SOLUÇÕES OSM

FRU SAC CIT CLO FCIT X± s

50 74,40±13,01 79,70±15,35A _{79,80±9,99 78,30±14,25 78,40±11,07 78,12±12,51}A 100 77,70±10,84 73,50±16,56A _{81,70±7,11 78,10±15,17 79,40±6,00 78,08±11,73}A 150 72,30±13,77 77,70±11,32A _{79,40±8,56 80,10±12,98 78,00±11,99 77,50±11,70}A 200 73,60±15,17a _52,60±18,22bB _74,10±6,4a _75,30±8,94a _75,70±11,06a _70,26±15,10B

X± s 74,50±12,93 70,88±18,52 78,75±8,32 77,95±12,66 77,87±9,99 75,99±13,16 X= média; s = desvio-padrão; OSM = osmolaridade em mOsmol/Kg H2O; FRU = frutose; SAC = sacarose; CIT = citrato de sódio; CLO = cloreto de sódio; FCIT = frutose-citrato de sódio

ab

Letras diferentes na mesma linha (P<0,05) AB

Letras diferentes na mesma coluna (P<0,05)

Assim, como neste experimento, MELO e HENRY (1999), no sêmen eqüino, e FONSECA et al. (2001), no sêmen caprino congelado, observaram a maior facilidade (P>0,05), com que a osmolaridade de 100mOsmol/Kg H2O promove a reação hiposmótica. Entretanto, essa

facilidade, diverge das observações de VAZQUEZ et al. (1997), no sêmen suíno, e de FONSECA et al. (2005), no sêmen caprino, onde a osmolaridade de 150mOsmol/Kg H2O e

125mOsmol/Kg H2O, respectivamente, proporcionaram maiores médias de reação (P>0,05),

quando comparada à de 100mOsmol/Kg H2O. O espermatozóide canino (RODRÍGUEZ-GIL

et al., 1994) também apresentou maiores médias de reação ao HOST, conforme esses autores, quando incubado em soluções com osmolaridade variando entre 100 e 150mOsmol/Kg H2O.

Aplicando o HOST no sêmen ovino, OBERST et al. (2003), também não observaram diferença estatística entre soluções a 100 e 150mOsmol/Kg H2O.

Com a ausência de diferença estatística entre as soluções, excluindo sacarose a 200mOsmol/Kg H2O, comparou-se os tipos de alterações hiposmóticas e sua localização na

cauda do espermatozóide. Para isso as soluções foram blocadas e tentando um maior detalhamento, as alterações de peça principal (PP) e peça terminal (PT) foram separadas das de CG. Com isso, as alterações denominadas de cauda fortemente dobrada e de cauda fortemente enrolada foram agrupadas em CG (Fig. 3.1), ressaltando que, para esta análise, foram utilizados os valores totais observados durante a leitura das alterações hiposmóticas, isto é, sem a aplicação da fórmula proposta por MELO e HENRY (1999).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 50 100 150 200 % PI PP PT CG

Figura 3.1 Porcentagem de alterações observadas no teste hiposmótico conforme região da cauda do espermatozóide caprino nas diferentes osmolaridades.

PI = peça intermediária; PP = peça principal; PT = peça terminal; CG = cauda geral;

MELO e HENRY (1999) observaram que as alterações hiposmóticas no espermatozóide eqüino, se concentraram nas classificadas como CG, que neste caso específico incluía as alterações de PP e PT. Embora no presente experimento essas alterações tenham sido separadas, pode-se concluir que há uma incidência maior de ocorrência das alterações hiposmóticas fora do sítio da peça intermediária. Em outro experimento, MELO et al. (2005) observaram que as alterações, aqui classificadas como CG, representam entre 24 e 77% do total de reações hiposmóticas apresentadas pelo espermatozóide eqüino. Já FONSECA et al. (2005) observaram que essas alterações variaram de 19 a 52% no espermatozóide caprino. No presente experimento, essas alterações variaram de 14,1 a 83,3%, considerando todos os tratamentos.

Embora as média gerais das reações hiposmóticas, tenham se mostrado semelhantes (P>0,05), entre as osmolaridade de 50mOsmol/Kg H2O (78,12%), quando comparada às

médias das osmolaridades de 100 e 150mOsmol/Kg H2O, que foram de 78,08% e 77,5%,

respectivamente, escolheu-se a osmolaridade de 50mOsmol/Kg H2O, para a Etapa II, pela

maior facilidade em observar as alterações de CG na microscopia óptica de contraste de fase, mesmo em aumentos menores (400x), e pela menor incidência de alterações de PT, estas de difícil observação em aumentos menores que 1.000 vezes (MELO, 1999).

