limit for the curve was greater than the concentration of the standard of lowest concentration. This arises as a safety factor, seeing as, if it doesn’t comply with the repeatability criteria, it’s possible to elect the subsequent pattern, so as to guarantee consistent and coherent results. Parameters such as repeatability and intermediate precision were also studied. The variation coefficient remained between 11% and 6.4%, respectively, yielding satisfactory results.

Keywords: mycotoxins, Aflatoxin, Deoxynivalenol, Zearalenone, Ochratoxin, HPLC,

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Índice

Agradecimentos ... ii Resumo ... iv Abstract ... v Índice ... vi Índice de figuras ... ix Índice de tabelas ... x Abreviaturas e símbolos ... xi Apresentação da empresa ... 1 Parte I -Teórica ... 3 1. Micotoxinas ... 4 1.1. Importância ... 4 1.2. Aflatoxina ... 5 1.3. Desoxinivalenol ... 6 1.5. Zearalenona ... 7

1.6. Distribuição geográfica, principais alimentos, efeitos toxicológicos e patológicos. ... 8

1.7. Teores máximos permitidos conforme o decreto CE N.1881 2016 ...10

1.8. Parâmetros para a deteção das micotoxinas ...11

1.8.1. Amostragem ...11

1.8.2. Matrizes complexas ...11

1.8.3. Limites de deteção baixos ...11

1.9. A técnica ...12

1.9.1. Preparação da amostra ...12

1.9.2. Extração com solventes ...12

1.9.2.1. Extração sólido-líquido ...12

1.9.2.2. Extração líquido-líquido ...13

1.9.2.3. Separação/purificação da micotoxina por Colunas de Imunoafinidade (IAC) ...13

1.9.3. Cromatografia ...15 1.9.3.1. Histórico ...15 1.9.3.2. Conceito ...16 1.9.4. Componentes de um HPLC ...17 1.9.4.1. Injetor ...17 1.9.4.2. Bomba ...17 1.9.4.3. Coluna cromatográfica...18

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1.9.4.4. Detetor ...19

1.9.4.5. Sistema de processamento de dados ...22

1.9.5. Os mecanismos de separação cromatográfica ...22

Parte II - Validação de métodos...25

2. Validação de métodos analíticos ...26

2.1. Seletividade/Especificidade ...26 2.2. Sensibilidade ...27 2.3. Limiares analíticos ...27 2.3.1. Limite de deteção (LD) ...27 2.3.2. Limite de Quantificação (LQ) ...28 2.4. Linearidade...28 2.5. Gama analítica ...29 2.6. Precisão ...29 2.6.1. Repetibilidade ...30 2.6.2. Reprodutibilidade ...32 2.6.3. Precisão intermédia ...32 2.7. Exatidão ...33

Parte III – Experimental ...35

3. Plano de validação ...36 4.1. Reagentes ...37 4.2. Materiais ...37 4.3. Equipamentos ...37 4.4. Soluções ...39 4.4.1. Procedimento ...39 4.5. Extração ...41 4.5.1. Caso geral ...41 4.5.2. Outros casos ...42

4.6. As principais adaptações realizadas para o ensaio ...45

5. Discussão dos resultados ...47

5.1. Matrizes analisadas ...47 5.2. Sensibilidade ...51 5.3. Limite de deteção - LD ...51 5.4. Limite de Quantificação - LQ ...51 5.5. Linearidade...52 5.6. Gama de Trabalho ...54 5.7. Precisão ...54

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5.7.1. Repetibilidade ...54

5.7.2. Precisão intermédia ...56

5.8. Exatidão ...58

7. Conclusão ...61

8. Referências ...62

Anexo 1 – Matrizes a serem validadas para Aflatoxinas ...65

Anexo 2 – Folha de cálculo para a repetibilidade ...66

Anexo 3 – Folha de cálculo para precisão intermédia ...66

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Índice de figuras

Figura 1 - Instalações da Silliker Portugal ... 2

Figura 2 - Funcionamento de uma coluna de imunoafinidade (Adaptado de Kos 2015) ... 14

Figura 3 - Cálculo para a resolução do pico (Silva, 2016)... 16

Figura 4 - Características químicas de uma amostra (Adaptado de Chust, 1990) ... 18

Figura 5 - Componentes de um HPLC (Adaptado de Keliri, 2017) ... 22

Figura 8 - Bomba ... 38

Figura 6 - Banho a 70°C ... 38

Figura 7 - Peça T ... 38

Figura 9 - Misturador de aço inox ... 41

Figura 10 - Sistema de imunoafinidade montado ... 42

Figura 11 – Colunas de imunoafinidade ... 42

Figura 12 - Fluxograma representativo da análise das Áflatoxinas ... 45

Figura 13 - Reta de calibração Afla G2... 50

Figura 14 - Reta de calibração Afla G1... 50

Figura 15 - Reta de calibração Afla B2 ... 50

Figura 16 - Reta de calibração Afla B1 ... 50

Figura 17- Linearidade Afla G2 ... 53

Figura 18 - Linearidade Afla G1... 53

Figura 19 - Linearidade Afla B2 ... 53

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Índice de tabelas

Tabela 1 - Principais micotoxinas de acordo com a região, principais alimentos e efeitos para

a saúde ... 9

Tabela 2 - Teores máximos permitidos para Aflas, DON, OCRA e ZEA em alimentos conforme o decreto CE N.1881 2016 ...10

Tabela 3 – Massa molecular e absortividade molar para as Aflatoxinas G2, G1, B2 e B1. ....40

Tabela 4 – Volumes para a reta de calibração dos padrões para as Aflatoxinas. ...40

Tabela 5 – Procedimento para a extração das Aflatoxinas nas matrizes que diferem do caso geral. ...43

Tabela 6 – Purificação por coluna de imunoafinidade para a análise das Aflatoxinas das matrizes que diferem do caso geral ...44

Tabela 8 - Principais alterações nas condições do HPLC para a análise das Aflatoxinas...46

Tabela 9 – Matrizes de referência utilizadas para a análise das Aflatoxinas ...47

Tabela 10 – Contaminação das amostras que não possuem Aflatoxinas. ...48

Tabela 11 - Padrões e áreas da reta de calibração para análise das Aflatoxinas ...49

Tabela 12 - Sensibilidade do método para cada Aflatoxina analisada. ...51

Tabela 13 - Avaliação da linearidade da reta de calibração das Aflatoxinas através do teste de RIKILT ...52

Tabela 14 – Matrizes analisadas para a determinação da repetibilidade, desvio padrão, coeficiente de variação e limite de repetibilidade relativo. ...55

Tabela 15 – Matrizes analisadas para a determinação da precisão intermédia, desvio padrão, coeficiente de variação e limite da precisão intermédia. ...57

Tabela 16 - Média, desvio padrão e coeficiente de variação para o ensaio de recuperação .59 Tabela 18 - Intervalos de aceitação para os ensaios de recuperação conforme o Regulamento (UE) N° 519/2014 ...60

