A minha família e ao Giuliano, por todo o apoio, paciência e incentivo, porque
mesmo sem entenderem em alguns momentos o fato de terem uma filha, irmã, tia e
namorada querendo ser cientista, me apoiaram nessa longa jornada.
"The aim of science is not to open the door to infinite wisdom, but
to set a limit to infinite error."
Agradecimentos
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia, UNICAMP, pela oportunidade para a realização do meu Doutorado.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de Doutorado, que permitiu a execução deste trabalho.
Ao meu orientador Prof. Áureo Tatsumi Yamada pela orientação durante esses quatro anos, pelos ensinamentos técnicos e profissionais.
A Capes, pela concessão da bolsa PDEE que permitiu a realização do meu estágio de Doutorado na Texas A&M University, essencial para a minha formação.
Aos Laboratórios de Citoquímica e Imunocitoquímica (LCI) e ao Laboratório de Genômica e Expressão (LGE) onde este trabalho foi realizado.
Aos membros da pré-banca: Prof. Dr. Durvanei Augusto Maria, Prof. Dra. Ana Flávia de Carvalho, Prof. Paulo Pinto Juazeiro pelas sugestões na análise prévia deste trabalhos.
A amiga Karina, pelos ensimentos sobre PCR, por estar sempre disposta a me ajudar no laboratório e pela amizade verdadeira e sincera.
A Aline, Thalita, Tatiana, Karina, Patrícia, Cláudia, Júlio e Juvani pela disponibilidade, ajuda e companhia nos momentos de colheita de material no frigorífico.
Á Dra. Renata do Frigorífico Angelelli, pela boa vontade em me ajudar e por ter permitido o meu acesso ao material valioso para a minha pesquisa.
Aos meus amigos da pós-graduação Juares, Renata, Eliana, Aline, Júlio, Patrícia, Karina, Cláudia, Patrick, Petra, Maria Amália, Carol, Carla, Débora, Denner pela ajuda no laboratório, amizade, carinho, risadas e convivência agradável nesses quatro anos.
Aos funcionários do DHE/IB/UNICAMP,
Rita,
Marta, Raquel, Baltazar e em especial ao Juvani pela ajuda técnica, amizade sincera e convivência sempre alegre no laboratório.Ao Dr. Thomas Spencer e Dr. Fuller Bazer pela confiança e por terem me acolhido no laboratório de Biologia Uterina e da Gestação, Texas A&M University. A JoAnn Fleming pelos ensinamentos técnicos, e aos amigos Marcel, Niamh, Shaye, Haijun, Gowan, Jin-Young, Carey, Becky e Sara pela ajuda no laboratório, caronas e amizade no período de 6 meses em que estive em College Station.
Aos amigos brasileiros de College Station, em especial a Eliza por ter me recebido de braços abertos e ter me ajudado na adaptação.
Ao Giuliano, meu querido, eu deveria escrever páginas de agradecimentos para você pela paciência, cumplicidade e inestimável ajuda com as imagens...obrigada mesmo.
RESUMO
A implantação embrionária implica em alterações profundas do ambiente uterino, cujos eventos devem obedecer uma sincronia temporal e espacial com o estágio do desenvolvimento embrionário. Qualquer desequilíbrio nesta sincronia resulta em interrupção da gestação e o desconhecimento dos mecanismos que atuam nas interações materno-fetais inviabilizam as possíveis intervenções buscando controlar as causas que levam às perdas iniciais da gestação. Visando contribuir para a melhor compreensão da biologia da resposta uterina de bovinos, o presente trabalho utilizou úteros de bovinos (Bos spp) não gestantes (NG) e gestantes nos períodos correspondentes à implantação embrionária para a coleta de fragmentos das regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC). Esses fragmentos foram processadas para embebição em parafina destinadas às análises histológicas e obtenção de RNA total para realização de RT-PCR semi-quantitativo dos morfógenos Bmp2, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, e de seus antagonistas Sostdc1, Noggin, Dkk1 e Sfrp2. Pela análise histológica do desenvolvimento da mucosa uterina da região CAR foram estabelecidos os critérios morfológicos das seqüências de alterações da histoarquitetura endometrial em resposta à implantação embrionária constituindo quatro grupos (P1-P4) definindo os períodos gestacionais correspondentes, quais sejam: P1 (20-26 dg) - adesão das células trofoblásticas na superfície apical das células epiteliais e/ou entremeadas no revestimento epitelial, P2 (28-33 dg) – presença de projeções digitiformes na superfície da região CAR e tecido epitelial uterino constantemente rompido em ambas as regiões CAR e IC, P3 (35-40 dg) – expansão das projeções da região CAR formando uma rede anastomosada, entremeada pelo córion e P4 (50-60dg) - consolidação do placentônio. A ruptura das células epiteliais observada em P2 demonstra a fragilidade da interação epitélio-córion neste período que pode estar diretamente relacionada com a alta freqüência de perdas gestacionais em bovinos particularmente durante a implantação embrionária. A reação imunocitoquímica para anti-PCNA demonstrou uma marcação crescente no epitélio (E) e estrato subepitelial (ES), particularmente nas projeções da CAR de P1 a P4 e em menor proporção no E e estrato compacto (EC) da IC, confirmando a intensa atividade proliferativa associada com a hipertrofia endometrial. As análises da expressão genica através de RT-PCR, demonstraram a presença dos transcritos de Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2,
Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 e Dkk1, e pela hibridização in situ, confirmaram-se as expressões
localizadas dos genes Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, além dos receptores Bmpr1a e
Bmpr2 no E+ES da CAR e E+EC da IC no útero NG e gestantes de P1 a P4. A expressào de Bmp2 foi maior na CAR em relação a IC em P1 e P2 o que sugere uma participação importante
na ativação da resposta da região CAR relacionada com a implantação embrionária, enquanto o
Wnt5a parece não atuar neste período. A redução da expressão de Wnt2 em P1, indica uma
regulação negativa na CAR e IC no inicio da implantação, enquanto que a menor expressão de
Wnt7a na CAR em relação a IC sugere que este gene não está relacionado com as principais
alterações observadas nessa região. A maior expressão de Dkk1 e Sfrp2 na CAR em relação à IC, sugere a participação na atividade celular da região CAR, porém não apresenta relação direta com a expressão dos genes Wnt analisados, assim como a ausência de Sostdc1 no endométrio e a menor expressão de Noggin demonstram não serem estes os antagonistas principais de BMP que atuam no endométrio bovino. A expressão de Wnt e Bmp em conjunto com seus antagonistas simultaneamente nas regiões CAR e IC atesta a dependência da ação múltipla e sinérgica/antagônica de vários fatores na modulação da resposta da mucosa uterina na implantação embrionária e durante o desenvolvimento da placentação sinepitéliocorial.
Palavras chave: 1. Morfógenos. 2. Endométrio bovino. 3. Placentônio. 4. Histoarquitetura. 5. Expressão gênica.
ABSTRACT
The embryo implantation implies in deep changes of the uterine environment which events must be topologically and chronologically synchronized with embryo development stage. Any imbalance in this synchronization results in disruption of the gestation and the lack of knowledge regarding the mechanisms of maternal-fetal interaction make difficult any potential action intending to control the causes which induce early gestational loss. Aiming to contribute to a better understanding of the biology of bovine uterine response, the present work evaluated the caruncle (CAR) and intercaruncle (IC) regions collected from non-pregnant (NG) and pregnant bovine uteri (Bos spp) and processed for paraffin embedding and submitted to histological analysis, RNA isolation for RT-PCR of Bmp2, Wnt2, Wnt5a and Wnt7a morphogen genes and their antagonists Sostdc1, Noggin, Dkk1 and Sfrp2 gene expression. By histological analysis of CAR uterine mucosa development, the morphological criteria of the endometrial histoarchitecture changes sequences were established and adopted to compose four groups (P1 – P4) with corresponding gestational stages: P1 (20-26 gd) – adhesion of throphoblast cells on the apical surface of epithelium cells and/or between them, P2 (28-33 gd) – villous-like projections on the CAR surface and areas of disrupted or absence of epithelial cells on both CAR and IC regions, P3 (35-40 gd) – expansion of villous-like projections resulting in an anastomosis mesh where chorion villi intrude, P4 (50-60 gd) – placentome consolidation. The constant disruption of epithelial cells seen in P2 evidenced the fragility of epithelium-chorion interaction that may be related to the high incidence of bovine pregnancy loss particularly during embryo implantation. The immunocytochemistry for PCNA demonstrated reactivity in epithelium (E) and subepithelium stratum (SS), particularly on CAR villous-like projections from P1-P4 and in a less frequent proportion in the epithelium (E) and compactum stratum (CS) from IC, demonstrating the intense proliferative activity associated with endometrial hypertrophy. The gene expression analysis by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) confirmed the transcripts for Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 and Dkk1, and by In situ hybridization the localized expression of Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, and also
Bmpr1a and Bmpr2 receptors in E+SS and E+CS in NG and P1-P4 uteri. The Bmp2 expression
was higher on CAR when compared to IC in P1 and P2 which suggest an important involvement on CAR response activation related to embryo implantation, whereas Wnt5a does not seem to participate at this period. The decreased expression of Wnt2 in P1 point out a negative regulation on CAR and IC in the beginning of implantation, while the lower expression of Wnt7a in CAR when compared to IC suggest that this is not the main gene related to changes of CAR
in pregnancy. The highest expression of Dkk1 and Sfrp2 on CAR when compared to IC indicate their participation on the cellular activity on the CAR region, but it is not involved directly with the expression of Wnt genes analyzed, as well as the absence of Sostdc1 on the endometrium and the lowest expression of Noggin demonstrated that they are not the main BMP antagonists acting on bovine endometrium. The expression of Wnt and Bmp together with their antagonists simultaneously on CAR and IC regions attest the multiple and synergic/antagonic action of several factors on the modulation of uterine mucosa response during the embryo implantation and development of synepitheliochorial placentation.
