A expressão do gene Dkk1 foi constatada no E+ES e E+EC do útero NG e gestantes de P1 (Fig. 12c) a P4 das regiões CAR e IC. Pela análise quantitativa (Graf. 14) os índices de marcações apresentaram os menores valores no útero NG, notadamente na região IC, aumentando nos grupos gestacionais a partir de P1 em ambas as regiões. Na CAR, houve aumento significativo da expressão em P1 (NGxP1 P<0,001), P2 e P4 (NGxP2, NGxP4 P<0,05). Na IC, esse aumento foi mais acentuado em P1, P2 (NGxP1, NGxP2 P<0,05), P3 (NGxP3 P<0,001, P1xP3 P<0,05, P2xP3 P<0,01) e P4 (NGxP4, P3xP4 P<0,05). Diferença significativa do índice de marcação entre a região CAR e IC foi constatada em P1, P2 e P3 (P<0,05).
Uma intensa expressão do gene Sfrp2 foi observada no miométrio, e no estrato esponjoso (EE) próximo ao miométrio da região IC dos animais NG com redução de P1 a P4. A expressão desse gene também foi constatada no E+ES e E+EC das regiões CAR e IC dos animais NG e gestantes de P1 a P4. Pela análise quantitativa (Graf. 15), verificou-se uma redução no índice de marcação em P1 tanto da região CAR quanto da IC em relação ao NG, porém nos períodos posteriores ocorreu um aumento, sendo estatisticamente significativo em P4 na CAR (P1xP4, P2xP4 P<0,05) (Fig. 12d), em P3 (P1xP3 P<0,05) e P4 (NGxP4 P<0,05,
P1xP4 P<0,001, P2xP4 P<0,01) na IC. Diferença significativa do índice de marcação entre a região CAR e IC foi constatada em P3 (P<0,05).
5 - Discussão
Nas análises macroscópicas e histológicas dos úteros não gestantes de bovinos, de diferentes espécies e raças utilizadas no presente estudo, não foram constatadas diferenças entre as mesmas, sendo facilmente distinguíveis as regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC) ao longo dos cornos uterinos. Macroscopicamente, as CAR foram identificadas como estruturas ovais que se projetavam para luz uterina dispostas em duas fileiras na região mesometrial e duas fileiras na região anti-mesometrial ao longo dos cornos uterinos. As regiões IC consistiam em regiões mais uniformes da mucosa uterina interpondo-se entre as proeminências da região CAR.
Os fragmentos coletados destas regiões e processados para análise histológica apresentaram tanto as regiões CAR quanto as IC revestidas por epitélio pseudoestratificado colunar, porém o estroma de tecido conjuntivo em continuidade a este apresenta diferenças que permitem diferenciar as regiões CAR e IC. A região CAR apresenta um estrato subepitelial (ES) delgado que contínua com um espesso estrato altamente celularizado (Ecel). Abaixo deste, encontra-se uma área do estroma com profusão de vasos arteriais e venosos calibrosos constituindo o estrado vascular (EV), enquanto na região IC os estratos compacto (EC) e esponjoso (EE) contém artérias e veias de pequeno calibre, além de glândulas uterinas. Glândulas estas não encontradas na região CAR. Essas observações estão de acordo com descrições do endométrio de bovinos e búfalos (Schimidt et al., 2006)
O útero sofre modificações morfológicas pronunciadas com o progresso da gestação, as quais foram utilizadas como parâmetros primários para se definir os grupos experimentais, nos quais as principais alterações da histoarquitetura endometrial das regiões CAR e IC em resposta a implantação embrionária e formação da placenta sineptéliocorial foram observadas. Entre o 18º e o 20º dg, inicia-se o processo de adesão do córion resultante do contato das células trofoblásticas com a superfície apical das células epiteliais nos locais mais próximos a vesícula embrionária, sendo que tentativas de remoção dos conceptos nesse período provocam lesões nas células epiteliais (King et al., 1981). De fato, pelas análises histológicas realizadas nas amostras correspondentes a esta fase precoce da implantação (P1), foram evidentes as alterações na CAR e IC com a presença do córion aderido à superfície do epitélio uterino, cujas células apresentavam vacuolizações citoplasmáticas e redução na altura. Era comum a presença de células trofoblásticas binucleadas intercaladas neste epitélio, assim como de células trinucleadas decorrentes da fusão entre as células trofoblásticas e o epitélio uterino.
Estas características quando adotadas como parâmetros de referência e comparadas com o CR dos embriões coincidiam com o período gestacional correspondente a 20-26 dias de gestação, os quais foram arbitrados como pertencentes ao grupo P1 do presente estudo.