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Abreviaturas e símbolos

A. Aspergillus

ACN Acetonitrilo

ADN Ácido Desoxirribonucleico

AFLA Aflatoxina

aw Atividade da água

C.V Coeficiente de variação

CE Comissão Europeia

DON Desoxinivalenol

ECD Electron Capture Detector

EGI Engenharia e Gestão de Qualidade Industrial

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

F Distribuição de Fisher

F. Fusarium

FAO Food and Agriculture Administration

FID Flame Ionization Detector

FLD Fluorescence Detector

G Grubbs

GC Gas Chromatography

GFC Gel Filtration Chromatography

GPC Gel Permeation Chromatography

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IAC Immunoaffinity Columns

IARC International Agency for Research on Cancer

L.P.I Limite da Precisão Intermédia

L.R Limite de Repetibilidade

L.R (%) Limite de Repetibilidade Relativo

LC Liquid Chromatography LD Limite de Deteção LQ Limite de Quantificação MeOH Metanol MS Mass Spectrometry OA Ocratoxina A OCRA Ocratoxina P. Penicilluim

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PBS Phosphate Buffered Saline

S.A Sociedade Anonima

TLC Thin Layer Chromatography

UV Ultravioleta

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FCUP Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas

Apresentação da empresa

✓ Histórico

Em Julho de 1992 em Vila Nova de Gaia, é fundada a Sociedade de Engenharia e Gestão da Qualidade Industrial, Lda. (EGI), com o intuito de atender a demanda do mercado como uma empresa prestadora de serviços para o ramo agro-alimentar. Surge em um momento onde a prevenção da qualidade e segurança alimentar são fundamentais para a indústria. É neste contexto e a falta de prestações de serviços de análises, que a EGI torna-se líder nacional no setor.

Em 1993 a empresa tem o seu laboratório acreditado, conforme a sua política de qualidade e sustentabilidade.

No ano 2000 implementa o laboratório de Análise Sensorial, visto a necessidade da avaliação organoléptica na análise dos alimentos.

Com o forte crescimento e desenvolvimento, em Março de 2005 a EGI adquire novas instalações, visando perspectivas futuras de modo a ampliar e acomodar todos os seus laboratórios e serviços desenvolvidos.

Fruto de todo o desenvolvimento e liderança do setor, em Março de 2008 a empresa multinacional norte-americana Silliker, adquire a empresa, tornando-se então o grupo Silliker Portugal S.A. e integrante de um dos maiores grupos mundiais na prestação de serviços na área da qualidade e segurança alimentar.

Desde 2014 que a Silliker aparesenta-se como Mérieux NutriSciences, pois foi a sociedade da família Mérieux que em 1990 adquiriu a Silliker.

Atualmente o grupo Mérieux possui cerca de 100 laboratórios acreditados a operar em 21 países e a empregar 6500 funcionários.

✓ Missão

Proteger a saúde dos consumidores de todo o mundo disponibilizando uma vasta oferta de serviços analíticos e de consultoria para as indústrias do setor alimentar e nutrição. Adicionalmente presta serviços a empresas de diferentes setores, nomeadamente nas áreas da água e ambiente, agroquímicos, bens de consumo, farmacêutica e cosméticos.

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✓ Setores

As mediações da Merieux Portugal, estão divididas em: análises físico-químicas e microbiológicas, análise sensorial, rotulagem, auditorias, consultorias de gestão da qualidade e segurança alimentar e apoio ao cliente.

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1. Micotoxinas

Os primeiros relatos decorrem no século X, quando uma doença, até então desconhecida, afetou grande parte da população Europeia em 943. Entre os principais sintomas estavam: crises epiléticas, espuma pela boca, vómitos, crises de loucura e dores insuportáveis.Tratava-se de um “fogo invisível” que desprendia a carne dos ossos e a consumia. Doença essa, popularmente nomeada de “Fogo de Santo António”, uma vez que os enfermos recorriam ao santuário de Santo António, localizado em França com o intuito de obter a cura (FAO, 2003). Atualmente sabe-se que o “Fogo de Santo António” ou ergotismo, é uma intoxicação proveniente da ingestão de alimentos contaminados por um produto tóxico produzido pelo fungo Claviceps purpurea ou “Esporão do Centeio” (FAO, 2003). Este produto tóxico é originário do metabolismo secundário produzido por alguns fungos filamentosos e fazem parte da flora natural de alguns produtos alimentares (Soares et al., 2013). Os metabolitos produzidos por esses fungos são denominados “Micotoxinas” e as doenças causadas são chamadas “Micotoxicose”.

1.1. Importância

O ano de 1962 na Inglaterra ficou marcado pela morte de mais de 100.000 perús, que apresentaram um quadro clínico de hemorragias internas e necrose hepática (Rocha et al., 2014; Soares et al., 2013). Após investigações, descobriu-se que os perús morreram após a ingestão da ração à base de amendoim originário do Brasil e África. A substância presente nesses amendoins foi proveniente do fungo Aspergillus flavus. Surgia a primeira micotoxina a ser estudada: a Aflatoxina, derivada da palavra Aspergillus flavous toxins (Food Ingredients Brasil, 2009).

A partir do estudo da Aflatoxina, investigadores descobriram outros fungos responsáveis por outras toxinas distintas. Atualmente estão documentadas no mundo todo mais de 400 micotoxinas, no entanto, apenas será relatado nesta dissertação as quatro principais: Aflatoxina, Desoxinivalenol, Ocratoxina e Zearalenona.

Quando inaladas ou ingeridas, as micotoxinas no organismo humano são altamente tóxicas e possuem efeitos diversos, sendo sempre prejudicial. Os efeitos irão depender do tipo de micotoxina, da concentração, do tempo de exposição, do modo de ação da micotoxina, do sexo, da idade e da massa corpórea (Tattibayeva, 2017).

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Entre os principais problemas estão: o aparecimento de tumores, a debilitação do sistema imunológico, lesão renal, doenças crónicas, estrogénica, hemorrágica, mutagénica, teratogénica, nefrotóxica e hepatotóxica (Pereira et al., 2014).

As micotoxinas são termoestáveis, portanto, durante o ciclo de processamento do alimento e/ou pasteurização, as mesmas não são destruídas. Sendo um contaminante natural, principalmente nos vegetais, é praticamente impossível a sua eliminação. Entretanto, torna-se indispensável minimizar a contaminação por fungos para que estes não repretorna-sentem um risco para a saúde da população.

1.2. Aflatoxina

Estão descritas 18 tipos de Aflatoxinas, sendo as principais: B1, B2, G1, G2, M1 e M2 (Coll et al., 2015). A Aflatoxina B1 é a micotoxina mais tóxica e mais abundante. É um dos compostos naturais mais carcinogénico em todas as espécies de animais pesquisadas. Classificada no “Grupo I” pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como composto altamente carcinogénico para os seres humanos. Ligam-se ao ADN e interferem na síntese da proteína (Tattibayeva, 2017).

As Aflatoxinas apresentam tropismo pelos órgãos como o fígado, cérebro e rins. Os principais fungos produtores desta micotoxina são: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Porém, também são fungos produtores de micotoxinas: Aspergillus nomius, Aspergillus bombycis,

Aspergillus pseudotamari e Aspergillus ochraceoroseus (Rocha, 2014). A micotoxina

produzida pelo género A. flavus está adaptada a uma grande variedade de climas, substratos e habitats. Os principais alimentos onde são encontrados maioritariamente são: amendoim, milho e sementes de algodão. Produz unicamente as Aflatoxina Bs. O género Aspergillus

parasiticus, é sobretudo encontrado em amendoins. Entretanto, todas as estirpes produzem

Aflatoxinas Bs e Gs. Plantas aéreas como no caso do milho, geralmente são suscetíveis a infeção por Aspergillus flavus, no entanto, plantas rasteiras como os frutos secos em contato com o solo podem ser infetadas por Aspergillus flavus e parasiticus (Soares, 2013).