Key words: 1. Morphogens. 2. Bovine endometrium. 3. Placentome, 4. Histoarchitecture, 5. Gene Expression.
Lista de acrônimos e abreviaturas
ActR-II – activin receptor type II ActR-IIB - activin receptor type IIB AGRN - agrin
ALK2 – activin receptor-like kinase-2 ALK3 - activin receptor-like kinase-3 ALK6 - activin receptor-like kinase-6 ANOVA – análise de variância APC - adenomatous polyposis coli BLAST - basic local alignment search tool
BLAT – ferramenta do programa de bioinformática UCSC Genome Bioinformatics BMP - bone morphogenetic protein
Bmp - bone morphogenetic protein gene
BMPRIA - BMP receptor type IA
Bmpr1a – BMP receptor type IA gene
BMPRIB - BMP receptor type IB
Bmpr1b – BMP receptor type IB gene
BMPRII - BMP receptor type II
Bmpr2– BMP receptor type II gene
BNC – binucleate trophoblast cells CaCN - calcium channels
CAR – região caruncular/caruncula CD81 - cluster of differentiation 81 cDNA – complementary DNA
cGMP - cyclic guanosine monophosphate
CamKII - calcium/calmodulin-dependent protein kinase II CI – chloroform/isoamyl alcohol
CPM/ml - contagens por minuto, de um ml
CR (crow-rump) - mensuração da distância occípto-sacral CST3 – cystatin 3
CTSL – cathepsin L
DAN – differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma DEPC - DiEthylPyroCarbonate
DKK1- Dickkopf protein
Dkk1 – Dickkopf gene
DVL - Dishevelled E - epitélio luminal EC - estrato compacto Ecel - estrato celularizado EE - estrato esponjoso EGF - epidermal growth factor
Ensembl – ensembl genome browser ERK - extracellular signal-regulated kinase ES - estrato subepitelial
EST - expressed sequence tags EtBr – ethidium bromide
FGF2 - fibroblast growth factor 2 Fzd – frizzeled
Frat1 - frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GMCSF - granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GSK-3β - glycogen synthase kinase 3
H.E – hematoxilina/ eosina HGF - hepatocyte growth factor
IC – região intercaruncular/intercaruncula IFN-τ - interferon-tau
IGF - insulin-like growth factor
Igf - insulin-like growth factor gene
IGFBP1 - insulin-like growth factor binding protein 1
Igfbp1 - insulin-like growth factor binding protein 1 gene
JNK- janus kinase Krn - kremen LB - luria broth
LEF/TCF - lymphoid enhancer factor/T-Cell Factor LGALS15 – galectin 15
LGALS9 – galectin 9
LRP – lipoprotein-receptor related protein MET – mesenchymal-epithelial transition factor MGP - matrix GLA protein
MMP2 – metaloprotease 2 Msx – genes homeobox
NCBI - national center for biotechnology information NG – grupo não gestante na fase lútea
P1 – 20-26 dias de gestação P2 – 28-33 dias de gestação P3 - 35-40 dias de gestação P4 – 50-50 dias de gestação
p38 MAP quinase – proteína quinase ativada por mitógeno p38 p53 - gene supressor tumoral
PAG – pregnancy associated glycoprotein PBS – phosphate buffered saline
PCP - planar cell polarity
PCI - phenol/chloroform/isoamyl alcohol PCNA - proliferating cell nuclear antigen PCR - polymerase chain reaction
PGF2α - prostaglandina F2α PKC – protein kinase C PL – placental lactogen PT - pixel total
Rho/Rac - guanine nucleotide (GTP)-binding proteins RNA - ácido ribonucleico
RNAsin – inibidor de Ribonuclease RNAt – RNA transportador
RT-PCR - reverse transcriptase-polymerase chain reaction
SMAD – combination of Drosophila protein MAD and C. elegans protein SMA SFRPs - secreted frizzled-related proteins
SOST - sclerotin
SOSTDC1 - sclerostin domain containing 1 SOX 17 - Sox family of HMG box transcription SP6 – RNA polimerase
T7 – RNA polimerase
TGF-β - transforming growth factor beta TGF-α - transforming growth factor alpha TLE1 - transducin-like Enhancer of Split 1 TNF-α - tumor necrosis factor alpha
USAG-1 - uterine sensitization-associated gene-1 WIF-1 - Wnt inhibitory factor-1
WNT - proteína homóloga a Wg (wingless) da Drosophila.
ÍNDICE
Agradecimentos ...vi
Resumo... viii
Abstract ...x
Lista de acrônimos e abreviaturas ...xii
1 – Introdução ... 1
1.1 - Histoarquitetura do endométrio bovino ... 2
1.2 - Implantação embrionária em bovinos ... 4
1.3 - Placentação em bovinos ... 7
1.4 - Interações epitélio-estroma e morfógenos... 9
1.4.1 - Morfógenos BMP e WNT ... 9 1.4.2 - Antagonistas de BMP e WNT ... 14 1.5 – Considerações finais ... 16 2 - Objetivos ... 18 2.1 - Objetivo geral ... 18 2.2 - Objetivos específicos ... 18 3 - Materiais e Métodos... 20 3.1- Animais ... 20
3.2 - Processamento dos materiais... 21
3.2.1 - Processamento e análise histológica... 21
3.2.2 - Estabelecimento dos estágios gestacionais ... 21
3.2.3 - Homogenado tecidual para obtenção do RNA e confecção do cDNA ... 22
3.3 - Imunocitoquímica com anti-PCNA ... 23
3.4 - RT-PCR semi-quantitativo ... 23
3.4.1 - Confecção dos “Primers” ... 23
3.4.2 - Amplificação dos transcritos - PCR... 24
3.4.3 - Quantificação do produto de PCR ... 25
3.5 - Procedimentos para construção das sondas de RNA para Hibridização in situ ... 25
3.5.1 - Obtenção de DNA ou cDNA... 25
3.5.2 - Subclonagem e transformação do plasmídeo... 26
3.5.3 - Seqüenciamento ... 27
3.5.4 - Linearização dos plasmídeos... 27
3.5.5 - Transcrição da sonda de RNA marcada com 35S ... 27
3.7 - Análise qualitativa e índice de marcação... 29
4 - Resultados ... 32
4.1 - Análise morfológica... 32
4.1.1 - Útero não gestante na fase lútea ... 32
4.1.2 - Útero gestante... 33
4.1.2.1 - Grupo P1... 33
4.1.2.2 - Grupo P2... 33
4.1.2.3 - Grupo P3... 34
4.1.2.4 - Grupo P4... 34
4.2 - Análise da atividade proliferativa ... 35
4.3 – Análise da Expressão gênica ... 35
4.3.1 - PCR semi-quantitativo ... 35 4.3.1.1 – Bmp2 ... 36 4.3.1.2 – Sostdc1 e Noggin ... 36 4.3.1.3 - Genes Wnt ... 37 4.3.1.4 – Dkk1 e Sfrp2... 37 4.3.2 – Hibridização in situ ... 37 4.3.2.1 – Bmp2 ... 38 4.3.2.2 – Bmpr1a... 38 4.3.2.3 – Bmpr2... 38 4.3.2.4 - Genes Wnt ... 39 4.3.2.5 - Dkk1 e Sfrp2 ... 39 5 - Discussão... 42 6 - Conclusões ... 55 7 - Anexos ... 58 8 - Referências Bibliográficas... 89
1 - Introdução
Animais vivíparos completam seu desenvolvimento embrionário no interior do útero. Esse período de desenvolvimento intra-uterino é chamado prenhez ou gestação e está relacionado, em primeiro lugar com a nutrição do feto em desenvolvimento e com as adaptações maternas dirigidas a essa finalidade (Jainudeen & Hafez, 2004). Uma significante perda gestacional é comum a muitos mamíferos no período peri-implantacional decorrente tanto do processo de seleção de embriões inviáveis (Dey et al., 2004) como da falta de sincronia entre os muitos eventos do desenvolvimento embrionário e da resposta uterina à implantação embrionária.