Estas características histológicas aferidas para agrupar a amostragem do P1 estão de acordo com autores que relatam uma dramática transformação do epitélio uterino a partir do 19º dg, com o início da mudança na morfologia de cilíndrico simples para cúbico, vacuolização decorrente do aumento de gotículas lipídicas citoplasmáticas e degeneração de células epiteliais na região CAR e IC (Guillomot et al., 1981, King et al., 1980, 1981). Essas modificações indubitavelmente representam uma resposta inicial do epitélio na transição da fase da aposição para a adesão e fixação efetivas do trofoblasto nos processos iniciais da implantação embrionária. Neste período, o estroma uterino também inicia um processo dinâmico de alterações, sendo evidente o aumento do plexo capilar no ES e EC na região CAR e IC, respectivamente. No P1 não foram constatadas diferenças significativas na celularidade do estroma, porém, de acordo com Yamada et al. (2001) componentes da matriz extracelular como os colágenos IV e I, fibronectina e laminina reduzem na região caruncular entre os dias 20-24 de gestação.
Dentre as modificações do endométrio da região CAR, King e colaboradores (1979) relataram o aparecimento de projeções da mucosa a partir do 33dg. Em nossas análises foi constatada a presença de pequenas projeções na mucosa da CAR, de úteros contendo embriões com idade gestacional estimada em 28 dg, as quais crescem como estruturas digitiformes até 33 dg. Este conjunto de animais foi agrupado em P2, que além destas projeções características da mucosa, apresentaram um epitélio cúbico, com citoplasma pouco vacuolizado e menor proporção de células trinucleadas tanto na região CAR quanto na IC. Estas características morfológicas estão de acordo com os relatos de King e colaboradores (1979), porém pelas nossas análises o surgimento das projeções na CAR pode ocorrer mais precocemente (28dg), podendo variar individualmente entre os animais.
Há divergências em relação à formação das projeções na região caruncular. Uma das hipóteses sugere que as projeções são pré-formadas e subseqüentemente invadidas pelas vilosidades fetais e a outra é que as projeções se desenvolvem em resposta a proliferação das vilosidades fetais (King et al., 1979). Pelas nossas observações, a superfície da região CAR no início da gestação apresenta-se plana sem qualquer projeção da mucosa. Considerando que as primeiras irregularidades e projeções surgem no P2, o estímulo para tal resposta endometrial, sem dúvida, deve originar-se inicialmente da presença física do embrião e da interação com
células trofoblásticas. Embora essa interação ocorra em ambas as regiões, a formação das vilosidades exclusivamente na CAR revela que esta mucosa responde de forma distinta e única em relação ao restante da mucosa uterina. Essas observações foram igualmente relatadas por Schmidt e colaboradores (2005) na placenta de bovinos e búfalos, sugerindo que as células da CAR devem apresentar peculiaridades exclusivas que permitem responder ao estímulo para formação das vilosidades.
Alguns autores ressaltam para esta fase, a labilidade da fixação do córion no endométrio devido à facilidade com que ocorre o destacamento do córion da superfície uterina (King et al., 1979). Em nossas análises histológicas foram igualmente freqüentes as áreas nas quais verificou-se a separação entre o córion e a superfície uterina tanto na região CAR quanto na IC em P2. Este fato interpretado inicialmente como artefato de técnica introduzido durante o processamento dos materiais chamou a atenção pela freqüência desta ocorrência, mesmo nos materiais processados sob rigoroso controle de boas práticas laboratoriais. Pela análise histológica, constata-se que a maior extensão do epitélio uterino que reveste a CAR e IC encontrava-se rompida na sua porção apical, permanecendo aderida apenas a porção basal do citoplasma e núcleo, intercalado com áreas onde este epitélio era indistinguível, e com raras áreas nas quais se mantiveram células epiteliais íntegras com o trofoblasto aderido à superfície apical das mesmas.
Estas evidências morfológicas sugerem a ocorrência de rompimento das células epiteliais, durante o manuseio e processamento do material. Isto é, a interface materno-fetal formado pelo trofoblasto-epitélio não se sustenta, provocando a ruptura da célula epitelial do revestimento uterino. As razões que levam à ruptura constante do epitélio nesta fase merecem investigação específica no futuro, porém é plausível supor que a adesão do trofoblasto com o epitélio uterino seja mantida em igual ou maior intensidade em relação à fase anterior de P1.