Para o desenvolvimento de A. Flavus e consequentemente das Aflatoxinas, a atividade da água ótima é elevada (aw 0,99) e o valor mínimo é aproximadamente 0,82. O fungo

prolifera-se a uma temperatura entre 10 a 43°C, ocorrendo uma maior produção das micotoxinas a uma temperatura entre 20 e 30°C.

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Para o fungo A. Parasiticus, as condições são semelhantes, com aw 0,83 para o crescimento

e 0,87 para a produção de micotoxinas. A temperatura ótima para o crescimento do fungo é de 30°C e para produção de micotoxinas é de 28°C (FAO, 2003).

A intoxicação com Alfatoxina B1 é chamada de “Aflatoxicosis”, e apresenta-se como aguda ou crónica. A aguda poderá ocorrer a nefrotoxicidade, cardiotoxicidade e hepatotoxicidade, resultando em um quadro clínico de icterícia, vómitos, dores abdominais e insuficiência hepática, provocando até mesmo a morte. A crónica relaciona-se com quadros de desnutrição, carcinogénese e imunossupressão. Afeta o número e a função dos linfócitos e inibem a fagocitose. Em pacientes que apresentam o vírus da hepatite B, o risco de desenvolver cancro no fígado aumenta 60 vezes, pois a Aflatoxina B1 é 30 vezes mais potente nestes indivíduos (Coll, 2015).

1.3. Desoxinivalenol

O Desoxinivalenol (DON) é o tricoteceno originário do género Fusarium graminearum e F.

culmorum. DON é o mais comum e não é classificado como carcinogénico em humanos. Os

tricotecenos são um grupo de aproximadamente 150 metabolitos produzidos pelo fungo do género Fusarium, Myrothecium, Phomopsis, Stachybotrys, Trichoderma, Trichotecium,

Verticimonosporium entre outros. Os tricotecenos são conhecidos pela capacidade de inibir a

síntese de proteínas eucarióticas, interferindo na iniciação, alongamento e terminação da síntese proteica (Rocha, 2014).

É encontrado principalmente em cereais, cevada, centeio, trigo e milho. O género F.

graminearum possui temperatura ótima de crescimento de 25°C, aw mínima para o

crescimento de 0,90, o limite máximo é superior a 0,99. É predominante em climas temperados. Já o F. culmorum possui uma temperatura ótima de 21°C, comum em climas frios. Outra peculiaridade é que tanto um fungo como o outro têm a capacidade de produzir outros tricotecenos tóxicos: 15-acetildesoxinivalenol, 3-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-acetilnivalenol e fusarenona-X.

Também conhecida como vomitoxina, a ingestão aguda, a curto e longo prazo poderá causar a inibição do apetite, redução de peso, gastrointerites, vómitos, cardiotoxicidade, teratogenicidade e imunotoxicidade. Um caso de micotoxicose aguda com a população da Índia, China e zonas rurais do Japão, ocorreu após a ingestão de milho e trigo mofado. Num período de cinco a trinta minutos, surgiram os sintomas de náuseas, vómitos, dores abdominais, diarreia, tontura e dor de cabeça (FAO, 2003; Soares 2013).

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1.4. Ocratoxina

Descoberta em 1965 como um metabolito secundário do fungo Aspergillus ochraceus, durante estudos para a descoberta de novas moléculas de micotoxinas. Existem cinco tipos de Ocratoxinas: A, B, C, alfa e beta, entretanto, a A é a mais tóxica. A Ocratoxina A é produzida por diversos fungos provenientes da armazenagem, são eles: A. ochraceus, A alliaceus, A.

ostianus, A. mellus, Penicilluim viridicatum, P. cyclopium e P. variable (Food Ingredients Brasil,

2009; Rocha 2014; Coll, 2015).

A OA tem sido encontrada em milho, feijão seco, cacau, soja, cevada, frutas cítricas, castanhas do Brasil, tabaco mofado, presunto curado, amendoim, grãos de café, uvas e derivados, frutos secos e arroz. Está principalmente presente nos países da Europa e Canadá, pois são países onde o consumo de alimentos à base de cevada e trigo são maiores. São nestes alimentos onde melhor se desenvolve o fungo P. verrucosam. Também é possível encontrar OA na carne de animais que foram alimentados com cereais contaminados (Food Ingredients Brasil, 2009; Tattibayeva, 2017)

A temperatura de máxima produção para a OA é de 30°C e aw 0,95. Para a A.ochraceus a

produção mínima ocorre a 30°C e aw 0,85. Quando se trata da espécie P. verrucosam, o fungo

desenvolve e produz OA de 0°C a 31°C. Poderá produzir quantidades consideráveis de toxina a 4°C com aw 0,86. Ao ser ingerida, é absorvida pelo trato gastrointestinal ligando-se às

proteínas plasmáticas, como a albumina, alastrando-se pelo rim e com concentrações menores no fígado, músculo e tecido adiposo. Os efeitos sobre a saúde não estão claramente definidos. Efeitos carcinogénicos apenas foram comprovados em estudos com animais, já em humanos, está apenas limitado a estudos descritivos. Nos animais estudados foi observado um comportamento hepatóxico, imunossupressor e teratogénico. Com base nestas evidências a IARC classificou como “grupo 2B”, ou seja, possível carcinogénico para humanos (FAO, 2003; Food Ingredients Brasil, 2009; Cardona, 2014; Tattibayeva, 2017).

1.5. Zearalenona

Esta micotoxina é produzida pelo género Fusarium, sendo: F. graminearum, F.culmorum, F.

cerealis, F. esquiseti, F crookwellense, F. semitectum. São encontradas maioritariamente nas

culturas de milho, aveia, centeio, cevada e trigo em continentes como a América, Europa e Ásia. A Zearalenona geralmente ocorre em simultâneo com a DON, pois são produzidas pelo mesmo género de fungo, mas é encontrada em concentrações menores, quando comparada com o DON. O fungo coloniza a planta no estágio de floração, em períodos de chuva. Mesmo

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após a colheita, se o nível de humidade for elevado o fungo crescerá e produzirá a micotoxina (Food Ingredientes Brasil, 2009; Soares et al., 2013).

A exposição a ZEA está relacionada com hiperestrogenismo em porcos, foi observado que em altas concentrações os porcos também apresentaram alguns distúrbios como o aborto. Foram relatados problemas reprodutivos em vacas e espécies de ovinos. Os estudos experimentais realizados em animais não demonstraram quaisquer relações com o desenvolvimento de cancro (Rocha et al., 2014). Já em humanos, segundo Cardona (2014) a exposição a esta toxina tem sido responsável por alguns casos de puberdade precoce em raparigas.

1.6. Distribuição geográfica, principais alimentos, efeitos

toxicológicos e patológicos.