O estabelecimento da gestação no útero de ruminantes domésticos (bovinos, ovinos e caprinos) começa com a migração do blastocisto para este ambiente, promovendo a sinalização necessária para o reconhecimento materno, prossegue com a implantação do concepto, a formação da placenta e termina com o parto (Jainudeen & Hafez, 2004, Spencer et al., 2008), Em bovinos este período compreende em média 278 dias (Jainudeen & Hafez, 2004).
A taxa de fertilização em novilhas seguida de inseminação artificial ou monta natural é de 90-95%, entretanto, o índice de nascimento é da ordem de 55%, indicando substanciais perdas embrionárias e fetais entre a fertilização e o parto (Sreenan et al., 1999). Em vacas com embriões viáveis, diagnosticados do 25º ao 32º dia após inseminação artificial, a taxa de perda gestacional no período entre 50-98 dias variou de 14-40% (Vasconcelos et al., 1999, Moreira et al., 2001). Essas perdas gestacionais no período da implantação embrionária não têm sido contornadas, mesmo com melhorias nas tecnologias de fertilização in vitro, inseminação artificial e transferência de embriões.
Esses dados indicam a importância da necessidade do conhecimento pleno acerca dos mecanismos da interação materno-fetal no período da implantação embrionária e desenvolvimento placentário visando o melhor entendimento dos fatores causadores das perdas gestacionais que permitam entre outras, as intervenções visando à melhoria dos índices de produtividade da pecuária brasileira.
1.1 - Histoarquitetura do endométrio bovino
Ao longo do endométrio bovino, é possível distinguir regiões carunculares (CAR) e regiões intercarunculares (IC) (Fig. 1). As carúnculas são proeminências ovais, em número de aproximadamente cem, dispostas em duas fileiras na região mesometrial e duas fileiras na
região anti-mesometrial ao longo dos cornos uterinos, sendo o eixo longitudinal das carúnculas paralelo ao eixo longitudinal dos cornos uterinos (Sisson, 1986, Schmidt et al., 2005). A presença de carúnculas ocorre no endométrio dos ruminantes domésticos como bovinos, caprinos, ovinos e búfalos. As áreas intercarunculares apresentam uma superfície relativamente lisa entre as regiões carunculares (Schmidt et al., 2005).
Figura 1: Útero bovino não gestante dissecado para exposição da superfície endometrial. Notar fileiras de projeções na luz correspondentes às regiões carunculares (setas) e intercarunculares (asteriscos). Em destaque o detalhe de uma carúncula
Histologicamente, a carúncula constitui-se de um espessamento circunscrito da lâmina própria endometrial destituído de glândulas uterinas, constituído de tecido conjuntivo frouxo no qual diferencia-se uma fina camada celular subepitelial (estrato subepitelial) que continua-se com uma espessa área altamente celularizada e com esparsa matriz extracelular (estrato celularizado). Abaixo do estrato celularizado, distingui-se uma camada vascular (estrato vascular) que apresenta numerosas artérias musculares e veias de paredes espessas que são contínuas com o plexo vascular do miométrio. O diâmetro dos vasos decresce na direção do epitélio luminal, formando arteríolas e vênulas que terminam em uma rede capilar no estrato subepitelial (Schmidt et al., 2005).
O estroma uterino, na região intercaruncular, é constituído de tecido conjuntivo frouxo dividido em um estrato compacto e um estrato esponjoso que se estende até a túnica muscular (Johnson et al., 2003), numerosas glândulas uterinas são observadas em toda a região
*
*
intercaruncular. O epitélio da superfície endometrial é pseudo-estratificado e/ou colunar simples com microvilosidades em ambas as regiões carunculares e intercarunculares (Banks, 1992, Priedkalns & Leiser, 1998, Schmidt et al., 2005). O epitélio glandular é semelhante ao da superfície endometrial, a não ser pela presença de cílios na superfície apical das células colunares (Schmidt et al., 2005).
1.2 - Implantação embrionária em bovinos
A duração do período da implantação embrionária difere entre as espécies e não está relacionado com a duração da gestação (Guillomot et al., 1993). As diferenças resultam da duração das fases da implantação (horas em roedores a dias em humanos e animais domésticos), da evolução dos contatos célula-célula, e do grau de invasibilidade do endométrio pelo trofoblasto (Spencer et al., 2004). A implantação embrionária, na maioria dos mamíferos placentados, compreende as fases de: 1) rompimento da zona pelúcida, 2) pré-contato e orientação do blastocisto, 3) aposição, 4) adesão e 5) invasão endometrial (Guillomot et al., 1993). Todas essas fases ocorrem em ruminantes domésticos, porém a invasão endometrial é muito limitada.
Em bovinos, o embrião em estágio de mórula atinge o útero ao redor de 4-5 dias pós-cobertura, e desenvolve-se em blastocisto ainda confinado pela zona pelúcida formado por uma massa celular interna e a cavidade blastocística (blastocele) coberta por uma monocamada de trofoectoderma, nos dias 6-8 pós-cobertura (Bazer & First, 1983, Guillomot, 1995). A eclosão do blastocisto ocorre ao redor do 10º dia de gestação (dg) e a partir do 14º dg, concomitante à formação do disco embrionário bilaminar, inicia-se o crescimento e alongamento do concepto (embrião e membranas extra-embrionárias (Degrelle et al., 2005), atingindo no 22º dg a extremidade do corno contra-lateral não gestante. Esse rápido alongamento lateral do concepto, ocorre por meio de uma contínua hiperplasia do trofoblasto aumentando o tamanho do concepto em mais de 1000 vezes (Maddox-Hyttel et al., 2003, Geisert & Malayer, 2004). O embrioblasto que formará o embrião permanece no corno ipsilateral ao corpo lúteo (Geisert & Malayer, 2004) enquanto o mesênquima extra-embrionário junto do revestimento trofoblástico forma o córion.
Nos primatas e roedores as células trofobásticas do blastocisto aderem ao epitélio uterino assim que chegam ao útero, enquanto nos ruminantes, após o rompimento da zona pelúcida, este permanece no lúmen uterino por um longo período que precede a efetiva fase de implantação, definido pela adesão embrionária através da aposição do trofoblasto sobre o
epitélio uterino. Nesse período de alongamento do concepto, ocorre uma sinalização com a produção de interferon-tau (IFN-τ) pelas células trofoblásticas, que é crítica para o reconhecimento materno da gestação e implantação (Farin et al., 1989, Guillomot et al., 1990, Gray et al., 2002). O IFN-τ age de uma forma parácrina no endométrio para inibir o mecanismo luteolítico de liberação de Prostaglandina F2α (PGF2α), garantindo assim a continua produção de progesterona pelo corpo lúteo (Thacher et al., 1989). Adicionalmente, o IFN-τ estimula a expressão de vários genes no endométrio importantes para receptividade uterina e implantação (Hansen et al., 1999, Spencer et al., 2007).
Durante o prolongado período de aposição (8-9 dg), as secreções produzidas pelas glândulas uterinas (histotroph) contribuem para o desenvolvimento embrionário inicial no lúmem uterino. O “histotroph” se constitui em uma mistura de enzimas, citocinas, linfocinas, fatores de crescimento, hormônios, carboidratos, proteínas transportadoras e moléculas de adesão (Bazer & Roberts, 1983). Muitos desses produtos exercem uma influência no concepto e no endométrio para: 1) suportar o desenvolvimento do concepto e conseqüentemente a liberação de suas secreções que sinalizam para o reconhecimento materno da gestação e 2) contribuir para que o ambiente uterino se torne compatível com a fase receptiva seguinte (Burghardt et al., 2002).
A adesão embrionária efetiva inicia-se em bovinos entre os 18-20 dg nas regiões do córion próximas ao embrião junto às superfícies das regiões carunculares e intercarunculares. A aderência do córion à superfície uterina pode ser comprovada pela ocorrência de lesão no epitélio se os blastocistos forem removidos por meio de lavagem uterina (King et al., 1981). Células trofoblásticas binucleadas (BNC) se originam de células trofoblásticas uninucleadas do trofoectoderma (Wathes & Wooding, 1980) e à semelhança do que ocorre com as células trofoblásticas de animais com placentação hemo ou endotéliocoriais, presume-se que tornam-se “móveis” e “migrem” até atingirem o epitélio luminal, onde tornam-se intornam-serem e ocasionalmente tornam-se fusionam com células epiteliais maternas para formar células trinucleadas ou gigantes (Wathes & Wooding, 1980, Wooding, 1983). A presença de BNC é máxima ao redor do 24º dg, mas continua durante a gestação em todo o endométrio (Wooding, 1983, Wooding, 1992). Apesar desta capacidade “invasiva” do trofoblasto bovino, este não supera a barreira epitelial para atingir o estroma endometrial. Essas células liberam moléculas como lactogênio placentário (PL) e glicoproteínas associadas à gestação (PAG) para o endométrio após exocitose dos grânulos (Wooding, 1992). Concomitante à proliferação e migração de células trofoblásticas, alterações na estrutura e função do endométrio permitem a implantação do embrião e o estabelecimento de uma placenta funcional.
