40µg/Kg de HPβCD/Ang-(1-7) diariamente durante as 6 semanas finais da dieta; O delineamento experimental é esquematicamente representado a seguir:
Figura 03: Delineamento experimental
3.5) Descrição dos Procedimentos Experimentais
3.5.1) Glicemia de Jejum e Teste de Tolerância Oral à Glicose na 7ª Semana das Dietas
Em um pequeno grupo de 6-7 animais realizou-se a dosagem da glicemia de jejum de 10 a 12 horas e o teste de tolerância oral a glicose a partir da coleta de amostras de sangue da cauda do animal na 7ª semana das dietas, antes do início dos tratamentos. Os ratos foram submetidos ao jejum noturno de 12 horas. No dia seguinte foi preparada uma solução de glicose 40%, que foi administrada via gavagem para os animais acordados na dosagem de 1g/kg. As amostras de sangue foram retiradas da
4 semanas Gestação Ratos jovens (40-60g) (LABNEX/UFOP) (CCA/UFOP) Dieta AIN-93M (CT) ou Dieta Hiperlipídica (SM) Dieta s 7 semanas 6 semanas 13 semanas Biométricas Bioquímicas ELISA qRT-PCR Tratamento HPβCD/Ang-(1-7) (40μg/Kg) ou HPβCD vazia Glicemia de Jejum e Teste de tolerância oral a glicose (40%)
45 cauda dos animais antes e aos tempos 10, 20, 30, 60, e 90 minutos após administração oral da solução de glicose de acordo com realizado por Song e colaboradores (Song et al., 2004). Os valores de glicose foram obtidos a partir da colocação da gota de sangue da cauda dos animais em fitas do glicosímetro do tipo Accu-chek active.
3.5.2) Avaliação do Peso dos Animais, do Índice de Lee, do Índice de Adiposidade e dos Pesos dos Órgãos.
Ao final das treze semanas das dietas e seis semanas dos tratamentos os animais foram pesados e foram realizadas as medidas do comprimento naso-anal mensuradas para cálculo do Índice de Lee (Bernardis e Patterson, 1968), indicado pela equação: [peso corporal (g)1/3 /comprimento naso-anal (cm) x 1000] (Lee e cols, 1929) (Moraes- Silva et al., 2013). Após a eutanásia dos animais fígado, rins, ventrículo esquerdo, músculos sóleo e gastrocnêmico, depósitos de tecido adiposo inguinal, retroperitoneal e epididimal e TAM tiveram seus pesos úmidos relativos (g/ 100g do rato) registrados.
Para avaliação do aumento dos depósitos corporais de gordura em ratos, utilizou-se o índice de adiposidade, que engloba os pesos dos TAB retroperitoneal, inguinal e epididimal a partir da seguinte fórmula [(Peso absoluto (g) dos depósitos de gordura inguinal + retroperitoneal + epididimal) / peso do rato (g)] x 100 (Cox, Laughton e Powley, 1985; Levin, 1992), que apresenta boa correlação com os distúrbios metabólicos da SM (Cox, Laughton e Powley, 1985). Amostras do fígado, do músculo gastrocnêmico, do TAV retroperitoneal e do TAM foram guardados em freezer -80ºC para realização das expressões gênicas por qRT-PCR.
3.5.3) Análises Bioquímicas
Ao final das treze semanas das dietas e seis semanas dos tratamentos, os animais foram submetidos ao jejum noturno e tiveram amostras de sangue (2 a 3ml) coletadas, após a eutanásia. Em seguida, essas amostras foram centrifugadas (4000 rpm; 4ºC; 6 min) para a separação do plasma para dosagem da glicose de jejum (sangue tratado com anticoagulante Glistab; EDTA e fluoreto de potássio) ou soro para dosagens de colesterol total, VLDL, LDL, triglicérides, amilase, proteínas totais, albumina, globulina, creatinina, ureia e das transaminases alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). Plasma e soro foram aliquotados e guardados a – 80ºC, para realização das análises bioquímicas. As análises foram realizadas através kits comerciais individuais (Labtest, Lagoa Santa – MG, Brasil) pelo Laboratório Piloto de
46 Análises Clínicas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto (LAPAC/UFOP).
3.5.4) Dosagem da Insulina por ELISA
Os níveis de insulina foram determinados pelo método de imunoensaio do tipo Elisa sanduíche utilizando o Kit Ultra sensitive Rat insulin Elisa Kit (Crystal Chem, Downers Grove, IL., USA). O princípio desta dosagem e o protocolo estão descritos detalhadamente no anexo III.