A Tabela 1 apresenta as principais micotoxinas presentes nas diversas regiões, assim como os principais alimentos e os efeitos causados quando ingeridas.

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Tabela 1 - Principais micotoxinas de acordo com a região, principais alimentos e efeitos para a saúde

Micotoxina Estrutura Química Região Predominante Efeitos Tóxicos Efeitos Patológicos Alimentos

AFLA

América do Norte, América do Sul, África,

Ásia e Austrália. Citotóxico, mutagénico, hepatotóxico, carcinogénico, teratogénico, imunossupressor.

Hiperplasia das vias biliares, hemorragias intestinais e renais, tumores no fígado,

hepatite aguda, cirrose hepática.

Frutos secos, cereais, café, oleaginosas e

amendoins.

DON

América do Norte, América do Sul,

Europa (Leste e Oeste).

Imunossupressor, neurotóxico, genotóxico,

teratogénico.

Náuseas temporais, vómitos, diarreia, dor abdominal, dor

de cabeça, tonturas, febre, anorexia. Cereais de grão pequeno. OCRA América do Norte, América do Sul e Europa (Oeste). Citotóxico, nefrotóxico, teratogénico, hepatotóxico. Nefropatia endémica, nefropatia intersticial crónica,

enterite, nefropatia suína, tumores renais.

Uvas, uvas passas, cafés, frutos secos, cereais e pastelaria.

ZEA

América do Norte, África, Europa (Leste e

Oeste).

Genotóxico, efeito estrogénico.

Puberdade precoce, edema da vulva, prolapso vaginal,

atrofia testicular e dos ovários, aumento das mamas

e aborto.

Cereais de grão pequeno.

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1.7. Teores máximos permitidos conforme o decreto CE N.1881 2016

Os teores máximos permitidos para as micotoxinas presentes em alimentos estabelecidos pelo decreto da Comissão Europeia de 19 de Dezembro de 2006, estão resumidamente apresentados na tabela a seguir:

Tabela 2 - Teores máximos permitidos para Aflas, DON, OCRA e ZEA em alimentos conforme o decreto CE N.1881 2016

Alimento Micotoxina Alimento Micotoxina Alimento Micotoxina Alimento Micotoxina Afla B1 (μg/kg) Afla Total Ocratoxina A _(μg/kg) Desoxinivalenol _(μg/kg) Zearalenona _(μg/kg)

Amendoins e frutos de casca rija

2,0 4,0 Cereais 3,0 Cereais 750,0 Cereais 75,0

Frutos secos 5,0 10,0 Uvas passas 10,0 Pão 500,0 Pão 50,0

Cereais 2,0 4,0 Café 5,0 Alimentos para

bebés 200,0

Alimentos para

bebés 20,0

Milho 5,0 10,0 Vinho 2,0

Especiarias 5,0 10,0 Alimentos para _bebés 0,50

Alimentos para

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1.8. Parâmetros para a deteção das micotoxinas

Existem diversas metodologias para a análise e identificação de micotoxinas. No entanto, para que uma análise seja fiável, dependerá de alguns fatores essenciais, apresentados a seguir.

1.8.1. Amostragem

Uma toma representativa do alimento, assim como sua devida homogeneização, é fundamental para que a análise da amostra seja bem sucedida. As toxinas produzidas pelos fungos não se distribuem uniformemente pelo alimento. Uma amostra não representativa poderá invalidar a análise das micotoxinas.

1.8.2. Matrizes complexas

O sucesso da análise decorre da capacidade de separar a micotoxina de uma matriz complexa. Uma matriz complexa pode ser considerada como amostras que contenham diferentes composições como por exemplo o teor de carboidratos, proteínas e lípidos. Estes por sua vez, podem interferir na separação e determinação das micotoxinas.

1.8.3. Limites de deteção baixos

Os limites de deteção são extremamente baixos, em alguns casos em ppb (partes por bilião), µg/kg ou ng/kg. Um método de deteção bem sucedido deverá ser capaz de detetar estes níveis de contaminação, com amostras aceitáveis de falsos negativos e positivos (Turner et al., 2015).

Os métodos utilizados atualmente têm seguido uma série de etapas em comum como: amostragem, homogeneização, extração, uma etapa de separação para eliminar ou minimizar os componentes indesejados, purificação, concentração e finalmente a deteção confirmativa. Entre os métodos de extração está a extração sólido-líquido, onde o analito é extraído por intermédio de um ou vários solventes de uma matriz sólida. Na sequência é incluída uma etapa de purificação do extrato obtido, de modo a eliminar os possíveis interferentes. Esta purificação é realizada com colunas de imunoafinidade, pois permite um limite de deteção extremamente baixo. Para a deteção confirmativa, utilizam-se técnicas cromatográficas acopladas a uma variedade de detetores ou métodos imunoquímicos. Estas técnicas são

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conhecidas como: Cromatografia Líquida (LC), Cromatografia Gasosa (GC) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), combinadas com detetores como a Espectrometria de Massa (MS), Fluorescência (FLD), Ultravioleta (UV), Ionização de Chama (FID) ou Captura Eletrónica (ECD). Já as técnicas de rastreio de amostras são realizadas por Cromatografia em Camada Fina (TLC) ou Imunoensaio, como o Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA). Porém, estas duas últimas técnicas apenas permitem resultados qualitativos ou semi-qualitativos (Pereira et al., 2014; Tattibayeva, 2017).

Na sequência estão descritas as técnicas utilizadas para a determinação das micotoxinas, assim como o funcionamento do HPLC.

1.9. A técnica

1.9.1. Preparação da amostra

Assim como citado nos itens 1.8.1 e 1.8.2, os alimentos geralmente apresentam grande complexidade na sua composição, logo, a etapa de amostragem é fundamental para a obtenção de resultados fidedignos e a amostra deverá ser representativa de todo o produto a analisar. Para alimentos como cereais, por exemplo, são utilizados moinhos que possam reduzir os grãos inteiros a pó. Alimentos fluídos como vinhos, bebidas, papas e polpas de frutas destinadas a alimentação infantil, são homogeneizados muitas vezes na própria embalagem. Quando os alimentos a serem analisados são pastelarias, frutos secos etc, estes necessitam de ser processados, de modo a obter um produto homogéneo.

1.9.2. Extração com solventes

1.9.2.1. Extração sólido-líquido

É a técnica utilizada para extrair a micotoxina de uma matriz sólida por intermédio de um solvente. Normalmente é utilizada para extração de grãos, cereais e outras matrizes sólidas. O solvente a ser utilizado varia de acordo com o analito a ser extraído. A grande maioria das micotoxinas são solúveis em solventes polares e ligeiramente polares, entretanto, são insolúveis em solventes apolares. Assim, são utilizadas misturas de solventes orgânicos como a acetona, acetonitrilo, clorofórmio, diclorometano, acetato de etilo ou metanol com uma pequena porção de ácidos diluídos ou água. A utilização de água ou sua acidificação promove

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a eficiência da extração, uma vez que a água aumenta a penetração do solvente dentro do alimento. Já a acidificação auxilia na quebra de interações moleculares entre a toxina e outros constituintes como proteínas e açúcares. Muitas vezes solventes apolares são utilizados antes de realizar a extração sólido-líquido, de modo a remover componentes lipofílicos. A relação amostra e solvente, assim como o tempo de extração e temperatura devem ser cuidadosamente controlados para que ocorra uma correta quantificação da toxina. (Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).