A implantação embrionária implica em profundas mudanças no endométrio como um todo que além de favorecer a adesão e fixação do córion, posteriormente deve consolidar a formação de uma placenta funcional. Muitas dessas modificações envolvem ambos o epitélio luminal e o estroma. A perda de microvilosidades, o “achatamento” do epitélio e modificações no glicocálice estão relacionados com receptividade uterina, sendo eventos comuns a muitas espécies (Murphy, 2004). Esses processos envolvem mudanças estruturais na membrana celular apical e redistribuição de potentes moléculas de adesão celular (Chavatte-Palmer & Guillomot, 2007).
A resposta do estroma à implantação é considerável, variando de acordo com as espécies, mas apresentando manifestações comuns como edema associado a aumento da permeabilidade capilar e vasculogenêse. A mais marcante modificação do estroma é observada em espécies com implantação invasiva e placentação hemocorial, com a transformação dos fibroblastos do estroma em células epitelióides, associada com proliferação e poliploidia denominada de decidualização. Estas células deciduais desempenham um importante papel no crescimento e diferenciação trofoblásticas (Chavatte-Palmer & Guillomot, 2007) produzindo glicogênio, fosfatase alcalina, prolactina, e diversos fatores de crescimento (TGF-α, TGF-β, IGF, IGFBP1, TNF-α, GMCSF), além de interleucinas que promovem a imunomodulação da interface materno-fetal (Dey et al., 2004).
Por outro lado, o processo de implantação em bovinos é superficial, isto é, não ocorre a invasão trofoblástica do estroma uterino e sua decidualização. Devido a esse fato, poucos estudos deram atenção ao papel do estroma uterino, e nas modificações que ocorrem no mesmo durante a implantação (Johnson et al., 2003). Um interessante aspecto do endométrio de ruminantes é a presença de diferenças consideráveis na constituição do estroma entre as regiões carunculares e intercarunculares. Embora durante o ciclo estral haja semelhanças quanto à expressão gênica entre estas regiões, a partir da implantação embrionária ocorre aumento da expressão de 35 genes e redução da expressão de mais de 1000 genes na região caruncular (Hashizume, 2007).
Além disso, modificações na matriz extracelular notadamente na região caruncular já foram evidenciadas como a redução dos colágenos IV e I, fibronectina e laminina no período de 14 a 24 dg (Yamada et al., 2001). Entre as proteinases que degradam a matriz extracelular, Hashizume e colaboradores (2003) verificaram maior expressão de Metaloprotease 2 (MMP2) na região caruncular em relação à região intercaruncular nos dias 20 e 30 de gestação, indicando um papel na disponibilidade dos contatos célula-célula e remodelação do epitélio e estroma endometriais. A expressão de heparanase no endométrio, foi ausente ou bastante
reduzida na região intercaruncular entre os dias 30-260 de gestação, a principal células produtoras de heparanase na placenta bovina é a célula trofoblástica binucleada (Kisaki et al., 2001). Esses dados indicam a existência de diferenças inequívocas entre as regiões carunculares e intercarunculares a partir da implantação embrionária.
1.3 - Placentação em bovinos
Após o contato inicial (aposição e adesão) entre o trofoblasto e epitélio uterino, as interações subseqüentes entre o trofoblasto e o tecido materno diferem significativamente de acordo com o tipo de placentação (Meeusen et al., 2001). Nos ruminantes domésticos, a placenta sinepitéliocorial é o resultado da implantação superficial, com uma interface contínua com o córion, formado pelas células trofoblásticas apoiado no seu mesênquima, do lado embrionário e as células do epitélio uterino e estroma adjacente do lado materno.
O sucesso da implantação superficial depende do desenvolvimento de uma rede capilar próximo ao local de fixação embrionária para prover as trocas gasosas e nutricionais. Além disso, como não há contato direto do trofoblasto com o sangue materno, macro e micronutrientes que necessitem de uma molécula carreadora, como ferro não pode ser adquirido diretamente. Esses suprimentos são providos pelo “histotroph” que “banha” o trofoblasto, como um mecanismo alternativo. Uma placenta não invasiva requer adaptações na forma como o concepto se comunica com a mãe, uma vez que as moléculas de sinalização produzidas pelo trofoblasto não tem acesso direto ao sangue materno e seus efeitos precisam ser recebidos e inicialmente interpretados pelo epitélio uterino (Roberts et al., 2008).
A placenta é formada quando as membranas fetais, que compreendem a camada trofoblástica e a camada do mesênquima com vasos sanguíneos, formando o córion, entram em íntimo contato com a parede uterina (Carter et al., 2004). Em bovinos, a partir de 30 dg, começam a ser observadas ondulações na superfície caruncular, e com 33 dg projeções da mucosa são facilmente distinguíveis e se interdigitam com as vilosidades coriônicas. Entre 36-40 dg, essas projeções aumentam em tamanho e complexidade apresentando ramificações secundárias (King et al., 1979).
A interdigitação entre as vilosidades coriônicas (cotilédones fetais) e as projeções da mucosa que se desenvolvem nas carúnculas forma os placentônios. Os placentônios estão arranjados de maneira ordenada em quatro fileiras ao longo dos cornos uterinos, sendo maiores no corno gestante e menores próximo as extremidades dos cornos uterinos. A área de superfície de contato entre mãe e feto é grandemente aumentada pela extensiva interdigitação
entre os tecidos maternos e fetais observada nesta estrutura, sendo estimada em 130 m2
(Schlafer et al., 2000, Russe & Sinowatz, 1991). Dessa forma, o placentônio é fundamental para as trocas hemotróficas entre as circulações materna e fetal.
Apesar dos cotilédones serem muitas vezes denominados de “vilosidades” fetais ou coriônicas, semelhantes aquelas observadas na placenta de primatas, e de se interdigitarem com “criptas” nas carúnculas como alguns autores citam, ambos os cotilédones e carúnculas formam projeções ou vilosidades. Isto significa que as vilosidades coriônicas não invadem o estroma da carúncula criando criptas, mas ambas as partes fetal e materna dos placentônios crescem em conjunto (Reynolds et al., 2005). A formação das projeções carunculares envolve somente o epitélio luminal e o tecido conjuntivo subepitelial (estrato subepitelial) irrigado por capilares sanguíneos que continuam com a vascularização do estroma do estrato vascular, o que sugere que as células desta região do endométrio devem apresentar peculiaridades exclusivas que permitem responder a algum estímulo para formação das projeções (Schmidt et al., 2005). Entretanto, esse fenômeno é pouco estudado até o momento em todos os ruminantes, mesmo sendo o placentônio uma estrutura única, entre os vários tipos de placentas, que amplifica e projeta a mucosa endometrial para a luz uterina através da proliferação e diferenciação celular dos tecidos localizados nesta área.
A atividade proliferativa na carúncula aumenta rapidamente a partir de 30 dias de gestação quando inicia-se o desenvolvimento das vilosidades. No animal não-gestante, o diâmetro é de 10 mm aproximadamente, atingindo 10-12 cm quando os placentônios são formados nesta área durante a gestação (Hafez, 1987, Schlafer et al., 2000). Apesar das carúnculas crescerem durante toda a gestação, o crescimento dos cotilédones cessa e sua massa pode até diminuir depois de 7 meses de gestação em vacas (Prior & Laster, 1979, Reynolds et al., 1990). Há redução da taxa de crescimento dos cotilédones e mudanças na proporção de tecidos maternos e fetais no placentônio. As proporções são 1:1 durante os meses 1-3, 1,5-1,6:1 durante os meses 4-7 e 1,8:1 durante os meses 8-9 (Laven & Peters, 2001).
O crescimento da massa uterina pode ocorrer por hiperplasia ou hipertrofia celulares. Estudos histológicos, histoquímicos e bioquímicos de placentônios e da região entre os placentônios (interplacentomal) indicam que é principalmente proliferação celular, o evento responsável pelo crescimento dos placentônios (Anthony et al., 1986, Reynolds et al., 1990, Wooding et al., 1993), enquanto que na região interplacentomal, o aumento tecidual é atingido através de hipertrofia (Reynolds et al., 1990). Yamauchi e colaboradores (2003) verificaram que as células estromais derivadas da carúncula, de animais na fase lútea do ciclo estral,
apresentam maior capacidade de proliferação e expressão de ciclina E até o sexto dia de cultivo in vitro, em relação às células estromais da região intercaruncular. No entanto, pouco se sabe sobre os fatores que seriam responsáveis por essa maior proliferação celular observada na região caruncular com o desenvolvimento da placenta durante a gestação.