3.5.5) Cálculo HOMA IR e HOMA β
As variáveis que estimam a resistência à insulina utilizadas no presente estudo foram calculadas a partir das seguintes formulas:
HOMA-IR - modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina HOMA-IR = (IJ x GJ)/ 22,5
HOMA-β - Modelo de avaliação da homeostase da capacidade funcional das células β HOMA-β = (20 x IJ) / (GJ – 3,5)
IJ = insulinemia de jejum em mU/L
GJ = glicemia de jejum em mmol/L (Matthews et al., 1985)
3.5.6) Análise da expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qRT-PCR)
Oligonucleotídeos Iniciadores (primers)
Os primers específicos para os genes em estudo foram baseados na sequência de mRNA depositados no banco de dados RGD (Rat Genome Database) disponível em http: // rgd.mcw.edu/ e foram idealizados pelo programa Gene Runner (version 3.05) conforme tabela II abaixo:
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Primers Forward (5’-3’) Reverse (5’-3’)
rRNA18s GTAAGTGCGGGTCATAAG CCATCCAATCGGTAGTAGC
IR CCTTGGATCGTTCCTCTCAC GGTCCGTTTGATGCTCAGAG
IRS-1 TGAGAGCGGTGGTGGTAAGC GGGCTGCTGGTGTTGGAATC
IRS-2 GCAGGACTTTCCCAGTGAACG GCCACACCACATTCGCATG
AKT-2 GGAGGTCATGGAGCATCGGTTC GTTTGAAGGGTGGCAGGAGC
GLUT-4 GGTGCCTTGGGAACACTCAAC TGCAGGAGAGCAGGGAGTACTG
PPARγ2 CGTGAAGCCCATCGAGGACATC TCTGGAGCACCTTGGCGAACAG
Leptina GAACCTGTGAGGATGAGTG CACTGGCTGACAGAACTATG
Resistina CCAGAAGGCACAACCGTCAC CCGCTGTCCAGTCTATGCTTCC
Adpisina AGAGCAACCGCAGGGACACTTG CCACGTAACCACAGCTTCGACC
TNF-α GTGTCTGTGCCTCAGCCTCTTC CCTCCTTGTTGGGACCGATC
COX-2 ATCTGGCTTCGGGAGCACAAC TGGAACAGTCGCTCGTCATCC
Adiponectina GCCGTTCTCTTCACCTACGACC GGTCTCCCACCTCCAGATGG
PGC-1α CCAAACAGCCGTAGACTG GCACAACTCAGCAAGTCCTC
PGC-1β TGAGGAGGTGGGAGAGGATTG TGGGAACTTGGGCACTGTTG
UCP-1 CAAAGTCCGCCTTCAGATC TGGTGATGGTCCCTAAGAC
UCP-2 CTGGCGGTGGTCGGAGATAC GGGCAACATTGGGAGAGGTC
UCP-3 CCCAAAGGAACGGACCACTC GGGTTGAGCACAGGTCACTG
Tabela II: Primers utilizados (Forward e Reverse) Extração de RNA Total
A extração do RNA total foi realizada a partir de 150 mg de tecido adiposo retroperitoneal e 100 mg de TAM e músculo gastrocnêmico através do kit SV Total Isolation System (PromegaTM) seguindo a recomendação do fabricante. Amostras de TAB retroperitoneal, musculo gastrocnêmico e TAM foram homogeneizados com auxílio de um homogeneizador tipo Politron (Homogeneizador Ultra 80) com 1 mL de trizol® Reagent (InvitrogenTM) em 5 pulsos de 30 segundos com intervalo de 40 segundos no gelo. Depois de incubados a temperatura ambiente por 10 minutos, 400 µl de clorofórmio (Sigma ST. Louis, MO, USA) foram adicionados às amostras e homogeneizado por 1 minuto com auxílio de um vórtex, seguido de uma incubação de 25 minutos a temperatura ambiente.
48 Em seguida, os homogenatos foram centrifugados por 15 minutos a 12.000 x g (~ 11.000 rpm; 4ºC). A fase aquosa foi transferida para um novo tubo tipo eppendorf e foram adicionados 600 µl de etanol 95% (Sigma ST. Louis, MO, USA) preparado com H2O livre de RNAses para precipitar os ácidos nucléicos, que foram transferidos para a coluna de ligação que acompanha o kit. Em seguida, o RNA foi purificado com o kit SV Total Isolation System (PromegaTM) conforme instrução do fabricante. O controle de qualidade do RNA foi realizado a partir da quantificação e avaliação do grau de pureza e integridade pelo aparelho Nanovoue® (GE). A densidade óptica (quantificação) do RNA extraído foi mensurada no comprimento de onda a 260 nm, enquanto a relação entre os comprimentos de onda 260/280 foi indicativa de pureza e a relação 260/230 indicativa de contaminação. As razões acima de 1,8 foram aceitas como adequadas para quantificação da expressão gênica (Manchester, 1996; Gallagher e cols, 2006; Becker e cols, 2010). A análise final da presença e integridade do RNA das amostras era confirmada através do gel de agarose (1,2%) TBE/Formamida (anexo IV).