A coesão entre as células trofoblásticas é mantida através de junções celulares, que permite a formação de uma camada múltipla e contínua desde a sua origem no trofectoderma até a consolidação da placenta independente do seu tipo (Malassine et al., 2003, Bischof & Irminger-Finger, 2005). Por outro lado, as células epiteliais uterinas que se apóiam na lâmina basal, são unidas entre si em monocamada através de junções típicas de células epiteliais da uma mucosa (Thie & Denker, 2002), o que deveria preservar a integridade desta interface materno-fetal. Contudo, a dimensão do embrião resultante do seu rápido crescimento nesta fase buscando a ancoragem na superfície praticamente plana do útero pode não ser proporcional à resistência provida pela simples adesão ou fusão do trofoblasto com a
monocamada de células epiteliais. As imagens destas células rompidas nas análises histológicas pode ser o retrato da facilidade do rompimento do tênue equilíbrio entre as forças mecano-físicas que atuam na interface trofoblasto-epitélio uterino. Aparentemente a coesão entre o trofoblasto e o epitélio se sustenta, porém a resistência física da célula epitelial uterina pode não ser suficiente para eventuais forças mecânicas adicionais, mesmo com a manipulação cuidadosa durante o histoprocessamento.
Esta labilidade do epitélio nesta fase pode ter conseqüências fisiopatológicas importantes na gestação, uma vez que, o P2 coincide com a incidência relatada na literatura de perdas gestacionais no período da implantação embrionária em bovinos (Vasconcelos et al., 1999, Moreira et al., 2001).
No período subseqüente (P3) na região CAR, as projeções digitiformes crescem, ramificam e anastomosam-se criando uma rede tridimensional em cujas malhas ocorre a penetração das vilosidades coriônicas, provendo uma maior área de ancoragem para a fixação das células trofoblásticas ao epitélio das projeções, constituindo-se a formação dos placentônios e a consolidação da implantação. Estas características histológicas quando comparadas com o CR dos embriões, coincide com o período gestacional estimado entre 35-40 dg. Estas observações estão de acordo com as descrições de King e colaboradores (1979) que relataram o aparecimento de ramificações das projeções no 39º dg concomitantemente com o aumento da interdigitação entre as microvilosidades na superfície trofoblástica e das células epiteliais. Essa maior interdigitação entre os tecidos maternos e fetais diminui a distância física entre a circulação sanguínea materna e fetal, na barreira inter-hemática, necessária para as trocas de oxigênio e dióxido de carbono, assim como permite a transferência celular de nutrientes que devem ser aproveitados pelo concepto (Pfarrer et al., 2001).
No Período 4 (P4, 50-60 dg) consolida-se a formação de grandes placentônios constituídos de extensas projeções da mucosa da região caruncular e o embricamento do córion fetal entre estas projeções aumentando sobremaneira a área de coesão e contato para as interações materno-fetais. De acordo com Reynolds et al. (2005), os placentônios de ruminantes compreendem componentes fetais, ou cotiledonários, e maternos, ou carunculares. Apesar dos cotilédones serem muitas vezes referidos como “vilosidades” fetais ou coriônicas, análogas aquelas observadas na placenta de primatas, e de se interdigitarem com “criptas” nas carúnculas, as evidências das seqüências de modificações morfológicas demonstram claramente a formação de projeções digitiformes da mucosa caruncular que se projetam para a luz uterina. Estas projeções expandem-se rapidamente formando um verdadeiro labirinto de
cavidades que são invadidas pelo córion, permitindo a ancoragem do embrião à parede uterina. Neste sentido, cabe ao endométrio da região caruncular projetar a sua superfície para prover uma maior área de adesão e fixação das células trofoblásticas.
A reação imunocitoquímica com anti-PCNA, demonstrou marcações na maioria das células epiteliais das projeções da CAR em P2, P3 e P4, e moderada no ES em P2. Estes resultados comprovam que o crescimento da carúncula advém da atividade proliferativa das células epiteliais e estromais resultando na rápida hipertrofia desta região uterina durante a gestação, onde o placentônio pode atingir um diâmetro de 10-12 cm a partir da carúncula de 10 mm do animal não-gestante (Hafez, 1987, Schlafer et al., 2000). A atividade proliferativa nas células epiteliais e estromais na CAR e IC foram igualmente relatadas por Boos e colaboradores (2003) e Yamauchi e colaboradores (2003). No entanto, não foram considerados quais fatores que poderiam regular positiva ou negativamente a atividade proliferativa dos diferentes tipos celulares, assim como, que poderiam estar relacionados com o processo de formação das projeções na região CAR do endométrio bovino.