1.4 - Interações epitélio-estroma e morfógenos
O desenvolvimento de muitos órgãos, incluindo aqueles que apresentam projeções da mucosa para a luz, tais como as vilosidades do intestino ou papilas da língua, ou ainda crescimento do epitélio em aposição ao mesênquima para a formação de túbulos e glândulas como no útero, rim, glândula mamária e próstata, depende de interações epitélio-mesenquimais para o controle local e coordenação de eventos morfogenéticos importantes como movimentação, adesão, diferenciação e proliferação celulares (Thesleff et al., 1995).
Evidências indicam que as interações entre o epitélio e mesênquima, ou entre o epitélio e estroma subjacente, mediadas por diversos morfógenos, são recíprocas e essenciais no desenvolvimento fetal e pós-natal destes tecidos. Entre esses morfógenos, as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e as proteínas WNT têm sido apontadas como importantes reguladores para o crescimento e diferenciação dessas estruturas (Batts et al., 2006, Zhou et al., 2006).
1.4.1 - Morfógenos BMP e WNT
As BMPs pertencem a uma grande família de proteínas estruturalmente relacionadas, conhecida como a superfamília do fator de crescimento transformante beta (TGF-β) (Goumans & Mummery, 2000). As BMPs foram inicialmente isoladas por sua habilidade de induzir a formação ectópica de osso e cartilagem in vivo no tecido muscular e subcutâneo de roedores (Urist, 1965). Entretanto, estudos de expressão de BMPs, assim como pela análise de camundongos nocaute, demostraram uma grande variedade de atividades biológicas para diferentes membros da família BMP em diversos tipos celulares. As BMPs regulam proliferação e diferenciação celular, quimiotaxia e apoptose com papel fundamental no controle da assimetria esquerdo-direita, neurogênese, diferenciação do mesoderma, e desenvolvimento de inúmeros órgãos dos sistemas geniturinário, digestório e respiratório (Hogan, 1996, Graff, 1997, Ebendal et al., 1998).
Os membros da família BMP se ligam a receptores tipo II e tipo I serina treonina quinase, ambos necessários para a tradução do sinal. O domínio serina treonina quinase dos receptores tipo II são constitutivamente ativos e fosforilam os domínios glicina-serina nos receptores tipo I levando a ativação do receptor quinase tipo I, portanto, a especificidade da sinalização intracelular é principalmente determinada pelo receptor do tipo I. As BMPs podem se ligar a três distintos tipos de receptores do tipo II (BMPR-II, ActR-II, ActR-IIB) e a três do tipo I como ALK-2, ALK-3 (BMPR-IA) e ALK-6 (BMPR-IB). Uma vez ocorrida a ativação do receptor, BMP transmite sinais por meio de vias dependentes e independentes de proteínas Smad, incluindo quinase regulada por sinal extracelular (ERK), janus quinase (JNK) e proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38 MAP quinase) (Fig. 2) (Derynck et al., 2001).
Figura 2: Vias de sinalização BMP. Após a formação do complexo receptor Tipo I e II, o domínio serina treonina quinase dos receptores tipo II fosforila o domínio glicina-serina do receptor Tipo I levando a sua ativação. A ativação do receptor Tipo I fosforila R-Smad que forma um complexo com co-Smad e se transloca para o núcleo, no qual pode se ligar diretamente, ou através de outros fatores de transcrição, às seqüências específicas nas regiões promotoras dos genes alvo regulando a transcrição desses genes. As I-Smads são genes alvo das BMPs que formam um mecanismo de feedback negativo. As BMPs também podem transmitir sinais por meio de vias independentes de Smad como ERK, JNK e p38 MAP quinase. Adaptada de Dijke et al. (2003).
No trato gastrointestinal, BMP2 influencia a diferenciação das células epiteliais do estomago (Itoh et al, 2006), o desenvolvimento das vilosidades e criptas intestinais (Haramis et al., 2004). Enquanto que no desenvolvimento renal, BMP7 está presente no broto do ureter assim que este emerge do ducto mesonéfrico (Godin et al., 1999), e BMP2 é detectada nos agregados pré-tubulares e na parte distal dos túbulos iniciais (Ritvos et al., 1995).
No endométrio ocorrem importantes eventos como proliferação celular, citodiferenciação e apoptose durante o ciclo estral ou gestação, e segundo Shimasaki e colaboradores (2004), há crescentes evidências que apontam um papel para os membros da família BMP nesses processos. No útero de camundongos gestantes (4,5-7,0 dg), foram identificadas as expressões de Bmp2, 4, 7 e 8a sugerindo um papel durante a implantação embrionária, sendo a expressão de Bmp2 associada com o processo de decidualização (Ying & Zhao, 2000, Paria et al., 2001, Lee et al., 2007, Li et al., 2007a). Na fase secretória e gestação inicial de mulheres, BMP2 e BMP7 foram localizadas em células deciduais, e BMP7 também em células epiteliais, indicando a atuação dessas proteínas no processo de decidualização e remodelação tecidual para implantação embrionária (Stoikos et al., 2008).
Considerando a detecção das BMPs no endométrio gestante, supõe-se que este morfógeno pode estar diretamente relacionado com as transformações que ocorrem no útero gestante, em particular na região caruncular, na qual formam-se extensas áreas de projeções da mucosa que ancoram o córion para a formação do placentônio. A formação destas projeções da mucosa formando estruturas semelhantes a vilosidades poderia ser um fenômeno análogo ao da interação epitélio-mesênquima da organogênese intestinal que resulta na formação das vilosidades.
As proteínas WNT constituem outra importante família de moléculas de sinalização no desenvolvimento, as quais desempenham papéis vitais nos tecidos adultos, como por exemplo, regulação de proliferação e motilidade celular, determinação de polaridade e destino celular (Akiyama, 2000, Dale, 1998). A sinalização WNT promove uma ampla variedade de respostas dependentes (via canônica) e independentes (via não canônica) de β-catenina (Zhurinsky et al., 2000). A via de sinalização canônica resulta no acúmulo de β-catenina não fosforilada no citoplasma e núcleo, sendo que neste último local tem papel de co-ativador na estimulação da transcrição dos genes alvos de WNT (Alberts, 2004). Dentre as vias não-canônicas, a via de Polaridade Celular Planar (Planar Cell Polarity, PCP) ocorre através da ativação da via janus quinase (JNK), direcionando a organização assimétrica do citoesqueleto e polaridade celular. E por último, a via Wnt/Ca2+ que leva a liberação de cálcio intracelular mediado por proteínas G, envolvendo a ativação de proteína da Polipose Adenomatosa do Cólon (APC), proteína quinase
C (PKC) e proteína quinase dependente de calmodulina (CaMKII) (Fig. 3). Essa via está relacionada ao processo de ventralização em Xenopus e a regulação dos movimentos de extensão convergente na Drosófila (Huelsken & Birchmeier, 2001).
O complexo de receptor WNT que ativa a via canônica contem dois componentes: um membro da família Frizzeled (Fzd), receptores transmembrana sete passos, e outra proteína transmembrana LRP (Proteína relacionada ao receptor de lipoproteína, LRP5 ou LRP6). A ativação da via não-canônica é mediada pelos receptores Fzd, mas não está claro se isso também requer LRP5/LRP6 (Pinson et al., 2000, Kawano & Kipta, 2003).
Figura 3: Vias de sinalização WNT canônica e não-canônica. A via canônica somente será ativada se a proteína WNT se ligar ao receptor Fzd na presença do co-receptor LRP-5/6, isto é seguido pelo recrutamento da proteína Dishevelled (DVL). DVL é fosforilada por caseína quinaseε para formar um complexo com Frat 1 (não ilustrado na figura) e inibir a atividade de GSK-3β, determinando um acúmulo de β-catenina no citoplasma. Conseqüentemente, há translocação da β-catenina para o núcleo, formando complexos com fatores de transcrição, tais como LEF/TCF para a transcrição de genes alvo. A via não canônica tem duas cascatas de sinalização: a via WNT/Ca2+ e a via WNT/PCP. Na via WNT/Ca2+, a proteína WNT se liga ao receptor Fzd resultando em diversos processos celulares que envolvem proteínas G, aumentando a liberação de Ca2+ intracelular e diminuindo os níveis de cGMP levando a ativação de CamKII, CaCN e PKC. A ativação dessas vias pode estimular vários fatores de transcrição. Na via Wnt/PCP, após a ligação de WNT a Fzd ocorre a ativação de Rho/Rac e JNK que estão relacionadas à polaridade, movimentação celular e expressão gênica. Adaptada de Maiese et al. (2008).