Conforme citado por Pereira et al. (2014), estudos realizados com misturas de solventes mostraram que a mistura de metanol com acetonitrilo, permite uma co-extração reduzida de componentes indesejados da matriz sólida. Quando preparado na proporção acetonitrilo/água (84:16) produziu menos compostos interferentes do que em outras misturas.

1.9.2.2. Extração líquido-líquido

É a técnica utilizada para extrair a micotoxina de uma matriz líquida por intermédio de um solvente. Na extração líquido-líquido o solvente que apresenta uma baixa constante dielétrica (tendem a ser imiscíveis com água) possuem baixa capacidade de extração de compostos polares como as micotoxinas. Os solventes mais adequados são o metanol ou acetonitrilo e devem ser misturados com a água na presença de sais para que estes reduzam a miscibilidade mútua. Os analitos polares movem-se seletivamente da fase aquosa para a fase orgânica polar (Turner et al., 2015).

1.9.2.3. Separação/purificação da micotoxina por Colunas de

Imunoafinidade (IAC)

Após a etapa de extração, a micotoxina presente no líquido é isolada por intermédio de colunas de extração de fase sólida. Nesta etapa serão reduzidos os possíveis interferentes presentes na matriz. A utilização de colunas de imunoafinidade (IAC) é uma das técnicas com maior utilização, pois aumentam a seletividade do método. Essas colunas são compostas por uma fase sólida constituída por anticorpos específicos para cada tipo de micotoxina. Quando o líquido passa pelo interior da coluna, o analito (micotoxina) de interesse liga-se seletivamente ao anticorpo, enquanto as impurezas são lixiviadas. Na sequência, o analito é

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eluído por intermédio de um solvente ou uma mistura de solventes, de acordo com a micotoxina a ser estudada (Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).

Figura 2 - Funcionamento de uma coluna de imunoafinidade (Adaptado de Kos 2015)

As colunas de imunoafinidade são destacadas pela simplicidade, alta especificidade, recuperação, melhor limite de deteção, reduzida percentagem do coeficiente de variação e análise de múltiplos compostos em uma gama variada de matrizes. Os anticorpos utilizados na fase sólida poderão ser monoclonais ou policlonais. Monoclonais apresentam um grau de pureza elevado e são mais sensíveis às condições de ligação dos que os policlonais. É necessário ter em conta que na presença de solventes orgânicos poderá ocorrer a desnaturação do anticorpo, sendo assim, é de relevante importância que o extrato a ser passado pela coluna, seja uma solução aquosa contendo muito pouco ou nenhum solvente orgânico. A coluna só poderá ser utilizada uma única vez, pois, quando a micotoxina é eluída, o anticorpo desnatura (Amado, 2002; Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).

Adição da matriz contendo a micotoxina A micotoxina liga-se ao anticorpo sendo isolada da matriz

Eluição com o solvente adequado, desnatura o anticorpo, libertando a

toxina Anticorpo

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1.9.3. Cromatografia

1.9.3.1. Histórico

Originária do grego “chroma” (cor) e “graphein” (escrever) a cromatografia é datada do ano de 1903, quando o botânico russo Mikhail Semenovich Tswett, ministou uma palestra e publicou um artigo com as aplicações da adsorção em análises bioquímicas. Em 1906 mais dois artigos foram publicados e Tswett descreveu um método físico-químico testado por ele, onde realizou a separação de pigmentos das plantas. O método possibilitou a separação de pigmentos de cloroplastos presentes nas folhas verdes das plantas. O botânico utilizou uma coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (fase estacionária) e o éter de petróleo (fase móvel), obtendo assim a completa separação dos componentes em faixas coloridas (Pacheco et al., 2017; Fernandes, 2016; Torre 2013).

Até a década de 30, a cromatografia não tinha muita importância, entretanto o químico alemão Richard Kuhn em conjunto com o seu pós-doutorando o bioquímico francês Edgar Lederer, aprimoraram a técnica e conseguiram separar e identificar xantofilas da gema do ovo. Já na década de 40, os químicos britânicos Archer Martin e Richard Synge, surgiram com o modelo e a explicação dos pratos teóricos, que está relacionado com a eficiência da separação, trouxeram conceitos essenciais sobre o GC e o HPLC.

A partir da década de 70, foi possível fabricar colunas com partículas de tamanho reduzido, importantes para uma boa resolução, também houve o surgimento de equipamentos capazes de trabalharem sobre altas pressões o que possibilitou um aumento da velocidade na eluição da fase móvel e consequemente reduzir o tempo de análise. Com o passar dos anos a técnica sofreu avanços, até surgir a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. É a técnica de separação mais usual, pois apresenta uma grande sensibilidade e é aplicável a uma vasta gama de substâncias de elevado significado para as indústrias, ciência e população em geral (Fernades, 2016; Torre, 2013; Collins, 1997).

Na análise através do HPLC, a utilização de detetores como UV, espalhamento de luz, fluorescência aliados a softwares específicos, possibilitam a identificação e a análise quantitativa dos componentes de uma mistura em concentrações muito reduzidas (Lanças, 2009).

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1.9.3.2. Conceito

Quando ocorre uma separação via HPLC, a análise qualitativa dá-se através de uma representação gráfica com picos (cromatogramas) equivalentes a cada composto da amostra analisada. A separação dos picos através do sistema cromatográfico é definida de acordo com a resolução, a retenção e a seletividade. A resolução, definida como a capacidade da separação. É obtida através da razão da diferença entre a distância de dois picos pela média da largura do pico, conform a expressão a seguir. (Chust, 1990).

Figura 3 - Cálculo para a resolução do pico (Silva, 2016) Em que:

R = 0 (não há separação) R = 1,0 (separação parcial)

R = 1,5 (separação na linha de base)

A retenção mede a capacidade do sistema cromatgráfico em reter os componentes de uma amostra. Já a seletividade é a capacidade do método de detetar um componente de uma mistura de outros compostos dentro de uma matriz complexa (Aragão et al., 2009). O volume de retenção/eluição é definido como o volume de fase móvel essencial para arrastar o soluto através da coluna cromatográfica. O tempo é obtido de acordo com o tempo demorado após a injeção da amostra na coluna até o soluto atingir o detetor. Maior será a capacidade da separação quando maior for o tempo que o soluto é retido pela coluna (Fernandes 2016; Kupiec 2004; Chust, 1990).

A dispersão dos picos cromatográficos comparado ao seu centro é descrito com base nos pratos teóricos. Caso os picos não saiam simétricos e apresentem apenas uma proximidade

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a forma Gaussiana, a quantidade de pratos teóricos é reduzida. É um fator que facilita o controlo da eficiência do sistema e o desgaste da coluna cromatográfica. (Chust, 1990). O processo de eluição (passagem do eluente pela coluna) poderá ser por dois tipos:

✓ Eluição isocrática: a composição da fase móvel não se altera durante a separação. É a técnica mais simples;

✓ Eluição por gradiente: ocorre a mudança na composição da fase móvel durante a separação, é indicado para a análise de matrizes complexas.