O desenvolvimento de muitos órgãos, particularmente aqueles que apresentam projeções da mucosa para a luz, depende de interações epitélio-mesenquimais para o controle local e coordenação de eventos morfogenéticos importantes como movimentação, adesão, diferenciação e proliferação celulares mediada por morfógenos como aqueles da família Wnt e BMP, e seus antagonistas (Batts et al., 2006, Zhou et al., 2006).
As análise da expressão de alguns genes da família Wnt e Bmp através de RT-PCR, demonstrou a presença dos transcritos de Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 e Dkk1 nas regiões CAR e IC tanto no útero NG quanto nos gestantes (P1 a P4). Pela hibridização in situ, confirmaram-se as expressões dos genes Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1,
Sfrp2, além de Bmpr1a e Bmpr2, receptores de BMP. O fato deste conjunto de genes ser
expresso no útero de animais NG e gestantes, assim como na CAR e IC, demonstra que o endométrio uterino como um todo apresenta alta atividade, típica de um ambiente em intensa modificação, situação semelhante àquela encontrada na morfogênese de órgãos com mucosa.
Dentre os genes analisados, o perfil de expressão de Bmp2 significativamente maior na CAR em relação à IC nas amostras de P1 e P2 tanto pelo PCR quanto pela hibridização in situ, sugere que este gene tenha uma participação importante na resposta dessa região relacionada com a implantação embrionária, uma vez que, nestes mesmos períodos a expressão na IC não se altera em relação ao NG.
Corroboram com estes dados as expressões de Bmp2, 4, 6 e 7 no útero de camundongos gestantes durante a implantação embrionária (4,5-7,0dg), sendo a expressão de
Bmp2 espaço-temporalmente associada com o processo de decidualização em camundongos
(Paria et al., 2001, Lee et al., 2007). Segundo Paria e colaboradores (2001), o Bmp2 em combinação com outros fatores como fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2), pode desempenhar um papel de promotor da proliferação e hipertrofia celulares, atividade de fosfatase alcalina e síntese de matriz extracelular associadas com o processo de decidualização. De fato, estudos experimentais demonstram que a BMP2 é uma importante indutora da atividade de fosfatase alcalina e produção de matriz extracelular por células mesenquimais em cultura (Thies et al., 1992, Bachner et al., 1998), sendo ainda um fator crítico para a decidualização das células estromais murinas e humanas (Li et al., 2007a).
O rápido crescimento e morfogênese do epitélio obviamente vêm acompanhado de extensiva remodelação da matriz na interface epitélio-mesenquima (Adams & Watt, 1993). Rothhammer e colaboradores (2008) verificaram que o tratamento de fibroblastos da pele com BMP2 e BMP4 leva ao aumento da expressão de metaloproteases (MMP1, 2, 3 e 13). No endométrio de bovinos durante a implantação, há a maior expressão de metaloprotease 2 (MMP2) nos dias 20 e 30 de gestação na CAR em comparação a IC (Hashizume, 2003), o que pode estar relacionada diretamente com a remodelação da matriz extracelular como parte da resposta da região CAR à presença do embrião.
Um grande número de genes alvos das BMPs já foi identificado (Dijke et al., 2003). Entre esses, os Msx que participam de diversos processos no desenvolvimento embrionário, como a proliferação e diferenciação de células epiteliais, são dependentes de interações coordenadas entre o epitélio e o mesênquima envolvendo a sinalização BMP e WNT (Chen et al., 1996). A expressão de Msx1 verificada no epitélio luminal no momento que inicia a implantação embrionária em camundongos está associada com as expressões de Bmp7 e Wnt5a no estroma (Daikoku et al., 2004). Igualmente, a expressão de Msx1 ocorre no endométrio bovino a partir do 25º dg (Ushizawa et al., 2007), período que coincide com o aumento na atividade proliferativa das células epiteliais e do estrato subepitelial da CAR, conforme demonstrado pela imunomarcação com o anti-PCNA.
As BMPs podem interagir sinergicamente ou antagonicamente com outros fatores como FGF, EGF, HGF e IGF (Montesano et al., 2008, Takahshi et al., 2007). A proliferação e diferenciação no endométrio de vários animais são dependentes também de fatores de crescimento, tais como, fator de crescimento do hepatócito (HGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e fator de crescimento de insulina (IGF) (Dey et al., 2004). Em bovinos,
FGF2 foi identificado no epitélio luminal e glandular no 17º-18º dg (Michael et al., 2006), IGFBP- 1 e 2 no epitélio luminal e estrato subepitelial entre o 13º-15º dg (Keller et al., 1998), e MET (receptor de HGF) no endométrio no 18º dg (Bauersachs et al., 2008). Em ovinos que também apresentam placenta sinepteliocorial, Reynolds e colaboradores (1997b) verificaram a expressão de Igfbp2 no estrato subepitelial da CAR a partir do 29 dg e de Igf2 no mesoderma das vilosidades fetais em contato com essa região. Gadd e colaboradores (2000) relataram a expressão de Igfbp5 nos mesmos locais no período de 30 a 32 dias. Esses relatos demonstram a profusão de fatores além das BMPs que podem atuar na regulação da proliferação celular de forma distinta no epitélio e estroma do útero gestante.