Os Wnt da via não canônica (Wnt/Ca2+) Wnt5a e Wnt4 e da via canônica Wnt7
desempenham importantes funções no desenvolvimento pós-natal uterino. Experimentos de recombinação de tecidos mostraram que a expressão epitelial de Wnt7a e a expressão estromal de Wnt5a são necessárias para a formação de glândulas uterinas. A expressão estromal persistente de Wnt5a é necessária para a diferenciação do epitélio glandular, e ao mesmo tempo ocorre redução da expressão de Wnt7a no epitélio luminal que invagina para a formação das glândulas (Mericskay et al., 2004). Em ovinos neonatos, Hayashi & Spencer (2006) verificaram que o bloqueio da adenogênese, induzida por estrógeno, está associada com a redução ou ausência de Wnt2b, Wnt7a e Wnt11 e que, portanto, as vias canônicas (com β-catenina) e não canônicas de sinalização de WNT estão envolvidas no desenvolvimento uterino pós-natal e na adenogênese endometrial.
A expressão de Wnt5a já foi identificada no epitélio luminal e glandular do endométrio murino após tratamento com estradiol (Hou et al., 2004), no estroma endometrial humano em ambas as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual (Tulac et al., 2003). Durante a gestação, Sonderegger et al. (2007) identificaram a expressão de Wnt5a no trofoblasto viloso e extra-viloso no primeiro trimestre de gestação em mulheres, enquanto que em ovelhas, verificou-se abundante expressão de Wnt5a no estrato compacto entre 10-20 dg (Hayashi et al., 2007).
Além do útero, em outros órgãos como o intestino em desenvolvimento, ocorre alta expressão de Wnt5a e de Frizzeled 2 no mesênquima das vilosidades. No pulmão a super expressão de Wnt5a causa aumento da ramificação epitelial e da espessura do interstício pulmonar (Li et al., 2005). Estes achados indicam que esse fator é importante em interações epitélio-mesenquimais em outros órgãos.
A expressão de Wnt7a já foi constatada no epitélio luminal de ovelhas, camundongos e humanos, implicando a via WNT canônica de sinalização como um regulador conservado da função endometrial em mamíferos (Hayashi et al., 2007, Miller et al., 1998, Tulac et al., 2003,). Em ovelhas, já foi demonstrado que Wnt7a é um gene induzido por INF-τ no epitélio luminal (Kim et al., 2003) e pode atuar de uma maneira autócrina no endométrio, regulando a expressão de genes importantes para receptividade uterina e implantação como galectina 15 (LGALS15), catepsina L (CTSL) e cistatina 3 (CST3) (Spencer et al., 2007) ou através de uma ação parácrina no concepto para promover proliferação de células trofoblásticas mononucleadas ou diferenciação de células trofoblásticas binucleadas (Hayashi et al., 2007).
Outro Wnt da via canônica, o gene Wnt2 é expresso no estroma endometrial nos dias 18 e 20 de gestação e fraca expressão no trofoectoderma no dia 16 em ovelhas (Hayashi et al.,
2007). Este gene já foi identificado no estroma endometrial e/ou concepto de camundongos (Kemp et al., 2005) e mulheres (Pollheimer et al., 2006). Camundongos Wnt2-/- apresentam
sérios defeitos de placentação, notadamente na região do labirinto com a presença de edema e ruptura tecidual, assim como redução de vasos sanguíneos do alantóide (Monkley et al., 1996).
Na vida adulta, o útero contínua mantendo a característica de plasticidade que falta em muitos órgãos (Pavlova et al., 1994). Esta plasticidade é particularmente notória na projeção da mucosa uterina da carúncula durante a gestação, a qual requer contínua interação entre o epitélio e o estroma subjacente. Considerando os inúmeros relatos da presença de proteínas da família WNT no ambiente uterino e de que, as expressões das proteínas WNT podem determinar o destino de células epiteliais e estromais, falta estabelecer as possíveis correlações destas proteínas com a intrigante resposta da mucosa uterina caruncular durante a implantação embrionária de bovinos.
O papel das vias de sinalização WNT e BMP tem sido extensivamente investigado na regulação do desenvolvimento embrionário e controle da diferenciação e proliferação celulares em tecidos adultos (Lee et al., 2007). Interações genéticas entre essas vias foram observadas em várias espécies e órgãos (Hu & Rosenblum, 2005, Nakashima et al., 2005), havendo divergências de respostas dependente do órgão e do seu estado funcional.
Em camundongos, a deleção do gene Bmp2 causou uma desregulação da via de sinalização Wnt, sendo as expressões de Wnt4 e Wnt6 (Wnts da via não-canonica) abolidas no útero de animais seletivamente nocautes para Bmp2 em tecidos que expressam receptores de progesterona (Lee et al., 2007). Por conseguinte, para a análise e compreensão das expressões das proteínas BMP e WNT, é necessário avaliar simultaneamente a expressão e localização dos seus receptores e antagonistas.
1.4.2 – Antagonistas de BMP e WNT
Além da expressão tecido-específica de BMPs e de seus receptores de superfície celular, a sinalização BMP é regulada pelos seus antagonistas. Esses antagonistas funcionam por associação direta com as BMPs limitando, portanto, a sua ligação com os receptores. A interação entre BMPs e seus antagonistas regula diversos processos celulares (Yanagita, 2005).
Entre os antagonistas, Noggin se liga a BMP2 e BMP4 com alta afinidade e a BMP7 com baixa afinidade. Além de um função essencial no desenvolvimento esquelético (Brunet et al., 1998), NOGGIN está presente no mesênquima folicular neutralizando a ação inibitória do BMP4
na indução do folículo piloso (Botchkarev et al., 2001), no desenvolvimento prostático e de papilas linguais (Cook et al., 2007, Zhou et al., 2006). No útero de camundongos a expressão de Noggin foi identificada no estroma abaixo do epitélio luminal e na decídua próximo ao embrião nos dias 7 e 8 sobrepondo a expressão de Bmp2 (Paria et al., 2001).
Esclerotin, codificado pelo gene Sost, é outro antagonista de BMP abundantemente expresso em osso e cartilagem o qual se liga a BMP6 e BMP7 com alta afinidade e a BMP2 e BMP4 com baixa afinidade (Kusu et al., 2003), cuja expressão já foi identificada no rim humano e no coração de camundongos neonatos (Van Bezooijen et al., 2005). Esse antagonista é da mesma família do USAG-1 (uterine sensitization-associated gene-1) que é predominantemente expresso no útero de ratos pseudo-grávidos (Simmons & Kennedy, 2002), camundongos no período peri-implantacional (Maeda et al., 2007) e no rim em desenvolvimento (Yanagita et al., 2004).
Da mesma forma, a ação das proteínas WNT pode ser regulada por seus antagonistas que são divididos em duas classes funcionais: as proteínas relacionadas à Frizzeled secretadas (SFRPs) e os DICKKOPF (DKK). Membros da classe SFRPs, que incluem a família SFRP, WIF-1, Cerberus, se ligam diretamente as proteínas WNT, alterando a habilidade de ligação das mesmas ao complexo receptor e os membros da classe DKK inibem a sinalização WNT se ligando ao co-receptor LRP5/LRP6. Em teoria, as SFRPs podem inibir ambas as vias canônicas e não canônicas, enquanto que os DKK especificamente inibem a via canônica (Kawano & Kipta, 2003).
As SFRPs podem participar na regulação de gradientes morfogenéticos ou zonas de sinalização Wnt, o que poderia contribuir para especificar destinos celulares e demarcar limites teciduais (Jones & Jomary, 2002). De acordo com Kawano & Kipta (2003) o papel primário das SFRPs seria transportar as proteínas WNT para áreas de alta concentração de receptores, onde poderiam ser liberados como ligantes ativos, agindo como antagonistas nos locais de baixa disponibilidade de receptores. As SFRPs, assim como as proteínas WNT, podem estar envolvidas na proliferação e diferenciação, ou apoptose de tecidos adultos (Abu-Jawdeh et al., 1999, Susuki et al., 2002).
O DKK1 também pode se ligar a duas proteínas transmembrana KREMEN (Krn)1 e 2. Nas células de mamíferos, Krn1 ou Krn2 podem cooperar com DKK1 na inibição do complexo WNT-Fz-LRP6. Krn, DKK1 e LRP6 formam um complexo ternário que interrompe a sinalização WNT/LRP6 promovendo endocitose e remoção do co-receptor da membrana plasmática (Mao et al, 2002). A expressão de Dkk1 pode se sobrepor com locais de morte celular programada durante o desenvolvimento dos membros e a perda da expressão de Dkk1 resulta na fusão de
dígitos e formação de dígitos ectópicos (Mukhopadhyay et al., 2001). Ainda não foi determinado se a inibição da via WNT canônica mediada por DKK1 é necessária para indução de apoptose, no entanto, o promotor de Dkk1 contem elementos responsivos a p53 e a expressão de Dkk1 é induzida por p53 (Wang et al., 2000).