A redução da viscosidade da fase móvel proporciona um melhor desempenho da coluna cromatográfica. Essa redução é influenciada pelo aumento da temperatura, entretanto, a temperatura deve ser sempre controlada, caso contrário originará uma diminuição na reprodutibilidade e cromatogramas com resolução reduzida (Fernandes, 2016).

1.9.4. Componentes de um HPLC

1.9.4.1. Injetor

Atualmente há muitos sistemas de injeção, entretanto, os mais usuais são as válvulas manuais ou injetores automáticos. Na injeção manual, há uma válvula com seis vias e duas posições permitindo que com o auxílio de uma seringa o loop (alça de amostragem) seja preenchido pela amostra a ser analisada. Em sequência a válvula é rodada, de modo a inserir o loop na linha cromatográfica em direção ao sistema de bombeamento e a coluna. Os injetores automáticos apresentam as mesmas funções que um operador executaria na operação manual: preenche o loop através da inserção da amostra por intermédio de uma seringa. Outro modelo de injeção automática preenche o loop por meio de sucção da amostra. Já outra vertente, possui a agulha de amostragem integrada ao loop de amostragem (Neto, 2009).

1.9.4.2. Bomba

As bombas utilizadas são de alta pressão e devem possibilitar o controle da pressão máxima. Como a fase móvel é um líquido e apresenta alguma viscosidade, é essencial que seja exercida uma pressão sobre a respetiva, de modo a permitir ultrapassar a resistência exercida pelas partículas da coluna. Essas partículas apresentam caminhos de difusão relativamente

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curtos, logo, produzem um elevado número de pratos teóricos. A bomba é considerada o “coração do HPLC” e dela dependem uma variedade de fatores (Fernandes, 2016; Chust, 1990).

Caso o fluxo varie ocorrerá a modificação dos tempos de retenção e das áreas dos picos cromatográficos, sendo assim, é essencial que o fluxo da fase móvel seja constante, não apresente pulsações e tenha a possibilidade de ser regulado de acordo com o método a ser realizado para a análise de uma amostra, é necessário utilizar fluxos baixos, para que assim permita uma boa precisão e repetibilidade. O fluxo ideal poderá variar de 0,1 ml/min a 5,0 ml/min (Degani et al., 1998; Chust, 1990).

1.9.4.3. Coluna cromatográfica

É na coluna (fase estacionária) que ocorre a separação dos componentes da mistura/amostra. É um dos componentes mais importantes e crítico no sistema cromatográfico. Geralmente as colunas são compostas por aço inoxidável o que favorece a resistência à corrosão, são resistentes a altas pressões e são reaproveitáveis, pois, não há a necessidade de efetuar a regeneração após a sua utilização. Ao definir o tipo de coluna, é necessário definir as características da amostra a ser separada conforme o diagrama apresentado por Chust (1990):

Os diversos componentes presentes na amostra apresentam propriedades distintas, logo diferentes graus de afinidade com a fase móvel e a coluna, sendo a velocidade de migração distinta, o que irá permitir a separação cromatográfica. Assim, os componentes que possuem

Amostra _{Carga iónica}

Estrutura Química Polaridade Hidrossolúvel Lipossolúvel Positiva Negativa Grupo Funcional Estereoquímica

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maior interação/ligação com a coluna serão aqueles que irão eluir por último, já os que apresentam menor interação serão eluídos primeiro.

As colunas cromatográficas apresentam geralmente um diâmetro interno de 3 a 5 mm e o comprimento varia de 10 a 50 cm. A capacidade da coluna é estabelecida pelo seu comprimento e o material ao qual é contida internamente. Nas extremidades da coluna sem provocar um aumento da pressão, há um disco de metal poroso ou teflon, de modo a previnir a perda do recheio da coluna ou possíveis mudanças na compactação. O tamanho dos poros está relacionado com a superfície que a amostra irá interagir. Uma coluna que funcione adequadamente, as micropartículas devem ser esféricas e o seu tamanho reduzido, o que proporcionará em uma elevada eficiência e área superficial proporcionando uma maior retenção (Collins, 1997)

A fase estacionária poderá ser:

✓ Fase normal: a fase móvel é apolar e a fase estacionária é polar, os componentes apolares serão eluídos primeiro, enquanto os polares ficarão retidos na coluna e serão eluídos posteriormente;

✓ Fase reversa: quando a fase móvel é polar e a estacionária é apolar, logo os componentes polares serão os primeiros a serem eluídos e os apolares os últimos. Nas análises por HPLC, geralmente é utilizado a fase reversa em colunas C18 octadecilsílica (Silva, 2012; Degani et al., 1998)

É necessário que o solvente utilizado na fase móvel, apresente um elevado teor de pureza, para evitar que este contamine a coluna. A fase móvel deverá ser filtrada, para a remoção de partículas sólidas, oxigénio ou outros gases dissolvidos. Um outro modo de proteger a coluna principal, é a inserção de uma pré-coluna (2-5 cm de comprimento) com as mesmas características, é situada entre o injetor e a coluna principal (Degani, 1998; Collins, 1997).

1.9.4.4. Detetor

O detetor identifica a presença do sinal do analito de interesse que está a ser eluído na coluna, gerando um sinal eletrónico em forma de pico cromatográfico. A sensibilidade é estimada de acordo com a relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que faz com que gere este sinal (Peres, 2002).

Um bom detetor deverá apresentar uma elevada sensibilidade, baixo limite de detecção, uma alargada faixa de linearidade, confiabilidade e reprodutibilidade, ser facilmente operável, não destruir o soluto, apresentar insensibilidade a possíveis mudanças na fase móvel e à

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temperatura e baixo nível de ruído. Há uma grande variedade de detetores, a escolha dependerá das características químicas/estruturais do analito a detetar (Collins, 1997; Chust, 1990).

Entre os detetores estão:

✓ Ultravioleta – Visível (UV-Vis) e de díodos: também conhecidos como detetores

fotométricos, medem a absorvância do UV-Vis. O funcionamento é com base na absorvância da luz por parte da amostra. A resposta deste detetor é seletiva, pois apenas deteta as substâncias que absorvem em um determinado comprimento de onda. São insensíveis a variações de temperatura e vazão. São constituídos por uma lâmpada de excitação, um filtro ou rede de difração e um divisor do feixe de luz que dirige cada um dos feixes resultantes e de mesma intensidade a cada uma das duas células de detecção (amostra e referência), incidindo posteriormente em um fotodetetor. O fotodetetor medirá a diferença de intensidade de luz entre as células (a luz que não é absorvida) e gerará um sinal elétrico que será amplificado e convertido em unidades de absorção. A única desvantagem apresentada provém de sua seletividade, uma vez que não podem ser utilizados nas análises de deteção de lípidos, hidratos de carbono, ácidos gordos, hidrocarbonetos e grande parte dos polímeros. O deteror de díodos utiliza os mesmos princípios do UV, entretanto, permite a aquisição simultânea em vários comprimentos de onda . O detetor de díodo identifica o espectro do composto e deteta o comprimento de onda, originando uma quantificação precisa do composto (Collins, 1997; Chust, 1990).