3.3.3 Avaliação da solução e tempo de incubação

Os percentuais de reação hiposmótica do espermatozóide caprino, nas soluções de frutose, sacarose, citrato de sódio, cloreto de sódio e frutose-citrato de sódio, todas a 50mOsmol/Kg H2O e na água destilada (0mOsmol/Kg), em seus respectivos tempos de incubação, estão

expressos na Tab. 3.5.

Tabela 3.5 Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico em diferentes soluções e tempos de incubação (X±s)

SOLUÇÕES

50mOsmol/Kg H2O

INC (min)

AD* FRU SAC CIT CLO FCIT

0 70,20±14,88 - - -

15 72,50±10,32 77,50±6,45 74,90±10,98 82,30±4,29 76,10±12,23 75,10±5,76 30 67,80±15,13 76,00±8,90 72,20±14,76 79,90±6,26 77,20±12,99 78,80±5,55

X 70,17±13,29a 76,75±7,60ab 73,55±12,74ab 81,10±5,37b 76,65±12,29ab 76,95±5,82ab X= média; s = desvio-padrão; INC = tempo de incubação; AD = água destilada 0mOsmol/Kg; FRU = frutose; SAC = sacarose; CIT = citrato de sódio; CLO = cloreto de sódio; FCIT = frutose-citrato de sódio

ab

Letras diferentes na mesma linha (P<0,05) * 0mOsmol/Kg

Trabalhos de MELO et al. (2003) e ALVES et al. (2005b) demonstraram a possibilidade do uso da água destilada (AD) para o HOST no sêmen eqüino. Entretanto, a média geral da AD, para o sêmen caprino in natura, neste experimento, mostrou-se inferior (P<0,05) à média da solução de CIT a 50mOsmol/Kg H2O, com valores percentuais de 70,17±13,29e 81,10±5,37,

respectivamente. E embora, tenha se mostrado semelhante (P>0,05) às outras soluções, a AD apresentou o menor percentual médio de reação hiposmótica no espermatozóide caprino in

natura. Essa menor capacidade da AD foi observada por ALVES et al. (2005b) quando

analisaram o efeito da fixação com formol-salina tamponada, utilizada no presente experimento, sobre os percentuais de reação hiposmótica no espermatozóide eqüino. Esses autores observaram que a AD, quando não fixada, foi superior (P<0,05) às soluções de FRU e CIT, ambas a 100mOsmol/Kg H2O. Essa fixação, talvez explique porque, neste experimento,

a AD demonstrou o menor percentual médio de reação hiposmótica. Entretanto, a proporção de AD utilizada, também pode ter influenciado este resultado, afinal ALVES et al. (2005a), utilizando uma proporção de 1:10, observaram a superioridade da AD (P<0,05), além da não interferência da fixação (P>0,05); proporções de AD também foram comparadas por BORGES et al. (2005), onde a proporção de 1:15 mostrou-se superior às demais. Contudo, essas hipóteses, para o sêmen caprino in natura, devem ser testadas por meio de outros

experimentos, utilizando um maior número de repetições, ou delineadas para responder a essa questão.

NIE e WENZEL (2001) não observaram diferença estatística entre vários tempos de incubação, partindo de 15 minutos até os 180 minutos, assim como VAZQUEZ et al. (1997), também não a observaram em incubações variando de 30 a 120 minutos. Corroborando com os resultados encontrados por MELO et al. (2003) e por ALVES et al. (2005b), a ausência de diferença (P>0,05), no presente experimento, entre os tempos de incubação, dentro da solução, indicou a incubação por 15 minutos como satisfatória à reação hiposmótica do sêmen caprino in natura. Tendo, a solução de CIT o maior percentual numérico de reação hiposmótica (82,30%) dentre as soluções estudas nesta etapa.

3.3.4 Repetibilidade intra-ensaio

Os valores médios das características físicas e morfológicas do sêmen in natura dos quatros ejaculados utilizados na avaliação da repetibilidade intra-ensaio foram expressos nas Tab. 2. A proporção do desvio padrão em relação à média, em cada ejaculado, de cada um dos quatro reprodutores, representou a repetibilidade intra-ensaio por animal; a média dessas variações por animal representou a repetibilidade média intra-ensaio, que foi de 4,26%±1,68, variando de 2,58% a 6,02% nos bodes estudados (Tab. 3.6).

Tabela 3.6 Repetibilidade intra-ensaio do teste hiposmótico de cada ejaculado

HOST