A expressão de Dkk1 foi observada em células estromais durante a fase secretora do ciclo menstrual em humanos (Tulac et al., 2003), sendo a sua expressão regulada pela progesterona (Tulac et al., 2006). Por sua vez, Pollheimer e colaboradores (2006) verificaram que o DKK1 reduziu a migração, invasão e proliferação do citotrofoblasto in vitro. Porém, a função exata do DKK1 ainda especulativa é de que atue de forma parácrina para regular a sinalização Wnt ou até mesmo possua uma ação independente de WNT (Tulac et al.,2006).
Em camundongos, o acúmulo de Dkk1 no estroma uterino durante a gestação, pseudogestação e implantação tardia sugere a regulação da proliferação e diferenciação das células do estroma durante a janela de implantação (Li et al., 2007b). Em ovelhas, verificou-se a expressão de Dkk1 no estroma endometrial (estrato compacto), com maior abundância no período de 18-20 dg (Hayashi et al., 2007), e também maior expressão no endométrio bovino no 18º dg (Bauersachs et al., 2006). Esses trabalhos indicam que Dkk1 pode ser um importante regulador da função endometrial durante a gestação.
1.5 – Considerações finais
As alterações morfológicas descritas para o endométrio de bovinos nas fases iniciais da gestação, do período peri-implantacional à consolidação da placenta com a formação dos placentônios, assemelham-se a morfogênese de vários órgãos fetais envolvendo a interação epitélio-mesênquima. Portanto, o estabelecimento de correlações temporais e espaciais entre os eventos morfológicos envolvidos com a implantação embrionária e formação da placenta, com os mecanismos que regulam a interação epitélio-estroma, poderá contribuir na melhor compreensão dos fenômenos regulatórios da receptividade uterina e trazer novas informações sobre as razões da alta incidência de perdas gestacionais no período de implantação embrionária em bovinos.
Neste sentido, o útero do animal adulto é um órgão ímpar que mantêm ativos alguns dos mecanismos típicos dos processos de desenvolvimento e organogênese fetal, e, portanto, investigar as variações de expressão de morfógenos como os da família BMP e WNT e seus antagonistas neste ambiente torna-se importante para a plena compreensão da biologia da reprodução destes animais.
2 - Objetivos
2.1 - Objetivo geral
Identificar a dinâmica das modificações morfológicas do endométrio das regiões carunculares e intercarunculares durante a implantação embrionária e formação do placentônio relacionadas com a expressão dos genes Bmp e Wnt e seus antagonistas.
2.2 - Objetivos específicos
1. Análise histológica das modificações da região caruncular (CAR) e intercaruncular (IC) do útero não gestante e gestante durante os períodos da implantação embrionária e formação do placentônio.
2. Avaliação da atividade proliferativa das células epiteliais e do estroma subepitelial da região CAR e IC do útero não gestante e gestante durante os períodos da implantação embrionária e formação do placentônio.
3. Avaliação semi-quantitativa por RT-PCR (Reação em Cadeia de Polimerase Via Transcriptase Reversa) das expressões dos genes Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, Bmp2,
Noggin e Sostdc1, em amostras das regiões CAR e IC do útero não-gestante e gestante
durante os períodos da implantação embrionária e formação do placentônio.
3. Localização através de hibridização in situ e quantificação da expressão dos genes Wnt5a,
Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, Bmp2, Bmpr1a, Bmpr2 e Sostdc1, nas regiões CAR e IC do útero
não-gestante e não-gestante durante os períodos da implantação embrionária e formação do placentônio.
3 - Materiais e Métodos
3.1- Animais
Foram utilizadas fêmeas bovinas (Bos spp) com idade indefinida e sem controle prévio da fase do ciclo estral e/ou da gestação, abatidas em frigoríficos comerciais na cidade de Piracicaba-SP. Incisões longitudinais foram realizadas na face antimesometrial da parede dos cornos uterinos de animais recém-abatidos até atingir a luz uterina para realização de uma inspeção macroscópica inicial da superfície endometrial investigando-se a presença de conceptos e descartando-se os animais que apresentavam sinais de infecção uterina.
Constatada a presença de conceptos, procurou-se manter a membrana coriônica aderida ao endométrio, e os embriões/fetos foram retirados rompendo-se o córion-alantóide somente no local da vesícula embrionária. Os fragmentos das regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC) foram congelados em nitrogênio liquido ou imersos em solução fixadora.
Foram coletados no total 265 fragmentos de quarenta e sete (47) úteros gestantes (Tabela 1) e oito (08) úteros de animais não gestantes com os respectivos ovários para selecionar aqueles em fase lútea do ciclo estral após análise macroscópica e histológica do corpo lúteo de acordo com Myamoto et al. (2000) e Donaldson & Hansel (1965). De alguns fetos foram coletados fragmentos de coração, pulmão, intestino, testículo, rim, estômago, congelados e mantidos em nitrogênio líquido.
3.1.1 – Estimativa da idade gestacional
O período gestacional de cada um dos animais foi estimado através do CR (crow-rump) dos embriões que consiste na mensuração da distância occípto-sacral da cabeça, tomando como referência a crista nucal numa extremidade e a última vértebra sacral na extremidade oposta, de acordo com Evans & Sack (1973). Para os embriões em fases mais precoces (até 40 dias), as medidas foram obtidas no microscópio estereomicroscópico e os parâmetros relativos ao desenvolvimento externo também foram analisados de acordo com Evans & Sack (1973) e Alberto (2006).
3.2 - Processamento dos materiais
3.2.1 - Processamento e análise histológica
Os fragmentos das regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC) do corno uterino ipsilateral ao ovário foram fixados por imersão na solução fixadora de paraformaldeído 4% em tampão fosfato-salina (PBS) 0,1 M, pH 7,4, durante 24 horas a 4° C. Devido à fragilidade da adesão do córion ao endométrio, na fase inicial de gestação (até 30 dias), os fragmentos foram envolvidos com um tecido sintético poroso (entretela) para imobilizar os fragmentos no interior dos recipientes (kassets, Leica) para histoprocessamento. Após a fixação, foram lavados com PBS 0,1 M, pH 7,4 e água destilada, desidratados em gradiente crescente de etanol, diafanizados em xilol. A entretela foi removida e seguiu-se a embebição em parafina com plastificante (Histosec, Merck).
Cortes com 5 μm de espessura foram obtidos em micrótomo rotativo e coletados em lâminas previamente silanizadas. Para avaliação da preservação do material e da adequação das áreas de interesse, os cortes foram corados com Hematoxilina e Eosina (H.E) para análise histológica prévia no microscópio Eclipse 800 (Nikon, Japão) acoplado com sistema de captura de imagem (CoolSnap, USA) e o programa captura e de análise de imagem ImageProPlus (Media Cybernetic, USA).
Análises histológicas foram realizadas no conjunto de amostras, das regiões CAR e IC, dos úteros cujos embriões possuíam idade gestacional estimada em até 60 dias, para o estabelecimento das seqüências das principais modificações da histoarquitetura endometrial, as quais foram adotadas como critérios morfológicos primários para se constituir os grupos em estágios gestacionais.
3.2.2 - Estabelecimento dos estágios gestacionais
As amostras uterinas com os dias de gestação (dg) estimados pelo CR dos embriões foram agrupadas de acordo com os critérios estabelecidos pela análise histológica em:
Grupo NG: Não gestante na fase luteal Grupo P1: período de 20 a 26 dg Grupo P2: período de 28 a 33 dg Grupo P3: período de 35 a 40 dg Grupo P4: período de 50 a 60 dg
3.2.3 - Homogenado tecidual para obtenção do RNA e confecção do cDNA
Para homogenado tecidual, três a cinco fragmentos das regiões CAR e IC do endométrio de todos os grupos experimentais e órgãos fetais, congelados em nitrogênio líquido, foram separadamente homogenizados com 1,5 µl de reagente Trizol (Quiagen, USA) em homogenizador rotativo (Glas-Col) por 1 minuto em banho de gelo, a baixa rotação. Em seguida os fragmentos homogeneizados foram transferidos para um tubo de 1,5ml livre de RNAse e DNAse e incubados à temperatura ambiente (TA) por 5 minutos para permitir a completa dissociação dos complexos nucleoprotéicos.
Para cada 300μL do homogenado adicionou-se 200 μL de clorofórmio (JT Baker) e homogeneizado em Vortex durante 30 seg. Após 3 min de repouso em TA, foram centrifugadas por 15 min a 12.000g a 4oC. A fase aquosa foi transferida para um tubo de 1,5mL. À fase
aquosa acrescentou-se 1 ml de álcool isopropílico (J.T.Baker), e após homogeneização suave, as amostras foram mantidas em repouso por 12 h a -20oC. As amostras foram então novamente centrifugadas a 12000g, 10 minutos, 4º C e os sedimentos lavados com gradiente crescente de etanol (JT Baker, 70% e 100%) através de centrifugação à 7500g, 10 minutos e 4º C e secos à temperatura ambiente (aproximadamente 15 minutos). Os sedimentos foram dissolvidos em 50μl de água DEPC (dietil pirocarbonato, Sigma), aliquotados e mantidos congeladas a –70o C
até o momento do uso.