Síntese de cDNA
A primeira fita do cDNA foi sintetizada utilizando 1 µg de RNA total extraído e o kit High Capacity RT-PCR System (Applied Biosystems) seguindo a recomendação do fabricante. Para cada 1 µg de RNA total foram utilizados 2 µL de primers randômicos (10 x RT Buffer), 0,8 de dNTPs [25x dNTP mix (100 µM)], 1 µL de transcriptase reversa (Multi scribe reverse transcriptase) e H2O livre de RNAse para um volume final de 10 µL. Essa preparação foi adicionada ao RNA (1µg) e mantida no gelo até a programação do termociclador (Biocycler, version 3.2). A mistura foi incubada a 25ºC por 10 minutos, seguidos de 120 minutos a temperatura de 37ºC, 85ºC por 5 minutos e finalmente 4ºC por tempo indeterminado. Posteriormente, estocaram-se as amostras em freezer a – 80ºC.
Expressão Gênica por qRT- PCR
Para análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). As reações foram realizadas pelo kit SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) em placas de 96 poços (MicroAmp® Optical 96 Well Reaction Plate- Applied Biosystems) e seladas com adesivo óptico (MicroAmp® Optical Adhesive Film - Applied Biosystems). A seguir foram pipetados 3µL de primer liofilizado (na concentração de 2,5 µM) e 7 µL de mix de reação (contendo 2µL de
49 cDNA diluído 10 vezes com água livre de DNAse e 5µL de SYBR® Green PCR Master Mix) totalizando um volume de 10 µL de reação em cada poço. Os ensaios foram realizados em triplicata biológica para todos os genes avaliados, com o gene de referência rRNA 18S, chamado normalizador, que foi escolhido entre outros 11 genes constitutivos endógenos para cada tecido. O rRNA 18S foi escolhido por apresentar menor variação entre as amostras de diferentes grupos experimentais, por não formar dímeros com si próprio, por apresentar um pico de ativação na curva de dissociação anterior a 80ºC e por apresentar eficiência entre 80% e 120% de acordo com os critérios descritos mais a frente. O gene normalizador estava presente em todas as placas e os outros genes alvo eram sempre comparados a ele. Os valores de baseline foram ajustados para 3-15 ciclos. O threshold foi ajustado à região associada ao crescimento exponencial do produto da PCR e, portanto, fixado em 0,2 para todas as amostras, uma vez que se comparou o mesmo gene em diferentes grupos.
As análises foram feitas pelo método de quantificação absoluta da expressão gênica (Cq comparativo, 2-ΔCq) que permite quantificar diferenças no nível de expressão de um alvo específico entre as amostras. Os níveis de expressão dos genes foram normalizados pelos níveis do gene de referência (rRNA 18S) em cada placa. Os resultados foram alcançados por uma fórmula aritmética que considera a quantidade do gene alvo, normalizado para o gene calibrador, dada por 2-ΔCq. A reação de qRT-PCR foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7300 Applied Biosystems.
Curva de Eficiência e Amplificação dos Primers
Para determinar as eficiências da amplificação dos genes alvos e do gene de referência foram construídas curvas padrões para cada amplicon a partir de uma mesma amostra. O ensaio foi realizado em triplicata. A curva padrão foi representada por um gráfico de regressão linear semi-log do valor de Cq (eixo Y) em comparação ao log da quantidade inicial do ácido nucléico (eixo X). O slope da curva padrão foi usado para estimar a eficiência de amplificação. Uma reação 100% eficiente produzirá um aumento de 10 vezes no amplicon da PCR a cada 3,32 ciclos durante a fase exponencial de amplificação (log2 10 = 3,3219), ou seja, o amplicon dobra em quantidade durante a fase geométrica. O cálculo da estimativa da eficiência (E) foi obtido pela fórmula E = (10-1/slope – 1) x 100. Os primers foram considerados apropriados para avaliar a
50 expressão gênica pelo SYBR® Green quando apresentaram eficiência de reação acima de 80% e abaixo de 120%.