✓ Fluorescência: é um detetor específico e um dos mais sensíveis para compostos fluorescentes. Com condições adequadas é possível detetar quantidades na ordem dos ppb. Entre os detetores de HPLC é o que apresenta maior sensibilidade, sendo 1000 vezes superior à do detetor de UV. Engloba todas as características do detetor de UV-Vis e permite distinguir os componentes de interesse de uma amostra complexa de substâncias não fluorescentes. Uma lâmpada de excitação seguida de um filtro de excitação ou uma rede de difração incide um feixe luminoso sobre a célula de amostra e excita os átomos da respetiva, o que origina a emissão de um feixe de luz ao voltar ao estado fundamental. Esse feixe é dirigido a um segundo filtro ou monocromador que distingui o comprimento de onda emitido, incidindo-o no fotodetetor. Apresenta um elevado custo, porém, possibilita a análise de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, esteroides, vitaminas e corantes alimentares (Collins, 1997; Chust 1990).

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✓ Condutividade: a principal aplicação é na cromatografia iónica (análise de aniões e catiões) e metais de transição. É considerado um detetor de alta sensibilidade e seletividade. O detetor mede a condutividade total da solução (eluente + amostra) através de uma célula tubular com dois, quatro ou mesmo seis elétrodos de prata, platina ou aço inoxidável. Geram um sinal analítico que será tratado e quantificado. Apresenta grande sensibilidade na deteção (até10-8 _{M) e mudanças de temperatura.}

Devido a este fator e a condutividade do eluente, é preciso recorrer a processos de compensação e supressão química (reduz os interferentes da fase móvel na medição) ou eletrónica (Inkemia Brasil, 2016; Chust, 1990).

✓ Índice de refração: é um detetor universal, pois apresenta resposta a qualquer espécie de amostra, entretanto, a sua sensibilidade é moderada, sendo o UV 1000 vezes mais sensível. O funcionamento é baseado na mudança do índice de refração do eluente devido os componentes da amostra, quanto maior for a diferença de refração do componente e da fase móvel, maior será a intensidade do sinal. É sensível às alterações de temperatura o que ocasiona a alteração da resposta do detetor. Não é recomendado para análises de gradiente. Geralmente são utilizados quando os demais detetores não correspondem aos compostos de interesse, e a sensibilidade não seja relevante em separações preparativas e análises de macromoléculas em cromatografia por exclusão de tamanho (Inkemia Brasil, 2016).

✓ Eletroquímico: também conhecido como amperométrico, possui uma grande sensibilidade para detetar aminas biogénicas e alguns iões que não são detetados por condutimetria, por exemplo, os cianetos, sulfuretos, sulfitos, halogenetos e arsenatos. O seu funcionamento provém da oxidação ou redução do composto a analisar na superfície do elétrodo. O ganho ou perda de eletrões proveniente da redução ou oxidação gera uma corrente proporcional à concentração do composto ao passar na célula de deteção. Apresenta uma grande sensibilidade (10-7_{M) e permite uma boa}

especificidade na identificação dos compostos obtidos através da seleção do potencial redox da reação (Chust, 1990).

✓ Espectrometria de massas (MS): permite a informação estrutural de compostos e a identificação de componentes desconhecidos presentes em amostras, através da determinação da massa, carga e estrutura proveniente da forma ionizada dos componentes. Apresenta elevada sensibilidade. As moléculas de uma amostra são transformadas em iões em fase gasosa, em sequência são separados no

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espectrómetro de acordo com a sua razão massa sobre a carga (Ikemia Brasil, 2016; Wilson & Walker, 2010).

1.9.4.5. Sistema de processamento de dados

É neste componente onde ocorrerá o processamento de dados, o sinal obtido pelo detetor é convertido em cromatograma. Os dados obtidos são processados e armazenados no computador. Com a análise do cromatograma é possível identificar o tempo de retenção, a altura do pico, a área e controlar a linha de base. O sistema de processamento de dados, também trará informações a cerca da bomba, fluxo, em resumo comandará todos os componentes do HPLC.

Figura 5 - Componentes de um HPLC (Adaptado de Keliri, 2017)

1.9.5. Os mecanismos de separação cromatográfica

A cromatografia líquida é classificada em cinco mecanismos distintos no processo de separação. São eles:

✓ Adsorção: a separação é baseada nas diferenças de afinidade entre os componentes da amostra e a fase estacionária. As moléculas são reversivelmente retidas na fase estacionária. Dá-se então a separação dos componentes da amostra em bandas ou zonas discretas, as quais poderão ser analisadas qualitativamente e quantitativamente. Este mecanismo poderá ser de fase normal ou reversa, entretanto

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a fase estacionária deverá possuir uma área superficial específica elevada, pois a retenção é diretamente proporcional à área superficial (Fernandes, 2016).

✓ Partição: é composta por uma fase estacionária líquida e através da adsorção fica retida na superfície da coluna e uma fase móvel líquida, que entra em contacto com a fase estacionária que poderá ser polar ou apolar. A separação dos componentes levará em conta a solubilidade da matriz em comparação com a fase móvel e estacionária. Os componentes com maior solubilidade na fase móvel, serão eluídos primeiramente e os componentes com maior solubilidade com a fase estacionária serão retidos (Silva, 2012).

✓ Permuta iónica: a fase estacionária é carregada com catião ou anião, os componentes das amostra com cargas contrários a fase estacionária são adsorvidos seletivamente da fase móvel. Todos estes compostos adsorvidos são posteriormente eluídos por deslocamento com outros íons com a mesma carga, entretanto, com maior força de interação com a fase estacionária (Collins, 1997).

✓ Exclusão de tamanho: também conhecida como Permeação em Gel (GPC) e Filtração em Gel (GFC). É utilizada para compostos de elevado peso molecular. Os componentes da amostra são separados consoantes o tamanho da molécula. Empacotada com um material inerte e com porosidade controlada, quando o componente da amostra entra em contacto com a fase estacionária as micromoléculas são retidas nos poros. Isto acarretará em uma maior retenção, logo, serão eluídas mais tardamente, quando comparado com as moléculas maiores (Silva, 2012).

✓ Afinidade: as macromoléculas biológicas unem-se reversivelmente a ligantes específicos. É necessário preparar uma fase estacionária seletiva, através da imobilização covalente de ligantes específicos. A macromolécula de interesse ao entrar em contacto com a coluna é retida, enquanto as moléculas que não possuem afinidade com o ligante são eluídas (Collins, 1997).

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2. Validação de métodos analíticos

A validação de métodos de ensaios tem a finalidade de verificar os requisitos específicos que são adequados para a finalidade pretendida, logo, é necessário a validação de métodos não normalizados, métodos criados ou desenvolvidos pelo próprio laboratório ou métodos normalizados utilizados fora do âmbito para os quais foram concebidos e em ampliações de métodos normalizados. A descrição do método de ensaio interno deve ser realizada em documentos, de maneira detalhada e de modo a que qualquer pessoa com formação adequada o possa executar (Pereira, 2016; Guia RELACRE, 2000).