O RNA total obtido foi quantificado por espectofotometria (NanoDrop-100 Spectrophotometer), através da relação da densidade óptica nos comprimentos de onda de 260nm e 280 nm. A solução de RNA foi ajustada na concentração de 2μg/μl em H20/DEPC.
Para verificar a integridade do RNA obtido, 2 μl de cada amostra foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%. Após a avaliação da integridade do RNA, foram escolhidas as melhores amostras de cada animal, sendo feitos um “pool” de 3 amostras da CAR e outro de 3 amostras da IC e nova quantificação por espectofotometria.
A partir de 2μg de cada “pool” de RNA total, das regiões CAR e IC, de cada animal, foram obtidos os cDNA utilizando-se o Kit RevertAidTM H Minus First Srand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) adotando-se os procedimentos recomendados nas instruções do fabricante. Foi realizada também a síntese de cDNA a partir de 2μg de RNA total de pulmão, intestino, coração e rim fetais para serem utilizados como controle positivo da expressão dos genes em estudo.
3.3 - Imunocitoquímica com anti-PCNA
Cortes em parafina das regiões CAR e IC do endométrio de 3 animais dos grupos NG e P1-P4 foram desparafinizados, hidratados e tratados em tampão citrato pH 6,0, com um ciclo de 3 minutos e um de 2 minutos no microondas. O procedimento de imunoperoxidade consistiu em: inibição da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 3 % em Metanol por 10 minutos, bloqueio dos sítios inespecíficos com leite desnatado a 5% em PBS 0,05M pH 7,4 durante 1 hora, incubação com o anticorpo primário policlonal anti-PCNA humano (Bethyl Laboratories Inc.) feito em coelho diluído em PBS 0,1 M - 1:300 overnight a 4o C em câmara
úmida. Lavagem com PBS 0,05M pH 7,4, incubação com o anticorpo secundário policlonal biotinado anti-coelho feito em cabra (Dako, USA) na diluição de 1:600 durante uma 1 hora em temperatura ambiente. Após incubação com complexo estreptoavidina-peroxidase (Dako Corporation) em TBS 0,05M na proporção de 1:100 por 45 minutos, a reação foi revelada com diaminobenzidina (Sigma, USA) 0,5mg/ml e peróxido de hidrogênio 1% em TBS 0,05M.
Os cortes foram contra-corados com Verde de Metila (Merck) pH 4,4 e montados em bálsamo sintético (Entellan, Merck). Posteriormente, foram observados no microscópio Eclipse 800 (Nikon, Japão), documentados com sistema de captura de imagem (CoolSnap, USA) e o programa de análise de imagem ImageProPlus (Media Cyabernetic, USA). Em cada corte, seis campos aleatórios abrangendo epitélio luminal (E) e estrato subepitelial (ES) para a CAR e epitélio luminal (E) e estrato compacto (EC) para a IC foram obtidos com a objetiva de 40 e os núcleos PCNA-positivos quantificados adotando-se a seguinte classificação: (-) reação negativa, (+) até 25% dos núcleos com reação positiva, (++) de 25-50% dos núcleos com reação positiva, (+++) acima de 50% dos núcleos com reação positiva.
3.4 - RT-PCR semi-quantitativo
3.4.1 - Confecção dos “Primers”
Foi realizado RT-PCR semi-quantitativo para os seguintes genes: Wnt4, Wnt2, Wnt5a,
Wnt7a, Sfrp2, Dkk1, Bmp2, Noggin, Sostdc1 e Gapdh como gene endógeno, cujas seqüências
dos pares de primers sense e antisense adotados estão listados na Tabela 2. Os primers de
Wnt2, Wnt4, Sfrp2, Sostdc1 e Gapdh foram desenhados com base em seqüências bovinas
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os primers de Wnt5a, Wnt7a, Dkk1 foram desenhados com base em seqüências de humanos e Bmp2, Noggin em seqüências de bovinos comparadas com seqüências EST bovinas utilizando o programa de alinhamento computacional BLAT (http://genome.brc.mcw.edu/cgi-bin/hgBlat), escolhendo aquelas com alto grau de homologia e de preferência de órgãos como o útero e a placenta.
Utilizou-se o programa Primer 3 para desenhar os primers, sendo as principais características consideradas: quantidade de CG entre 45 e 65%, não formação de dímeros, ou estrutura secundária e temperatura de anelamento (Tm, melting temperature) entre 58 e 60oC
de acordo com o algorítimo nearest neighbor (Breslauer et al., 1986). Além disso, a fim de evitar uma eventual co-amplificação de DNA genômico contaminante, a maior parte dos pares de
primer foi desenhada em exons diferentes. Para confirmar se estes eram específicos para o
gene alvo, consultas foram verificados no Gene Bank do NCBI e/ou UCSC Genome Bioinformatics Site (http://genome.ucsc.edu/) utilizando o programa de alinhamento computacional BLAST e BLAT, respectivamente. As seqüências dos primers foram confeccionadas pelas empresas Imprint do Brasil e Sinapse Biotecnologia.
3.4.2 - Amplificação dos transcritos - PCR
Foram realizadas reações de PCR das amostras de cDNA obtidos das regiões CAR e IC dos grupo NG e P1-P4. Nos testes iniciais de padronização dos primers, os cDNA de pulmão, intestino, coração e rim fetais foram utilizados como controle positivo.
Utilizou-se o Kit Taq-DNA polimerase (Fermentas, USA) conforme recomendação do fabricante, com protocolo ajustado para 1,5mM de MgCl2, 0,2mM de dNTP, 3 pmol/ul dos primer sense e anti-sense, 1 μl da enzima Taq Polimerase e 1,0 μl cDNA no volume final de.10μL para cada reação, utilizando o termociclador DNA Engine Tetrad/PTC-225-Peltier Thermol Cycler. Os programas com o número de ciclos e temperatura para cada gene foram estabelecidos após padronização da curva de ciclagem de cada primer (Tabela 3), e adotados as condições arbitrárias correspondentes a 75% do platô.
Para cada um dos genes foram realizadas triplicatas do PCR de amostras das regiões CAR e IC provenientes de animais de cada um dos grupos. As análises dos produtos de reação de PCR foram realizadas através da eletroforese em gel de agarose 1% e 1,5% corados com EtBr (brometo de etídio, 0,5μg/mL) para os transcritos ≥250pb e ≤249pb, respectivamente. Alíquotas de 3μL do produto de PCR e 0,5μL de Loading buffer foram aplicadas e as corridas
realizadas no aparelho de eletroforese (Bioraid Laboratories) a 75 volts. Utilizou-se 6μL de marcador γ-Hind III (1mg/12μL) ou 2μL de Track100bp DNA ladder (Invitrogen) como referência para o peso molecular.
3.4.3 - Quantificação do produto de PCR
A captura de imagem digital dos géis de agarose foi realizada com o fotodocumentador GelDoc (BioRad Laboratories) e o programa Quantity One V. 4.4.1 (BioRad Laboratories). Para avaliar comparativamente as intensidades de expressões dos genes em estudo, os valores de pixel total (PT) das bandas foram obtidos utilizando-se o programa Un-Scan-It Gel Version 6.1 (Silk Scientific Corporation).
Para cálculo dos valores relativos, os valores de PT de cada gene foram divididos pelo PT correspondente do Gapdh adotado como gene de controle interno. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística ANOVA seguida pelo Teste de Tukey para avaliar as possíveis significâncias das diferenças entre as médias das amostras de cada uma das regiões (CAR e IC, separadamente) entre os grupos NG e P1-P4, e o teste Mann-Whitney para a comparação entre as médias de CAR e IC em cada um dos grupos, com intervalo de confiança de 95% para ambos os testes.
3.5 - Procedimentos para construção das sondas de RNA para Hibridização in situ
A relação dos genes investigados através da hibridização in situ encontra-se na tabela 4 e as sondas de RNA utilizadas foram geradas a partir de DNA ou cDNA conforme os protocolos adotados pelo Laboratório de Biologia Uterina e Gestação, Texas A&M University.
3.5.1 - Obtenção de DNA ou cDNA
Os DNA dos genes Wnt5a, Wnt7a, Dkk1 e Sfrp2 foram disponibilizados pelo Laboratório de Biologia Uterina e Gestação, Texas A&M University. Os DNA dos genes, Bmp2 e Sostdc1 foram obtidos a partir de clones bovinos comerciais (Open Biosystems, USA), disponíveis pelo Consórcio The Image (http://image.llnl.gov/).
Os cDNA de Bmpr1a e Bmpr2 foram obtidos a partir de RNA total isolado de placentônio ovino no 80º dg conforme descrito em 3.2.3 sendo realizado o tratamento com DNAse