O papel das vias de sinalização da BMP e WNT tem sido extensivamente investigado na regulação do desenvolvimento embrionário e controle da diferenciação e proliferação celulares em tecidos adultos (Lee et al., 2007). Interações genéticas entre essas vias foram observadas em várias espécies e ambientes celulares, incluindo diferenciação osteoblástica e desenvolvimento renal (Hu & Rosenblum, 2005, Nakashima et al., 2005). Lee e colaboradores (2007) demonstraram que a deleção de Bmp2 causou uma desregulação da via de sinalização
WNT, quando verificaram que as expressões de Wnt4 e Wnt6 (Wnts da via não-canônica) foram
abolidas no útero de camundongos seletivamente nocautes para Bmp2 em tecidos que expressam receptores de progesterona.
No presente trabalho, entre os membros da família WNT que utiliza a via canônica de sinalização foram analisadas as expressões de Wnt2 e Wnt7a. Através de RT-PCR, verificamos que Wnt2 apresentou uma redução em P1, enquanto expressão de Wnt7a foi maior em P1 e P4 na CAR. Estes dados demonstram que cada um destes genes apresenta perfis específicos, comprovando um complexo mecanismo de controle relacionado com a resposta uterina nas fases iniciais da gestação.
O gene Wnt2 sofreu uma regulação negativa na CAR e IC no inicio da implantação embrionária (P1), sendo ainda a expressão na CAR menor em relação à IC. Essa regulação negativa não significa que este gene não tenha participação importante na mucosa uterina, pois os níveis de expressão são constantes até P4 e próximos do NG. Na placenta de camundongos
Wnt2-/-, ocorrem vários defeitos severos relacionados à vascularização da região do labirinto,
com rompimento de vasos fetais e edema (Monkley et al., 1996), o que sugere a sua íntima relação com os vasos sanguíneos. A relação de Wnt2 e angiogênese já foi descrita em vários tecidos (Goodwin & D'Amore, 2002) e, portanto a sua relação com vascularização uterina merece ser ainda melhor investigada.
A análise qualitativa através de Hibridização in situ de Wnt7a, revelou a sua presença no epitélio luminal da CAR em níveis próximos do NG até P2, com um aumento significativo em P3. Contudo, a expressão na CAR é invariavelmente menor em relação à IC, o que sugere não ser um gene relacionado com as principais alterações morfológicas encontradas especificamente nessa região. O Wnt7a é expresso no epitélio luminal de ovelhas, camundongos e humanos, implicando a via Wnt canônica de sinalização como um regulador conservado da função endometrial em mamíferos (Hayashi et al., 2007).
Em ovelhas, já foi demonstrado que Wnt7a é um gene induzido por INF-τ no epitélio luminal (Kim et al., 2003) e parece atuar de maneira autócrina no endométrio, regulando a expressão de genes importantes para receptividade uterina e implantação como LGALS15, CTSL (Catepsina L) e CST3 (Cistatina 3) (Hayashi et al., 2007, Spencer et al., 2007). Em bovinos, alguns elementos da via de sinalização WNT canônica (SOX 17 e TLE1) foram observados com alta expressão durante o diestro (Bauersachs et al., 2005), e moléculas relacionadas à adesão celular como LGALS9, LGALS3BP1, CD81 e AGRN foram identificadas no epitélio luminal de vacas no 18º dg, período no qual o trofoblasto bovino ainda produz INF-τ (Bauersachs et al., 2008), o que indica que Wnt7a pode regular a expressão de genes importantes para adesão celular do concepto que começa a estabelecer-se a partir do 19º dg.
Chama a atenção a divergência nos resultados entre RT-PCR e hibridização in situ em P1, que pode estar relacionada com a amostragem da análise. Isto é, enquanto o homogenado tecidual utilizado para a extração do RNA utilizado em RT-PCR abrange a totalidade dos tecidos da mucosa (incluindo a região do ES), a análise quantitativa através da Hibridização in