O principal foco da validação é a confirmação das características do método, se atendem ou não as especificações requeridas para os resultados analíticos, de modo a estabelecer limites de controle a serem empregues no trabalho diário. É um aspeto fundamental para demonstrar a fiabilidade do método nas condições praticadas, permitindo a obtenção de resultados muito próximos ao valor verdadeiro do teor de um dado analito presente em uma amostra. Resumidamente, a validação será um comprovativo, partindo de evidências diretas, de que o método satisfez todos os requisitos para uma dada aplicação ou uso específico, garantindo a qualidade analítica. Quando ocorrerem mudanças nas características de um método já implementado e validado no laboratório, este deverá ser revalidado (Martins, 2016; Costa, 2015).

Os requisitos mínimos para uma validação irão depender do tipo de método em causa, entretanto, compreendem a investigação e o conhecimento da gama de trabalho/linearidade, limiares analíticos (deteção e quantificação), sensibilidade, precisão e exatidão para análises quantitativas. Em análises qualitativas os parâmetros mais importantes a serem estudados são o limite de deteção, a seletividade/especificidade e a robustez (Guia RELACRE, 2000).

2.1. Seletividade/Especificidade

A seletividade é a capacidade de um método identificar e distinguir um analito específico em uma matriz complexa sem a interferência dos outros componentes. A matriz poderá conter compostos que interferem na medição. Esses interferentes poderão aumentar ou diminuir o sinal, a magnitude do efeito também dependerá da concentração do analito (Pereira, 2016; Guia RELACRE, 2000).

A especificidade de um método é quando este consegue separar o analito dos outros compostos presentes na amostra. Em resumo, é quando o sinal medido é proveniente

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unicamente do analito em estudo. É possível avaliar as interferências, através de um teste de recuperação com uma série de amostras, com a mesma matriz, apenas variando a concentração do analito, em duplicado e em condições de repetibilidade. O método será específico e seletivo quando obter taxas de recuperação próximas a 100%, ou de acordo com os critérios de aceitação pré-determinados pelo laboratório. (Guia RELACRE, 2000).

2.2. Sensibilidade

Irá avaliar a capacidade de um método ou equipamento distinguir as diferenças mínimas na concentração do analito. É definida como o quociente entre o acréscimo do valor lido (∆L) e variação da concentração (∆C) correspondente a esse acréscimo. A sensibilidade corresponde a derivada de primeira ordem da curva de calibração nessa zona de concentração, se a curva de calibração for um modelo linear, a sensibilidade será constante ao longo de toda a gama de trabalho, e equivalente ao declive da reta de calibração (Guia RELACRE, 2000). Sensibilidade = ∆L ∆C

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2.3. Limiares analíticos

2.3.1. Limite de deteção (LD)

É o teor mínimo medido, no qual é detetado a presença do analito, entretanto, não necessariamente quantificada como valor exato, com uma certeza estatística razoável (usualmente 95%). Uma leitura inferior ao LD, não significa que o analito esteja ausente na amostra, apenas é afirmado que com a probabilidade definida, a concentração do analito será inferior a um certo valor (Pereira, 2016). É também denominado como a concentração mínima distinguível de uma amostra com a mesma matriz, mas sem o analito (branco).

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Onde:

Sy/x: desvio padrão residual da curva de calibração

b: declive da reta.

2.3.2. Limite de Quantificação (LQ)

Corresponde à menor concentração medida, na qual é possível quantificar o analito com uma determinada exatidão e precisão. Após a determinação de LQ, é necessário recorrer a uma série de padrões internos, em condições de precisão intermédia cuja concentração se encontre próxima ou igual à do limiar de quantificação, de modo a testar e verificar se a exatidão e precisão obtida é satisfatória.

(3)

2.4. Linearidade

Corresponde a capacidade do método analítico produzir um sinal diretamente proporcional à concentração do analito dentro do intervalo da gama de trabalho. Para traçar a curva de calibração são necessários definir no mínimo cinco pontos, excluindo o ponto zero para não proporcionar possíveis erros associados. Este parâmetro pode ser verificado através da visualização da reta de calibração do gráfico e do valor do coeficiente de correlação linear obtido que deve ser maior que 0,995 e por avaliação estatística através do teste RIKILT, o qual analisa a linearidade de cada ponto da curva de calibração (Fernandes, 2016).

y = ax + b (4) Em que: y: sinal instrumental a: declive da reta x: concentração do analito

(45)

Para avaliar é necessário determinar a razão entre o sinal instrumental (yi) e a concentração

do padrão (xi) para cada ponto da reta e a média das razões obtidas (yi/xi)m. Na sequência é

calculada a percentagem da linearidade para cada ponto. E para que o método seja considerado linear, é considerado o valor da média como 100% o que indica uma linearidade perfeita, e cada ponto da reta deverá estar situado entre os 90% e 110%. Se houver algum valor fora deste intervalo, este deverá ser descartado e o teste RIKILT deverá ser novamente aplicado à gama reduzida, até se verificar os requisitos estabelecidos (Fernandes, 2016). A equação a ser utilizada está representada a seguir:

(5)

2.5. Gama analítica

A gama de trabalho corresponde ao intervalo de concentrações no qual o analito pode ser determinado com boa linearidade, precisão e exatidão. A escolha da gama, deve ter em consideração a abrangência de toda a gama de concentração das amostras, sendo recomendado que a concentração mais frequente das amostras incida sobre o centro da gama (Martins, 2016; Pereira, 2016).

2.6. Precisão

A precisão avalia a dispersão dos resultados obtidos em ensaios independentes, repetidos sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas. Permite constatar que o método tem a capacidade de repetir e reproduzir os resultados obtidos em análises sobre a mesma amostra ou padrão. É recomendável a utilização de amostras reais, para que o efeito matriz, que pode influenciar os resultados obtidos bem como a avaliação da precisão, seja considerado.

A dispersão é avaliada através de duas medidas extremas: repetibilidade e reprodutibilidade. Entre ambas existe uma situação intermédia designada por precisão intermédia ou variabilidade interlaboratorial (Guia RELACRE, 2000).

(46)

A precisão pode ser expressa sob a forma de desvio-padrão:

(6)

Ou pelo coeficiente de variação:

(7) Em que s corresponde ao desvio padrão da precisão intermédia e 𝑥̅ a média dos resultados obtidos.

2.6.1. Repetibilidade

Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições idênticas (ensaios realizados sobre a mesma amostra, mesmo laboratório, mesmo analista, mesmo equipamento, mesmo tipo de reagentes e a curtos intervalos de tempo). Para determinar a repetibilidade de um método no próprio laboratório, é realizado uma série de medições (n ≥ 10) sobre uma mesma amostra ou padrões em condições de repetibilidade. O limite de repetibilidade é o valor máximo admissível para a diferença absoluta ente dois ensaios em condições de repetibilidade, determinada para o nível de confiança de 95%.

∆𝒓 = 𝒕u

𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) × √𝟐 × 𝐒̅𝒓i

(8) Onde o n é o número de réplicas que servem de base para determinar o desvio-padrão S̅𝒓i ,

referente à repetibilidade estimada 𝒕u

𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) o valor crítico da distribuição t-student, com um

nível de significância de 0,05 e com n-1 graus de liberdade.

É necessário também considerar o coeficiente de variação de repetibilidade, CVr que é

numericamente igual à razão entre o desvio-padrão da repetibilidade (Sri) e a média dos